人cdkl3基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人CDKL3基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開了人CDKL3基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人CDKL3基因小分子干擾RNA、人CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體、人CDKL3基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人CDKL3基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中CDKL3基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人CDKL3基因的用途及其相關(guān)藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及人⑶KL3基因的用途及其相關(guān)藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]RNA干擾(RNA interference, RNAi)即用核苷酸組成的短的雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默。它可高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，導(dǎo)致其降解，從而引起生物體內(nèi)特異基因的沉默，使細(xì)胞表現(xiàn)出某種基因表型的缺失，是近年來新興的一種常用的研究基因功能、尋找疾病治療方法的實驗室技術(shù)。研究表明，長度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to23 nucleotide intervals.Cell 2000:101:25-33.)。腫瘤患者雖經(jīng)化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對腫瘤發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)的基因進(jìn)行干預(yù)，將能為腫瘤的治療開辟新途徑。近年來，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術(shù)可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、抗凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)來抑制腫瘤進(jìn)程(Uprichard, Susan LThe therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。
[0003]CDKL3是類似于有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族和細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)家族的絲氨酸蛋白激酶(Yee KW, Moore SJj Midmer Mj Zanke BW, Tong Fj HedleyD，Minden MD.NKIAMREj a novel conserved CDC2_related kinase with features ofboth mitogen-activated protein kinases and cyc-1in-dependent kinases.BiochemBiophys Res Commun 2003，308:784-792.Hanks SK，Quinn AM, Hunter T.The proteinkinase family:con-served features and deduced phylogeny of the catalyticdomains.Science 1988，241:42-52.)，這兩大家族都參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞遷移和細(xì)胞存活等生理過程(Miyata Y，Nishida E.Distantly related cousins of MAPkinase!biochemical properties and possible physiological functions.BiochemBiophys Res Commun 1999，266:291-295.)?
[0004]CDKL3 (eye I in-dependent kinase-like 3)基因編碼一條由 455 個氛基酸組成的多肽，又命名為NKIAMRE，定位于細(xì)胞質(zhì)中，被認(rèn)為是RNA聚合酶C末端磷酸化激酶復(fù)合物的一個組成成分(Yee KW, Moore SJj Midmer Mj Zanke BW, Tong Fj HedleyD，Minden MD.NKIAMRE,a novel conserved CDC2_related kinase with featuresof both mitogen-activated protein kinases and cyc-1in-dependent kinases.Biochem Biophys Res Commun 2003;308:784-792.Midmer M，Haq Rj Squire JA，ZankeBW.1dentification of NK1-AMREj the human homologue to the mitogen-activatedpro-tein kinase-/cyclin-dependent kinase-related protein kinase NKIATRE，andits loss in leukemic blasts with chromosome arm 5q deletion.Cancer Res1999;59:4069-4074.)。正如基因名所示，CDKL3 在序列上和 CDK3 (cyclin-dependentkinase 3)最相似，而⑶K3是編碼一個對于哺乳動物細(xì)胞Gl期到S期轉(zhuǎn)變非常重要的激酶(Hofmann F，Livingston DM.Differential effects of cdk2 and cdk3 on thecontrol of pBb and E2F function during Gl exit.Genes Dev 1996;10:851-861)。CDKL3編碼的蛋白質(zhì)也含有一個同樣存在于MAPK家族和CDK家族中的高度保守的TXY(Threonine-X-Tyrosine)基序(Hanks SKj Quinn AM，Hunter T:The protein kinasefamily:con-served features and deduced phylogeny of the catalytic domains.Science 1988;241:42-52.)。另外，在I亞區(qū)的兩個氨基酸(絲氨酸和酪氨酸)殘基與一個ATP結(jié)合域和一個典型的CDK負(fù)調(diào)節(jié)位點及其相似。NKIAMRE蛋白被認(rèn)為是一個細(xì)胞周期蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域也同樣存在于⑶K中(Midmer Mj Haq R，Squire JAj ZankeBW.1dentification of NK1-AMREj the human homologue to the mitogen-activatedpro-tein kinase-/cyclin-dependent kinase-related protein kinase NKIATRE, andits loss in leukemic blasts with chromosome arm 5q deletion.Cancer Res1999;59:4069-4074.)D以上的研究提示，CDKL3基因似乎扮演著細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換或細(xì)胞調(diào)控的角色，它具有幾個不同的功能，包括ATP&核苷酸結(jié)合、激酶活性和轉(zhuǎn)移酶活性，所有的這些功能都和細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖控制密切相關(guān)。有研究表明，CDKL3基因和與它同源的CDK3基因一樣，通過促進(jìn)細(xì)胞生長速率，縮短停滯期，提高蛋白產(chǎn)量來影響細(xì)胞周期(Matsuoka M，Matsuura Y， Semba K，Nishimoto 1:Molecular cloning of a cyclin-likeprotein associated with eyeI in-dependent kinase 3(cdk 3) in viv0.BiochemBiophys Res Commun 2000;273:442-447.)。還有研究顯示，和外周血淋巴細(xì)胞相比較而言，在兩個攻擊性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤中能檢測到NKIAMRE蛋白的高表達(dá)(ThompsonMAj Stumph J，Henrickson SE, Rosenwald A, Wang Qj Olson S，Brandt SJj Roberts J，ZhangX，Shyr Y，Kinney MC.Differ—ential gene expression in anaplastic lymphomakinase-positive and anaplastic lymphoma kinase-negative anaplastic large celllymphomas.Hum Pathol 2005;36:494-504.)。
