專利名稱：同時(shí)檢測水環(huán)境中三種主要手足口病病毒的定性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測水環(huán)境中三種主要手足口病病毒的定性檢測方法，該方法根據(jù)手足口病病毒RNA的保守序列設(shè)計(jì)通用引物，利用巢式PCR檢測手足口病病毒，適用于水環(huán)境中的手足口病病毒的快速檢測。
背景技術(shù)：
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)是以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到互補(bǔ)DNA (cDNA)的第一條鏈，再以該cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，由此可將極微量的RNA在數(shù)小時(shí)內(nèi)以幾何倍數(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。半巢式PCR (semi-nested PCR)技術(shù)是一種變異的PCR技術(shù)，其通過使用一對半PCR引物完成核酸片段的擴(kuò)增。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為半巢式引物(因其一條引物與第一對PCR引物中的一條完全 相同，但另外一條引物在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。半巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低；且通過兩次PCR擴(kuò)增后，其檢測靈敏度大大提高。因此，半巢式PCR的擴(kuò)增非常特異，且靈敏度很好?，F(xiàn)有的關(guān)于水環(huán)境中進(jìn)行手足口病病毒PCR檢測的方法很少，大多是基于腸道病毒通用引物定性或定量RT-PCR檢測技術(shù)，但由于腸道病毒屬的病毒血清型繁多，致病類型各異，存在無法快速準(zhǔn)確確定致病病原體、靈敏度不夠高、受雜質(zhì)干擾影響較大的缺點(diǎn)。雖然巢式PCR技術(shù)已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的微生物檢測，但并不能滿足水環(huán)境監(jiān)測的需要，因此目前還沒有一套適用于水環(huán)境中手足口病病毒同時(shí)快速檢測的有效方法
發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種水環(huán)境中手足口病主要致病病毒一腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒AlO型(CVAlO)、柯薩奇病毒A16型(CVA16)的定性檢測方法，以解決水環(huán)境中手足口病病毒的同時(shí)定性檢測的問題，并提高檢測的靈敏度和特異性。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種同時(shí)檢測水環(huán)境中手足口病三種主要病毒的定性檢測方法，其特征在于，包括下列步驟步驟一，手足口病三種主要病毒(EV71、CVAlO、CVA16)半巢式PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)手足口病三種主要病毒(EV71、CVAlO, CVA16)RNA在5’非編碼區(qū)到病毒蛋白衣殼編碼區(qū)VP2這一段核酸的保守性，設(shè)計(jì)手足口病三種主要病毒的半巢式PCR引物，同時(shí)由于該引物可擴(kuò)增完整的病毒蛋白衣殼編碼區(qū)VP4，也可為后續(xù)進(jìn)一步基因分型奠定基礎(chǔ)；所述的手足口病三種主要病原體(EV71、CVAlO, CVA16)半巢式PCR引物包括第一輪PCR上游引物546F、第二輪PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中，第一輪PCR上游引物546F的核苷酸序列為5 ' -CGGAACCGACTACTTTGG-3 ';第二輪PCR上游引物592F的核苷酸序列為5' -TGGCTGCTTATGGTGACA-3';下游引物1090R的核苷酸序列為5' -GCARTASKMRGGCCAYTC-3' (R=A/G ； S=G/C ；K=G/T ；M=A/C ；Y=C/T )。步驟二，對設(shè)計(jì)引物的特異性進(jìn)行檢測用EV71、CVAlO、CVA16三種目標(biāo)病毒及柯薩奇病毒B4型(CVB4)、脊髓灰質(zhì)炎病毒I型(PVl)兩種非目標(biāo)病毒進(jìn)行引物特異性檢測；I) RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ；2 )去除基因組 DNA :將 5 ii L 的 RNA 和 2 ii L 的 5 X g DNA Eraser Buffer 混勻，加入IuL的g DNA Eraser,并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 ii L,42°C水浴2min,以去除體系內(nèi) DNA對RNA的干擾；3)逆轉(zhuǎn)錄向上述反應(yīng)液加入 4 u L 5 X PrimeScript buffer, IuL PrimeScpriptRT Enzyme Mix IjIuL RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至 20 u L, 37°C水浴 15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C 5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板；4)半巢式PCR擴(kuò)增第一輪PCR:取 2. 5 ii L 的 IOXEx Taq Buffer，2 ii L 的 dNTP Mixture，10 ii mol/L 的上游引物546F和10 ii mol/L的下游引物1090R # IuLjEx Taq酶2U，加入模板cDNA2 u L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 u L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪PCR :取 2. 