專利名稱：一種重組人胱抑素c編碼基因與表達方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程領域，特別涉及一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法。
背景技術：
胱抑素C (cystatin C，Cys C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，1983年Anastasi等首次在雞蛋清中分離純化得到高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine proteinaseinhibitor,CPI)后被命名為胱抑素C,也被稱為Y- 微量蛋白及Y _后球蛋白，廣泛存在于各種組織的有核細胞和體液中，是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質，分子量為13. 3KD,由122個氨基酸殘基組成，可由機體所有有核細胞產生，產生率恒定。循環(huán)中的胱抑素C僅經腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的內源性標志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代謝分解，不返回血液，因此，其血中濃度由腎小球濾過決定，而不依賴任何外來因素，是一種反映腎小球濾過率變化的理想同源性標志物，可作為腎小球濾過功能指標，較目前常用的腎功能檢測項目有更高的靈敏度和特異性，其血清濃度測定是替代傳統的血尿素、肌酐(Cr)和內生肌酐清除率(Ccr)測定的首選腎功能評價指標。由于Cys C及其抗體的來源受限，現有檢測Cys C的試劑盒價格昂貴，妨礙了其在國內推廣應用。目前，通常采用PCR技術調取Cys C編碼基因，克隆后進行重組表達，但表達效率極低，難以滿足市場需要。為此我們重新設計了 Cys C的編碼基因，建立了重組CysC蛋白的制備體系，以期解決Cys C的來源問題，為CysC檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法。本發(fā)明所采取的技術方案為
一種重組人胱抑素C編碼基因，其核苷酸序列如下
5’ -atgcgtggttctcatcatcaccatcaccacgctggtatcgaaggtcgttcctctccaggtaaaccgccacgtctggttggcggtccaatgg
atgcatccgtggaagaggaaggcgttcgtcgtgcactggactttgctgttggcgagtacaacaaagcgtccaatgacatgtatcactctcgtgctctgcaagtggttcgcgcacgcaagcagatcgtagcaggtgtgaactactttctggacgtagagctgggtcgcaccacttgcaccaaaacccagccgaatctggacaactgtccgttccatgaccaaccgcacctgaaacgcaaggcgttctgctcctttcagatctatgctgtaccatggcaaggcaccatgactctgtccaagtctacctgtcaggatgcgtaa-3’ (SEQ ID NO:I)。重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟
1)將權利要求I所述的重組人胱抑素C編碼基因(目的基因)插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；
2)工程菌經發(fā)酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。
優(yōu)選的，步驟2)工程菌經發(fā)酵培養(yǎng)、IPTG誘導表達融合蛋白、收集菌體，破碎菌體，收集上清液，上清液經鎳層析柱純化，得重組人胱抑素C蛋白。優(yōu)選的，IPTG誘導表達融合蛋白的方法待發(fā)酵培養(yǎng)的菌液OD6tltlnm在0. 6 I. 0,加入終濃度0. I 10 mmol/L的IPTG，30 40°C培養(yǎng)2 10 h。優(yōu)選的，重組人胱抑素C蛋白的表達方法包括如下步驟
1)將目的基因的兩端加入酶切位點，進行全序列合成，得合成基因序列； 2)將合成基因序列克隆于T載體，測序確定成功構建重組T載體；
3)將目的基因從重組T載體上切下，插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；
4)工程菌經發(fā)酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。優(yōu)選的，目的基因兩端加入的酶切位點不相同。加上不同酶切位點要求在目的基因中不存在，同時是為了便與與載體相連，且使酶切的載體不會發(fā)生自身連接。優(yōu)選的，目的基因的序列內部不含有其兩端加入的酶切位點。優(yōu)選的，目的基因兩端加入的酶切位點與原核表達載體多克隆位點有相同的酶切位點，且酶切順序一致。優(yōu)選的，目的基因的5’端加入Nde I酶切位點，3’端加入EcoR I酶切位點；T載體為pMD18-T，原核表達載體為pET-22b (+);表達宿主菌為E. coli BL21 (DE3)。本發(fā)明一種重組人胱抑素C編碼基因的設計是根據人胱抑素C的氨基酸序列，按照大腸桿菌的偏好密碼子進行列表，根據密碼子列表組成的基因序列，進行酶切位點、GC含量等屬性分析，最后根據重組人胱抑素C的表達量，選擇了本發(fā)明所述的重組人胱抑素C的編碼基因。本發(fā)明一種重組人胱抑素C編碼基因的設計原理為一組密碼子對應唯一的氨基酸，部分同一個氨基酸可以由不同的密碼子編碼；同時每個物種都有一些偏好的密碼子，因此可以在不改變所編碼的氨基酸序列的情況下，通過調整物種偏好的密碼子來改進編碼基因的序列結構提聞編碼蛋白的效率。本發(fā)明首先利用大腸桿菌偏好的密碼子調整了編碼基因序列來提高目的蛋白在大腸桿菌中的表達效率，然后有根據基因序列對酶切位點、各核苷酸含量等進行了調整以便于基因工程操作。編碼基因序列的調整不僅可提高目的蛋白重組人Cys C的表達效率，還可方便構建過程中的基因工程操作，具有雙重作用。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明提供的重組人胱抑素C編碼基因，能表達人胱抑素C蛋白，操作方便，且由編碼基因表達的人胱抑素C蛋白，純度達90%以上，表達效率高，目前未見表達效率更好的報道。本發(fā)明純化方法，制備條件及載體種類選擇的限制少，表達載體的構建過程簡便。