[0005]為了深入研究⑶KL3在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)功能，本發(fā)明選取結(jié)腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，以RNAi為手段 研究CDKL3在結(jié)腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于公開與人⑶KL3 (cyclin-dependent kinase-like 3)基因相關(guān)的治療方法及藥物，以RNA干擾(RNAi)為手段研究CDKL3基因在腫瘤細(xì)胞的存活和凋亡命運中的作用。
[0007]本發(fā)明第一方面，以RNA干擾為手段，研究了 CDKL3基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括:向腫瘤細(xì)胞施用一種能夠特異性抑制CDKL3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制CDKL3蛋白的表達(dá)或活性的分子，以此來抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化和/或存活。
[0008]所述腫瘤細(xì)胞選自其生長與CDKL3蛋白的表達(dá)或活性相關(guān)的腫瘤細(xì)胞。較優(yōu)的，所述腫瘤細(xì)胞選自結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞之任一。
[0009]所述抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低CDKL3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低CDKL3蛋白的表達(dá)或活性的劑量。進(jìn)一步的，所述CDKL3基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0010]所述分子可選自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0011]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA CesiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0012]所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有⑶KL3基因的啟動子序列或⑶KL3基因的信息序列。
[0013]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA(siRNA)。所述小干擾RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與⑶KL3基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述小分子干擾RNA能特異性結(jié)合靶序列所編碼的mRNA片段，并特異性沉默人CDKL3基因的表達(dá)。
[0014]進(jìn)一步的，所述小干擾RNA的第一鏈的序列與⑶KL3基因中的靶序列基本相同。較優(yōu)的，所述⑶KL3基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-32中之任一序列。
[0015]所述CDKL3基因中的靶序列即為所述小分子干擾RNA特異性沉默CDKL3基因表達(dá)時，與所述的小分子干擾RNA互補(bǔ)結(jié)合的mRNA片段所對應(yīng)的CDKL3基因中的片段。
[0016]較佳的，所述⑶KL3基因來源于人。
[0017]本發(fā)明第一方面還公開了一種分離的人⑶KL3基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的 用途。進(jìn)一步的，所述腫瘤選自結(jié)腸癌、乳腺癌以及膠質(zhì)瘤之任一。
[0018]所述將分離的CDKL3基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容:其一，將CDKL3基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將CDKL3基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。
[0019]所述將CDKL3基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將CDKL3基因作為RNA干擾作用的靶標(biāo)，來研制針對腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑，從而能降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)CDKL3基因的表達(dá)水平。
[0020]所述將CDKL3基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將CDKL3基因作為作用對象，對藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人CDKL3基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的CDKL3基因小分子干擾RNA (siRNA)即是以人CDKL3基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將CDKL3基因及其蛋白作為作用對象。
[0021]所述將⑶KL3基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將⑶KL3基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0022]所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制CDKL3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制⑶KL3蛋白的表達(dá)或活性的分子，從而降低腫瘤細(xì)胞中⑶KL3基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0023]所述通過分離的CDKL3基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0024]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0025]所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人CDKL3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低人⑶KL3蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使人⑶KL3基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。
[0026]采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人CDKL3基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人CDKL3基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。
