專利名稱：PTD-Apoptin融合蛋白原核分泌表達(dá)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域,具體地涉及一種PTD-Apoptin融合蛋白分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)今，腫瘤的治療仍是一項難題。因此，尋找并制備出對腫瘤細(xì)胞選擇性強(qiáng)、 作用性強(qiáng)的制劑是目前腫瘤治療藥物的研究方向。從雞貧血病毒中分離出的νρ 3基因 (Apoptin)可誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞等非正常細(xì)胞的凋亡作用，而對正常的二倍體細(xì)胞無作用。Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡不需要腫瘤抑制基因ρ53的表達(dá)，且不受凋亡因子 Bcl-2的抑制作用，顯示出了 Apoptin作為一種抗腫瘤制劑的應(yīng)用前景。為了使Apoptin有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，需要構(gòu)建具有穿膜能力的藥物分子。利用原核表達(dá)體系可獲得大量蛋白分子。然而，原核表達(dá)體系的胞質(zhì)表達(dá)多以包涵體形式存在， 包涵體屬變性蛋白，一般不具有活性，需要復(fù)性才能恢復(fù)活性，但是包涵體復(fù)性效率低，對于需求量大的蛋白往往達(dá)不到要求，而且包涵體復(fù)性時只有極少數(shù)蛋白折疊為天然狀態(tài)， 限制其活性。因此，避開包涵體復(fù)性過程，實現(xiàn)蛋白以有活性的可溶狀態(tài)表達(dá)，并大量分泌到雜蛋白種類和含量都少的大腸桿菌周質(zhì)空間中，這是現(xiàn)在亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并可以穿過細(xì)胞膜的融合蛋白 PTD-Apoptin,表達(dá)時以可溶狀態(tài)分泌到大腸桿菌的周質(zhì)空間中，保留了穿膜功能和特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡功能，無需復(fù)性，且融合蛋白分泌到周質(zhì)空間后，融合蛋白含量占周質(zhì)空間總蛋白的80%。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是=PTD-Apoptin融合蛋白的構(gòu)建方法如下
1)人工合成兩端帶有及聖7I和及^7 I粘性末端的PTD序列的正、負(fù)鏈，將正鏈和負(fù)鏈混合，制備成5’端帶有I、3’端帶有I粘性末端的PTD雙鏈序列；
2)將得到的PTD雙鏈序列插入到分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)飽BamHI /EcoR I位點，構(gòu)建出表達(dá)PTD的分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+) -PTD ；
3)擴(kuò)增Apoptin序列；
4)將Apoptin序列用I和I限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段插入到分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-PTD的及^7 I /Sal I位點，構(gòu)建出表達(dá)融合蛋白PTD-Apoptin的分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+)-PTD-Apoptin ；
5)將分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+) -PTD-Apoptin轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；
6)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)過夜，再將培養(yǎng)后的菌液以5%接種量接種于2 X YT培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到O. 6時，在20°C條件下用
I.2 mM IPTG誘導(dǎo)10h，之后4°C 6000rpm離心IOmin收集菌體細(xì)胞；7)將收集的菌體細(xì)胞重懸于含有20%的蔗糖、pH為8、濃度為30mM的30mLTris-HCl 中，加入PH為8，濃度為O. 5M的EDTA至EDTA終濃度為1禮，加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集細(xì)胞,去除上清液；
8)將收集的細(xì)胞重懸于30mL冰凍的濃度為5mM的MgSO4中，緩慢攪拌懸液IOmin ； 4°C 6000rpm離心10 min收集上清，即為PTD-Apoptin融合蛋白。按上述的方法獲得的PTD-Apoptin融合蛋白在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是①本發(fā)明采用人類免疫缺陷病毒(HIV-I)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)與Apoptin融合,有助于Apoptin跨膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。②本發(fā)明中，周質(zhì)、上清和沉淀中有大量的目的蛋白表達(dá)，由于大腸桿菌周質(zhì)空間中的雜蛋白含量少，目的蛋白含量大，有利于下游的分離純化。本發(fā)明優(yōu)化了表達(dá)條件，避開了包涵體復(fù)性過程，使目的蛋白以可溶狀態(tài)大量分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中。③本發(fā)明將PTD-Apoptin序列連接到含有信號肽序列的pET22b (+)載體上，構(gòu)建原核分泌表達(dá)載體pET22b (+) -PTD-Apoptin,經(jīng) IPTG誘導(dǎo)，將表達(dá)的目的蛋白分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中，滲透法提取周質(zhì)空間蛋白，剩余細(xì)胞組分經(jīng)超聲破碎后，分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。