圖I為重組質粒pET-CysC的酶切鑒定 圖2為IPTG誘導表達后菌體的蛋白檢測 圖3為IPTG誘導表達后菌體的Western blotting檢測 圖4為重組人胱抑素C蛋白親和純化的蛋白檢測圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限如此。實施例I
重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟
1)將目的基因(核苷酸序列為SEQID NO :1)的5’端加入Nde I酶切位點(catatg)，3’端加入EcoR I酶切位點(gaattc)，進行全序列合成，得合成基因序列；
2)將合成基因序列克隆于PMD18-T載體，測序確定成功構建重組T載體；
3)將測序正確的目的基因以NdeI和EcoR I內切酶從重組T載體上切下，純化得到目的基因，原核表達載體pET-22b(+)經相同的酶切處理，純化大片段的基因，并與雙酶切后得到的目的基因連接，轉入感受態(tài)細胞DH5 a，抽提質粒，得重組表達質粒pET-Cys C ；· 4)將重組表達質粒pET-CysC轉入感受態(tài)表達宿主菌E. coli BL21(DE3)中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含100 mg/L氨芐青霉素)上，37°C培養(yǎng)20 h，篩選出陽性克隆菌為工程菌；
5)將工程菌接種至LB培養(yǎng)液(含100mg/L氨芐青霉素)中，37°C培養(yǎng)，待菌液0D600nm在0. 8，加入終濃度I mmol/L的IPTG，37°C培養(yǎng)4 h，4°C離心分離得誘導表達上清液和菌體；
6)將菌體用BindingBuffer洗滌I次后，冰上超聲破菌，離心，收集上清液，將洗滌后的超聲破菌沉淀冰浴I h，充分溶解包涵體，離心，收集上清液，將兩次收集的上清液加入到鎳層析柱，依次加入Binding Buffer, Wash Buffer,最后Elute Buffer進行目的蛋白洗脫，收集Elute Buffer洗脫蛋白，得重組人胱抑素C蛋白，采用12% SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的純度。實施例2
重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟
1)將實施例I步驟3)得到的重組表達質粒pET-CysC轉入感受態(tài)表達宿主菌E. coliBL21(DE3)中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含100 mg/L氨芐青霉素)上，37°C培養(yǎng)16 h，篩選出陽性克隆菌為工程菌；
2)將工程菌接種至LB培養(yǎng)液(含100mg/L氨芐青霉素)中，37°C培養(yǎng)，待菌液OD6tltol在0. 6，加入終濃度0. I mmol/L的IPTG，37°C培養(yǎng)10 h，4°C離心分離得菌體；
3)同實施例I步驟6)。實施例3
重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟
1)將實施例I步驟3)得到的重組表達質粒pET-CysC轉入感受態(tài)表達宿主菌E. coliBL21(DE3)中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含100 mg/L氨芐青霉素)上，37°C培養(yǎng)24 h，篩選出陽性克隆菌為工程菌；
2)將工程菌接種至LB培養(yǎng)液(含100mg/L氨芐青霉素)中，37°C培養(yǎng)，待菌液OD6tltol在I. 0，加入終濃度10 mmol/L的IPTG，37°C培養(yǎng)2 h，4°C離心分離得菌體；
3)同實施例I步驟6)。對比例I將E. coli BL21(DE3)接種至LB培養(yǎng)液中，37 °C培養(yǎng)，待菌液0D600nm在0. 8，加入終濃度I mmol/L的IPTG，37°C培養(yǎng)4 h，4°C離心分離得菌體，該菌體為誘導后的E. coliBL21(DE3)。對比例2
將pET-22b(+)質粒轉入感受態(tài)表達宿主菌E. coli BL21(DE3)中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含100 mg/L氨芐青霉素)上，37°C培養(yǎng)20 h，篩選出陽性克隆菌為工程菌；將工程菌接種至LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)，待菌液0D600nm在0. 8，加入終濃度I mmol/L的IPTG，37°C培養(yǎng)4 h，4°C離心分離得菌體，該菌體為轉化pET-22b(+)的E. coli BL21(DE3)。將實施例I的表達重組質粒pET-Cys C分別采用I ) Nde I單酶切，2) EcoR I單酶切，3) Nde I和EcoR I雙酶切進行酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖見圖1，圖I中標注I為DNA marker,標注2為pET-Cys C經Nde I單酶切，標注3為pET-Cys C經EcoR I單酶切，標注3為pET-Cys C經Nde I和EcoR I雙酶切，得到目的條帶大小正確，證明Cys C基因正確克隆入pET-22b(+)載體，重組質粒結構正確。將重組質粒pET-Cys C進行測序，測序結果經blast序列比對，所編碼蛋白的氨基酸序列與人Cys C成熟肽完全一致。