[0027]本發(fā)明第二方面公開了一種降低腫瘤細(xì)胞中⑶KL3基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0028]a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與CDKL3基因雜交的核苷酸序列；或者
[0029]b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與CDKL3基因雜交的核苷酸序列。
[0030]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與CDKL3基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與CDKL3基因中19-23個連續(xù)的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一鏈的序列與CDKL3基因中19、20或者21個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。
[0031]更進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與CDKL3基因中的靶序列基本相同。
[0032]進(jìn)一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與⑶KL3基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經(jīng)加工后可成為小干擾RNA (siRNA)進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源CDKL3基因表達(dá)的作用。
[0033]更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與CDKL3基因中的靶序列基本相同。
[0034]所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與CDKL3基因中的靶序列基本相同，所述CDKL3基因的靶序列即為siR NA用于特異性沉默CDKL3基因表達(dá)時，被所述siRNA識別并沉默的mRNA片段所對應(yīng)的CDKL3基因中的片段。
[0035]較佳的，所述⑶KL3基因中的靶序列含有SEQ IDNO: 1-32中之任一序列。
[0036]進(jìn)一步的，所述⑶KL3基因來源于人。
[0037]所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0038]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。更進(jìn)一步的，所述小干擾RNA第一鏈的序列如 SEQ ID NO:45 所示，具體為:5’ -GAGGAGAUAUCUCAGAACCAA-3’。
[0039]SEQ ID NO:45所示的siRNA為以SEQ ID NO: 19所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計的、針對人CDKL3基因的小干擾RNA的一條鏈，第二鏈的序列與第一鏈序列互補(bǔ)，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源CDKL3基因表達(dá)的作用。[0040]進(jìn)一步的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0041]更進(jìn)一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 33所示，具體為:5’ -GAGGAGAUAUCUCAGAACCAAUUCAAGAGAUUG⑶UCUGAGAUAUCUCCUC-3，。
[0042]shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性人⑶KL3基因表達(dá)的作用。
[0043]編碼本發(fā)明所述shRNA的基因片段的干擾慢病毒載體含有SEQ ID N0:l_32中之任一序列及其互補(bǔ)序列。
[0044]本發(fā)明第三方面，公開了一種CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼本發(fā)明所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達(dá)所述shRNA
[0045]所述的人CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人CDKL3基因shRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步的，所述CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體為CDKL3基因干擾慢病毒載體。
[0046]本發(fā)明的⑶KL3基因干擾慢病毒載體是將編碼前述⑶KL3基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述載體多為慢病毒載體，所述CDKL3基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述shRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默CDKL3基因的表達(dá)。
[0047]進(jìn)一步的，所述CDKL3基因干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤細(xì)胞中可被檢測的標(biāo)記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測的標(biāo)記物如綠色熒光蛋白(GFP)0
[0048]進(jìn)一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP, pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635, pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP, pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0049]本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人CDKL3基因干擾慢病毒載體,命名為 pGCSIL-GFP-CDKL3-siRNA。
[0050]本發(fā)明分離的核酸分子可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤。
[0051]本發(fā)明的⑶KL3基因siRNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療腫瘤的藥物或制劑。CDKL3基因干擾慢病毒載體則可用于制備所述CDKL3基因siRNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動物。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0052] 本發(fā)明第四方面，公開了一種CDKL3基因干擾慢病毒，由前述CDKL3基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生針對CDKL3基因的小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。[0053]本發(fā)明第五方面，公開了一種用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有前述的分尚的核酸分子，CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或CDKL3基因干擾慢病毒。
[0054]進(jìn)一步的，所述藥物組合物含有I~99wt%所述雙鏈RNA、shRNA、⑶KL3基因干擾核酸構(gòu)建體或CDKL3基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0055]在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