將周質(zhì)空間中PTD-Apoptin 融合蛋白與胃癌823細(xì)胞共、孵育，MTT法檢測融合蛋白對胃癌823細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示，重組PTD-Apoptin蛋白可以分泌至大腸桿菌周質(zhì)空間中，且以可溶狀態(tài)存在，對胃癌 823細(xì)胞的最大抑制率為82. 95%。分泌表達(dá)的重組PTD-Apoptin蛋白具有生物活性。本發(fā)明所構(gòu)建的具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可以穿過細(xì)胞膜的融合蛋白，表達(dá)時以可溶狀態(tài)分泌到大腸桿菌的周質(zhì)空間中，保留了穿膜功能和特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡功能，無需復(fù)性，且融合蛋白分泌到周質(zhì)空間后，融合蛋白含量占周質(zhì)空間總蛋白的80%，雜蛋白含量極少。


圖I是分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+) -PTD的構(gòu)建過程示意圖。圖2是分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-PTD-Apoptin的構(gòu)建過程示意圖。圖3是PTD雙鏈電泳圖中，M DL2000 Marker ；1 PTD 雙鏈。圖4是pET22b (+) -PTD質(zhì)粒電泳圖中，M :DL10000 Marker ；1 :pET22b (+)-PTD 質(zhì)粒；2 :pET22b (+)-PTD 質(zhì)粒。圖5是Apoptin基因PCR產(chǎn)物電泳圖中，M DL2000 Marker ；1 :對照組；2 :擴(kuò)增產(chǎn)物。圖6是pET22b (+) -PTD-Apoptin重組質(zhì)粒PCR驗證電泳圖中，M DL2000 Marker ；1 :重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :對照組。圖7是pET22b(+)-PTD-Apoptin重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖中，M DL10000 Marker ；1 :重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；2 :重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。圖8 是 PTD-Apoptin 表達(dá)的 SDS-PAGE 檢測；
圖中，I :pET22b(+)-PTD-Apoptin 未誘導(dǎo)對照組上清；2 :pET22b (+)-PTD-Apoptin 未誘導(dǎo)對照組沉淀；3 :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；4 pET22b (+) -PTD-Apoptin:誘導(dǎo)時間為IOh的周質(zhì)； 5 :pET22b(+)-PTD-Apoptin 誘導(dǎo)時間為 IOh 的上清；6 :pET22b (+)-PTD-Apoptin 誘導(dǎo)時間為IOh的沉淀。圖9是48h時不同濃度PTD-Apoptin融合蛋白對胃癌823細(xì)胞的抑制作用。
具體實施例方式實施例I PTD-Apoptin融合蛋白的構(gòu)建與分泌表達(dá)方法 (一)材料與方法
1、材料T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及麗YI ,EcoR I和I、質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)、MTT (噻唑藍(lán))、DMSO (二甲基亞砜)購自SIGMA。2、方法
2.I PTD序列制備
根據(jù)弓I物設(shè)計的方法人工合成PTD序列，在PTD序列正鏈5 ’端引入酶切位點BamH I 的部分識別位點，3’端引入I的部分識別位點；在PTD序列負(fù)鏈5’端引入酶切位點 EcoR I的部分識別位點，3’端引入I的部分識別位點。退火形成鏈條鏈后，所引入的限制性內(nèi)切酶識別位點會形成粘性末端。將人工合成的含有及 # I和I粘性末端的正鏈和負(fù)鏈混合，95°C 5min，然后自然降溫至室溫，使正負(fù)兩條鏈退火結(jié)合，制備成PTD雙鏈序列。2. 2 pET22b (+) -PTD 的構(gòu)建
將原核分泌表達(dá)載體pET22b(+)分別用及_7 I和及^7 I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行分步酶切，酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段與人工合成的PTD序列16°C連接過夜，構(gòu)建質(zhì)粒pET22b (+) -PTD。2. 3 Apoptin 基因的 PCR 擴(kuò)增
根據(jù)Apoptin基因的核苷酸序列設(shè)計2條引物。上、下游引物的5’端分別引入酶切位自、EcoR I ,Sal I和保護(hù)堿基。
上游引物為5’ -CGGAATTCGATGAACGCTCTCC-3’
下游引物為 5’ -GCGTCGACTTACAGTCTPTDACGCCTT-3，
以質(zhì)粒pET30a-Apoptin為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到Apoptin全序列。PCR擴(kuò)增條件為 940C 5min 預(yù)變性，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，共 30 個循環(huán)，72°C延伸 10 分鐘。2.4 PTD-Apoptin原核分泌表達(dá)載體的構(gòu)建