5 ii L 的 IOXEx Taq Buffer,2u L dNTP Mixture，10 ii mol/L 上游引物592F和10iimol/L下游引物1090R各I ii L，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物2 ii L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 ii L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為①95°C 預(yù)變性 5min ；②擴(kuò)增循環(huán)35 次95°C,30s ；56°C,30s ；72°C,60s ；③72°C 延伸 5min，4°C 冷卻；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測配置I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測。步驟三，對設(shè)計(jì)引物的靈敏度進(jìn)行檢測用EV71、CVA10、CVA16三種目標(biāo)病毒進(jìn)行引物靈敏度檢測；I) RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ；2)去除基因組 DNA :將 5 ii L RNA 和 2yL 5Xg DNA Eraser Buffer 混勻，加入 I y Lg DNA Eraser,并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 u L，42°C水浴2min，以去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾；3)逆轉(zhuǎn)錄向上述反應(yīng)液加入 4 u L 5 X PrimeScript buffer, IuL PrimeScpriptRT Enzyme Mix IjIuL RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至 20 u L, 37°C水浴 15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板；4)將所得cDNA定量后進(jìn)行十倍梯度稀釋，稀釋范圍10°至IO5拷貝，作為模板備用；5)PCR 擴(kuò)增取 2. L 的 IOXEx Taq Buffer，2 ii L 的 dNTP Mixture, 10 U mol/L的上游引物546F和10iimol/L的下游引物1090R各I ii L，Ex Taq酶2U，向每個(gè)PCR管中分別加入各稀釋梯度的模板cDNA2 u L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 u L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為①95°C 預(yù)變性 5min ；②擴(kuò)增循環(huán)35 次95V，30s ；56°C，30s ；72°C, 60s ；③72°C 延伸 5min，4°C 冷卻；6)瓊脂糖凝膠電泳檢測配置I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測。
步驟四，水環(huán)境樣品的定性檢測I)樣品米集在水面下0. 3m處取水樣，水樣米集后放入4 C冰箱內(nèi)保存；2)病毒濃縮將含有腸道病毒的水樣加入聚乙二醇(PEG)6000及NaCl至濃度分別為 8% (vol/vol)與 2. 3% (wt/vol),于 4°C,80rpm 過夜攪拌混勻，約 12h 后，于 9，OOOXg,4°C離心30min，收集沉淀，將沉淀用ImL超純水吹打混勻；3 ) RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ；4)去除基因組 DNA :將 5 ii L RNA 和 2yL 5Xg DNA Eraser Buffer 混勻，加入 I y Lg DNA Eraser,并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 u L，42°C水浴2min，以去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾；5)逆轉(zhuǎn)錄向上述反應(yīng)液加入 4 u L 5 X PrimeScript buffer, IuL PrimeScpriptRT Enzyme Mix IjIuL RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至 20 u L, 37°C水浴 15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板；6)半巢式PCR擴(kuò)增第一輪PCR :取 2. 5 ii L IOXEx Taq Buffer,2u L dNTP Mixture，10 ii mol/L 上游引物546F和10iimol/L下游引物1090R各I y L，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2 y L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 u L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪PCR :取 2. 5 ii L IOXEx Taq Buffer,2u L dNTP Mixture，10 ii mol/L 上游引物592F和10iimol/L下游引物1090R各I ii L，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物L(fēng)，用無菌超純水補(bǔ)足至25ii L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為①95°C 預(yù)變性 5min ；②擴(kuò)增循環(huán)35 次95V，30s ；56°C，30s ；72°C, 60s ；③72°C 延伸 5min，4°C 冷卻；7)瓊脂糖凝膠電泳檢測配置I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測。本發(fā)明的檢測方法由于采用了半巢式PCR，大幅度提高了水環(huán)境中手足口病病毒RT-PCR檢測技術(shù)的靈敏度，具有良好的特異性，同時(shí)對三種主要手足口病病毒進(jìn)行特異性檢測，也縮短了排查篩選手足口病病原體時(shí)間，與環(huán)境中常見的其他病原微生物沒有交叉反應(yīng)。與現(xiàn)有的水環(huán)境中手足口病病毒定性RT-PCR檢測技術(shù)相比較，具有以下顯著的優(yōu)