取實施例I步驟5)誘導得到的菌體(轉化pET-Cys C的E. coli BL21 (DE3))、對比例I誘導得到的菌體(誘導后的E. coli BL21 (DE3))與對比例2誘導得到的菌體(轉化pET-22b (+)的E. coli BL21 (DE3))三種菌體，分別采用12%SDS_PAGE電泳進行蛋白檢測，電泳檢測結果見圖2，圖2中，標注I為對比例I菌體，2為對比例2菌體，3和4為實施例I菌體,5為Marker,由圖可知,經誘導后轉化pET-Cys C的菌體較對照菌有一條明顯增粗的蛋白條帶，其相對分子質量為16kD左右(Cys C成熟肽約為12kD，再加上4kD左右的信號肽、切割位點和標簽多肽)，可見本發(fā)明方法誘導表達的蛋白為Cys C蛋白。上述實施例I步驟5)誘導得到的菌體、對比例I誘導得到的菌體與對比例2誘導得到的菌體，分別經SDS-PAGE后，分別用電轉移儀濕轉75伏，轉移2h轉移至PVDF膜上進行western檢測,脫脂奶粉封閉轉印膜,一抗為兔抗人Cys C多克隆抗體(I I 000), 二抗為羊抗兔HRP-IgG(l 3 000)，DAB為呈色底物。檢測結果見圖3，圖中，I為Marker，2為對比例I菌體,3為對比例2菌體，4為實施例I菌體，由圖可知，重組質粒誘導表達目的蛋白后能與相應Cys C抗體形成特異蛋白條帶，證明本發(fā)明誘導表達的蛋白是Cys C蛋白。將實施例I步驟5)得到的誘導表達上清液、步驟5)得到的菌體(即為包涵體)及步驟6)純化后的洗脫蛋白，分別采用12% SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的純度，SDS-PAGE電泳檢測結果見圖4,注1為Marker, 2為誘導表達上清液,3為包涵體，4、5和6為純化后的洗脫蛋白。由圖可知，步驟5)分離得到的誘導表達上清液不含有Cys C蛋白，而步驟5)分離得到的菌體則含有步驟5)分離得到的，可見目的蛋白以包涵體形式存在為主，本發(fā)明鎳層析柱親和層析純化后，純化產物為單一蛋白，目的蛋白經凝膠成像儀掃描顯示純度達90%以上(目前未見表達效率更好的文獻報道和公開專利)。
權利要求
1.一種重組人胱抑素C編碼基因，其核苷酸序列見SEQ ID N0:1。
2.重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟 1)將權利要求I所述的重組人胱抑素C編碼基因(目的基因)插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌； 2)工程菌經發(fā)酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。
3.根據權利要求2所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于步驟2)工程菌經發(fā)酵培養(yǎng)、IPTG誘導表達融合蛋白、收集菌體，破碎菌體，收集上清液，上清液經鎳層析柱純化，得重組人胱抑素C蛋白。
4.根據權利要求3所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于IPTG誘導表達融合蛋白的方法待發(fā)酵培養(yǎng)的菌液OD6tltol在O. 6 I. 0，加入終濃度O. I 10 mmol/L 的 IPTG，30 40°C培養(yǎng) 2 10 h。
5.根據權利要求2所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于該方法包括如下步驟 1)將目的基因的兩端加入酶切位點，進行全序列合成，得合成基因序列； 2)將合成基因序列克隆于T載體，測序確定成功構建重組T載體； 3)將目的基因從重組T載體上切下，插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌； 4)工程菌經發(fā)酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。
6.根據權利要求5所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在干目的基因兩端加入的酶切位點不相同。
7.根據權利要求5所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于目的基因的序列內部不含有其兩端加入的酶切位點。
8.根據權利要求5所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于目的基因兩端加入的酶切位點與原核表達載體多克隆位點有相同的酶切位點,且酶切順序一致。
9.根據權利要求5 8任一項所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于目的基因的5’端加入Nde I酶切位點，3’端加入EcoR I酶切位點；原核表達載體為pET-22b (+);表達宿主菌為 E. coli BL21 (DE3)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法，該編碼基因的核苷酸序列見SEQ ID NO1，重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括以下步驟將重組人胱抑素C編碼基因插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；工程菌經發(fā)酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。本發(fā)明提供的重組人胱抑素C編碼基因，能表達人胱抑素C蛋白，操作方便，且由編碼基因表達的人胱抑素C蛋白，純度達90%以上，表達效率高，目前未見表達效率更好的報道。
文檔編號C12N15/70GK102676533SQ20121015160
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權日2012年5月16日
發(fā)明者張宏斌 申請人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院