將原核分泌表達(dá)載體pET22b(+)-PTD分別用及^7 I和I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行分步酶切，酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段與Apoptin基因16°C連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b(+)-PTD-Apoptin。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化疋coli DH5 α菌株，挑取陽性克隆搖瓶培養(yǎng)，保存菌種并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗證與及麗Y I ,Sal I酶切驗證。將PCR 與酶切驗證正確的陽性質(zhì)粒送上海生工生物公司進(jìn)行核酸序列測定。2.5 PTD-Apoptin融合基因的原核分泌表達(dá)誘導(dǎo)與鑒定
將測序正確的原核分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-PTD-Apoptin轉(zhuǎn)化疋coli BL21 (DE3)菌株，將陽性分泌表達(dá)菌株接種于含Amp的LB的液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)后的菌液以5%的接種量接種于含Amp的2XYT的液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為O. 6，加IPTG 至終濃度為I. 2mM，20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。在同等條件下以未誘導(dǎo)pET22b (+)-PTD-Apoptin做對照。6000rpm離心lOmin，收集菌體細(xì)胞。2.6周質(zhì)組分蛋白提取
將收集的菌體細(xì)胞重懸于含有20%的蔗糖、pH為8、濃度為30mM的30mL Tris-HCl中， 加入pH為8，濃度為O. 5M的EDTA至EDTA終濃度為ImM，加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集細(xì)胞，去除上清液。將收集的細(xì)胞重懸于3OmL冰凍的濃度為5 mM的MgSO4中，緩慢攪拌懸液IOmin ;4°C 6000rpm離心10 min收集上清，SP 為PTD-Apoptin融合蛋白。2. 7 MTT法檢測胃癌細(xì)胞的凋亡率
將對數(shù)生長期的胃癌823細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種約5 X IO3細(xì)胞O. ImL, 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 12小時。細(xì)胞貼壁后且鋪板率約70°/Γ80%時，分別加入含有 PTD-Apoptin蛋白濃度為9. 375 μ g/mL和11. 25 μ g/mL的樣品，每一濃度設(shè)3個平行組，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。每孔加入5mg/mL 的MTT ΙΟμ ，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3h，孵育結(jié)束后吸出上清，然后每孔加入ΙΟΟμ DMSO (二甲基亞砜)5 lOmin，溶解紫色結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測定490nm處吸光值。計算細(xì)胞抑制率，并以蛋白不同濃度和細(xì)胞抑制率作圖。細(xì)胞抑制率=1 —[(實驗組OD平均值-背景組OD平均值)/ (空白對照組OD平均值-背景組OD平均值)]X 100%。(二)結(jié)果 I. PTD序列制備
將人工合成的含有及 # I和及^7 I粘性末端的正負(fù)鏈混合，95°C 5min，然后自然降溫至室溫，使正負(fù)兩條鏈退火結(jié)合，結(jié)果見圖3，由圖3可以看出，在IOObp以下約30bp處有目的條帶，說明PTD雙鏈合成成功。2. pET22b(+)-PTD 的構(gòu)建
將原核分泌表達(dá)載體pET22b(+)分別用及_7 I和及^7 I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行分步酶切，酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段與人工合成的PTD序列16°C連接過夜，構(gòu)建質(zhì)粒pET22b(+)-PTD，結(jié)果見圖4，由圖4可見，在4000bp附近出現(xiàn)條帶，說明 pET22b (+) -PTD 構(gòu)建成功。3. Apoptin基因的猶得
以質(zhì)粒pET30a-Aptptin為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5，從圖5可見，目的條帶 Apoptin小片段出現(xiàn)在250-500bp之間，而對照組無目的條帶出現(xiàn)，說明PCR擴(kuò)增成功得到 Apoptin 基因。4. PTD-Apoptin原核分泌表達(dá)載體的驗證
將回收后的PCR產(chǎn)物與原核分泌表達(dá)載體pET22b(+)分別用及 " I和fel I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將回收的酶切片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b (+) -PTD-Apoptin,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌；挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR與酶切驗證，結(jié)果見圖6和圖7。從圖6和圖7可見，在250-500bp之間出現(xiàn)目的條帶，說明原核分泌表達(dá)載體 pET22b (+) -PTD-Apoptin 構(gòu)建成功。5. PTD-Apoptin 融合基因在 E. coli BL21 (DE3)菌株中的表達(dá)