占-
y \\\
(I)良好的特異性所設(shè)計(jì)的手足ロ病三種主要病毒同時(shí)檢測的半巢式PCR引物經(jīng)特異性實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有較好的特異性，與環(huán)境中常見的其他病原微生物沒有交叉反應(yīng)。( 2)靈敏度大幅度提高 現(xiàn)有的環(huán)境水體中病毒定性RT-PCR —般采用普通PCR，或者定量PCR反應(yīng)，但是經(jīng)過連續(xù)兩次成幾何倍數(shù)的半巢式PCR擴(kuò)增，靈敏度大幅提高。(3)耗時(shí)短以往的水環(huán)境中病毒檢測多見于腸道病毒通用引物的檢測，若需進(jìn)行血清型區(qū)分，則需進(jìn)行較為復(fù)雜的分析；本發(fā)明所采用的方法可直接進(jìn)行水樣中手足ロ病三種主要病毒的檢測，縮短了腸道病毒血清型的排查時(shí)間。且若通過后續(xù)克隆連接轉(zhuǎn)化，可通過擴(kuò)增的蛋白質(zhì)衣殼編碼區(qū)VP4直接進(jìn)行型別分析鑒定?！?br>

圖I是設(shè)計(jì)引物特異性及靈敏性的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中(A)特異性檢測(IO5 拷貝 /PCR 反應(yīng))M :marker ；1 CVA10 ；2 CVA16 ；3 EV71 ；4 CVB4 ；5 PV1 ;N :陰性對照。(B), (C)和(D)分別是針對CVA10，CVA16與EV71的cDNA進(jìn)行靈敏度檢測M :marker ；Γ6 :10倍梯度稀釋病毒cDNA (IO5至10°拷貝/PCR反應(yīng))；N :陰性對照。圖2是該方法應(yīng)用于某污水廠進(jìn)水及ニ級處理水(未消毒)的半巢式PCR檢測結(jié)
果O以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式按照本發(fā)明的技術(shù)方案，首先根據(jù)手足ロ病三種主要病毒(EV71、CVAlO, CVA16)RNA在5’非編碼區(qū)到病毒蛋白衣殼編碼區(qū)VP2這ー區(qū)域核酸的保守性，設(shè)計(jì)手足ロ病三種主要病毒的半巢式PCR引物。所述的手足ロ病三種主要病原體(EV71、CVAlO、CVA16)半巢式PCR引物包括第一輪PCR上游引物546F、第二輪PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中，第一輪PCR上游引物546F的核苷酸序列為5' -CGGAACCGACTACTTTGG-3';第二輪PCR上游引物592F的核苷酸序列為5' -TGGCTGCTTATGGTGACA-3';下游引物1090R的序列為5' -GCARTASKMRGGCCAYTC-3' (R=A/G ；S=G/C ；K=G/T ；M=A/C ;Y=C/T)。經(jīng)過在 GenBank 數(shù)據(jù)庫上比對分析，與該手足ロ病三種主要病毒通用引物具有高度相似性的序列都來源于腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒AlO型(CVA10)、柯薩奇病毒A16型(CVA16)，未發(fā)現(xiàn)相似性較高的其他微生物序列。以下是發(fā)明人給出的具體實(shí)施例。I、設(shè)備和試劑( I)高速冷凍離心機(jī)；(2)離心管；(3)4で冰箱；(4)磁力攪拌器；
(4)金屬浴；(5)定性 PCR 儀；(6)紫外凝膠成像儀；(7)聚こニ醇(PEG)，分子量 6000 ;(8) NaCl;(9)病毒RNA提取試劑盒；(10)去除基因組DNA試劑盒；
(11)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；(12)定性PCR試劑盒；(12)手足ロ病三種主要病原體(EV71、CVAlO, CVA16)半巢式PCR引物，包括第一輪PCR上游引物546F、第二輪PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中，第一輪PCR上游引物546F的核苷酸序列為5 ^ -CGGAACCGACTACTTTGG-3 ';第二輪PCR上游引物592F的核苷酸序列為5' -TGGCTGCTTATGGTGACA-3 ';下游引物1090R的序列為5' -GCARTASKMRGGCCAYTC-3'。第一輪PCR擴(kuò)增片段約為545bp，第二輪PCR擴(kuò)增片段約為500bp，引物均由專業(yè)生物工程公司合成。2、測定程序(I)樣品采集在水面下O. 3m處取水樣250mL，水樣采集后立即放入4°C冰盒內(nèi)保存，6h內(nèi)進(jìn)行檢測。(2)病毒的濃縮將含有腸道病毒的水樣加入聚こニ醇(PEG) 6000及NaCl至濃度分別為8% (vol/vol)與2. 3% (wt/vol),于4°C,80rpm過夜攪拌混勻，約12 14h后，于9，000Xg，4°C離心30min，收集沉淀，將沉淀用ImL超純水吹打混勻；3) RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病韋RNA ；(3)去除基因組 DNA :將 5μ L RNA 和 2 μ L 5Xg DNA Eraser Buffer 混勻，加入
Iμ L g DNA Eraser，并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 μ L，42°C水浴2min，去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾，得到反應(yīng)液；(4)逆轉(zhuǎn)錄向反應(yīng)液中加入 4 μ L 5 XPrimeScript buffer, I μ L PrimeScpriptRT Enzyme Mix I, I μ L RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至 20 μ L, 37°C水浴 15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板；(5)半巢式PCR擴(kuò)增第一輪PCR :取 2· 5μ L IOXEx Taq Buffer,2y L dNTP Mixture，10 μ mol/L 上游引物546F和ΙΟμπιοΙ/L下游引物1090R各lyL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪PCR :取 2· 5μ L IOXEx Taq Buffer,2y L dNTP Mixture，10 μ mol/L 上游引物592F和10 μ mol/L下游引物1090R各lyL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為①95°C 預(yù)變性 5min ；②擴(kuò)增循環(huán)35 次95°C，30s ；56°C，30s ；72°C, 60s ；