將測序結(jié)果正確的原核分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+) -PTD-Apoptin轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，以終濃度為1.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，20°C誘導(dǎo)10h，在同等條件下以未誘導(dǎo) pET22b (+) -PTD-Apoptin做對照。離心，收集菌體，獲得周質(zhì)組分，超聲破碎剩余組分，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果見圖8。由圖8可見，周質(zhì)、上清和沉淀在20KDa處有條帶，符合預(yù)期分子量，對照組在預(yù)期分子量處無條帶，說明融合蛋白成功表達(dá)并分泌至大腸桿菌周質(zhì)空間中。6. MTT法檢測胃癌823細(xì)胞的抑制率
加入PTD-Apoptin融合蛋白孵育24h后，通過熒光顯微鏡觀察，與對照組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明加入融合蛋白對細(xì)胞增長有抑制作用。繼續(xù)孵育至48h后觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生皺縮，加入MTT后孵育3h，DMSO溶解紫色結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測定0D·，分析數(shù)據(jù)后得出 隨著加入融合蛋白濃度的升高，細(xì)胞存活率越低。孵育48h后IC5tl約為279Pg/mL。與對照組相比，不同濃度的融合蛋白對胃癌細(xì)胞均有顯著的抑制作用0° < O. 01)。胃癌細(xì)胞與融合蛋白孵育48h后，最大抑制率為82. 95%，結(jié)果見表I和圖9。表I 48h時不同濃度PTD-Apoptin融合蛋白對胃癌823細(xì)胞的抑制作用
權(quán)利要求
1.PTD-Apoptin融合蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于方法如下 1)人工合成兩端帶有及聖7I和及^7 I粘性末端的PTD序列的正、負(fù)鏈，將正鏈和負(fù)鏈混合，制備成5’端帶有I、3’端帶有I粘性末端的PTD雙鏈序列； 2)將得到的PTD雙鏈序列插入到分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)飽BamHI /EcoR I位點，構(gòu)建出表達(dá)PTD的分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+) -PTD ； 3)擴(kuò)增Apoptin序列； 4)將Apoptin序列用I和I限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段插入到分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-PTD的及^7 I /Sal I位點，構(gòu)建出表達(dá)融合蛋白PTD-Apoptin的分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+)-PTD-Apoptin ； 5)將分泌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+) -PTD-Apoptin轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌； 6)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)過夜，再將培養(yǎng)后的菌液以5%接種量接種于2 X YT培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到O. 6時，在20°C條件下用I.2 mM IPTG誘導(dǎo)10h，之后4°C 6000rpm離心lOmin，收集菌體細(xì)胞； 7)將收集的菌體細(xì)胞重懸于含有20%的蔗糖、pH為8、濃度為30mM的30mLTris-HCl中，加入PH為8，濃度為O. 5M的EDTA至EDTA終濃度為1禮，加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集細(xì)胞,去除上清液； 8)將收集的細(xì)胞重懸于30mL冰凍的濃度為5mM的MgSO4中，緩慢攪拌懸液IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集上清，即為PTD-Apoptin融合蛋白。
2.按照權(quán)利要求I所述的方法獲得的PTD-Apoptin融合蛋白在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及PTD-Apoptin融合蛋白的分泌表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。將PTD-Apoptin序列連接到pET22b(+)分泌表達(dá)載體上，構(gòu)建原核分泌表達(dá)載體pET22b(+)-PTD-Apoptin，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，將表達(dá)的目的蛋白分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中，滲透法提取周質(zhì)空間蛋白，剩余細(xì)胞組分經(jīng)超聲破碎后，分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。將周質(zhì)空間中PTD-Apoptin融合蛋白與胃癌823細(xì)胞共孵育，MTT法檢測融合蛋白對胃癌823細(xì)胞的抑制作用。采用本發(fā)明的方法重組PTD-Apoptin蛋白可以分泌至大腸桿菌周質(zhì)空間中，且以可溶狀態(tài)存在，分泌表達(dá)的重組PTD-Apoptin蛋白具有生物活性，對胃癌823細(xì)胞的最大抑制率為82.95%。
文檔編號C12N15/70GK102703489SQ201210158339
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者劉雪梅, 崔劍, 李其久, 賁松彬, 陳長蘭 申請人:遼寧大學(xué)