③72°C 延伸 5min，4°C 冷卻；(6)瓊脂糖凝膠電泳檢測配置I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測。 通過引物特異性和靈敏度檢測，如圖I所示，證明所設(shè)計(jì)引物特異性良好，靈敏度較高；將該方法應(yīng)用于某污水廠進(jìn)水及ニ級處理水(未消毒)的手足ロ病三種主要病毒的定性檢測，如圖2所示，三種手足ロ病病毒的檢出呈現(xiàn)一定的季節(jié)變化規(guī)律，且經(jīng)基因序列分析表明，陽性樣品均為所檢測目標(biāo)病毒。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測水環(huán)境中手足口病三種主要病毒的定性檢測方法，其特征在于，按下列步驟進(jìn)行 步驟一，手足口病三種主要病毒化￥71、0^10、0^16)半巢式PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)手足口病三種主要病毒化￥71、0^10、0^16)1 應(yīng)在5’非編碼區(qū)到病毒蛋白衣殼編碼區(qū)VP2這一段核酸的保守性，設(shè)計(jì)手足口病三種主要病毒的半巢式PCR引物，同時(shí)由于該引物可擴(kuò)增完整的病毒蛋白衣殼編碼區(qū)VP4，也可為后續(xù)進(jìn)一步基因分型奠定基礎(chǔ)； 所述的手足口病三種主要病原體(EV71、CVA10、CVA16)半巢式PCR引物包括第一輪PCR上游引物546F、第二輪PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中 第一輪PCR上游引物546F的核苷酸序列為5, -CGGAACCGACTACTTTGG-3;； 第二輪PCR上游引物592F的核苷酸序列為5' -TGGCTGCTTATGGTGACA-3'； 下游引物 1090R 的序列為5' -GCARTASKMRGGCCAYTC-3' (R=A/G ；S=G/C ；K=G/T ；M=A/C ;Y=C/T)。
步驟二，水環(huán)境樣品的定性檢測 1)樣品采集在水面下0.3m處取水樣，水樣采集后放入4°C冰箱內(nèi)保存； 2)病毒濃縮將含有腸道病毒的水樣加入聚乙二醇(PEG)6000及NaCl至濃度分別為8% (vol/vol)與 2. 3% (wt/vol)，于 4°C，80rpm 過夜攪拌混勻，約 12h 后，于 9，000Xg,4°C離心30min,收集沉淀,將沉淀用ImL超純水吹打混勻； 3)RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ； 4)去除基因組DNA -M 5 Vi L RNA 和 2 ii L 5Xg DNA Eraser Buffer 混勻，加入 IuLgDNA Eraser，并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至IOy L，42°C水浴2min，去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾，得到反應(yīng)液； 5)逆轉(zhuǎn)錄向反應(yīng)液中加入4 u L 5 XPrimeScript buffer, IuL PrimeScpript RTEnzyme Mix IjIuL RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至20 u L, 37°C水浴15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板； 6)半巢式PCR擴(kuò)增第一輪 PCR :取 2. 5 ii L IOXEx Taq Buffer,2u L dNTP Mixture，10 y mol/L 上游引物546F和10iimol/L下游引物1090R各lyL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2 y L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 u L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪 PCR :取 2. 5 ii L IOXEx Taq Buffer,2u L dNTP Mixture，10 y mol/L 上游引物592F和10iimol/L下游引物1090R各I y L，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物2 u L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 u L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為 ①95°C預(yù)變性5min；②擴(kuò)增循環(huán)35 次95°C,30s ；56°C, 30s ；72°C,60s ； ③72°C延伸5min，4°C冷卻； 7)瓊脂糖凝膠電泳檢測配置I.5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水環(huán)境中手足口病三種主要病毒(EV71、CVA10、CVA16)同時(shí)定性檢測方法，該方法根據(jù)手足口病三種主要病毒(EV71、CVA10、CVA16)RNA在5’非編碼區(qū)到病毒蛋白衣殼編碼區(qū)VP2這一段核酸的保守性，設(shè)計(jì)手足口病三種主要病毒的半巢式PCR引物。建立了運(yùn)用該半巢式PCR引物的進(jìn)行水環(huán)境中手足口病病毒的定性PCR檢測方法。該方法特異性好、靈敏度高，且可為后續(xù)基因分型奠定良好基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/93GK102676700SQ20121015830
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者三浦尚之, 佐野大輔, 吉錚, 張崇淼, 王曉昌 申請人:西安建筑科技大學(xué)