[0056]本發(fā)明還公開了所述藥物組合物在制備治療結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0057]該藥物組合物的應(yīng)用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預(yù)防或治療對象體內(nèi)腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。進(jìn)一步的，所述腫瘤選自結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤之任一。
[0058]所述藥物組合物用于預(yù)防或治療對象體內(nèi)腫瘤時，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。采用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移被抑制。進(jìn)一步的，所述腫瘤的生長、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制 。
[0059]進(jìn)一步的，采用該方法的對象為人。
[0060]本發(fā)明第六方面，公開了一種分離的CDKL3基因的RNA干擾靶序列，所述RNA干擾靶序列包含⑶KL3基因的片段，全長⑶KL3基因的核苷酸片段除外。
[0061]較優(yōu)的，所述RNA干擾靶序列與全長⑶KL3基因的核苷酸序列中至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個或50個連續(xù)的核苷酸基本相同。
[0062]較優(yōu)的，所述RNA干擾靶序列為SEQ ID NO: 1-32中任一序列。
[0063]所述分離的CDKL3基因的RNA干擾靶序列可應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。具體的，可將所述靶序列作為作用對象對藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人CDKL3基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如篩選獲得小分子干擾RNA，將之用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可所述靶標(biāo)寡核苷酸片段作為作用對象。
[0064]本發(fā)明還公開了 CDKL3基因的RNA干擾靶序列在制備治療結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤之任一腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0065]本發(fā)明第七方面，公開了一種用于降低腫瘤細(xì)胞中的⑶KL3基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括:存在于容器中的所述分離的核酸分子，CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或所述的CDKL3基因干擾慢病毒。
[0066]綜上所述，本發(fā)明設(shè)計了針對人CDKL3基因的32個RNAi靶點序列，構(gòu)建相應(yīng)的CDKL3RNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO:19 的 RNAi 載體 pGCSIL-GFP-CDKL3_siRNA 能夠顯著下調(diào)⑶KL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-⑶KL3-siRNA能夠靶向地將針對⑶KL3基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，降低⑶KL3基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的CDKL3基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。
[0067]本發(fā)明提供的siRNA或者能表達(dá)該siRNA序列的載體、慢病毒能夠特異性抑制人⑶KL3基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中⑶KL3基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0068]圖1:pGCSIL_GFP 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0069]圖2:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞5天后⑶KL3mRNA的表達(dá)水平
[0070]圖3:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞5天后細(xì)胞增殖情況[0071 ] 圖4:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后細(xì)胞增殖情況
[0072]圖5:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞5天后:細(xì)胞增殖情況
[0073]圖6:使用⑶KL3抗體在不同腫瘤組織組織樣本上的免疫組化檢測結(jié)果(a、b、c為結(jié)腸癌，d、e、f為乳腺癌)
【具體實施方式】
[0074]本發(fā)明認(rèn)為CDKL3作為一個細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
[0075]本發(fā)明設(shè)計了一組針對人⑶KL3基因的小分子干擾RNA (siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人CDKL3mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中連續(xù)的10-30 (優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個堿基序列設(shè)計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源CDKL3基因的表達(dá)。
[0076]發(fā)明人合成和測試了多種針對⑶KL3基因的siRNA，篩選出了可有效抑制⑶KL3的表達(dá)進(jìn)而抑制人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和生長的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0077]本發(fā)明提供了一系列干擾人⑶KL3基因的小干擾RNA (siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默CDKL3基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人CDKL3基因設(shè)計的小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)CDKL3基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明CDKL3基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNAi方式沉默CDKL3基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。
[0078]本發(fā)明的設(shè)計思路為:
[0079]本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人⑶KL3基因RNAi慢病毒:從Genbank中調(diào)取人CDKL3基因序列；預(yù)測siRNA位點；合成針對CDKL3基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構(gòu)建表達(dá)⑶KL3基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix, Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默⑶KL3基因的慢病毒。
[0080]基于上述方法，本發(fā)明提供了 32個干擾⑶KL3基因的有效靶點(具體如SEQ ID NO1-32所示)，構(gòu)建了特異干擾人⑶KL3基因的慢病毒。
[0081 ] 同時本發(fā)明還公開一種人⑶KL3基因RNAi慢病毒(⑶KL3_RNAi )及其制備與應(yīng)用。
[0082]本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低CDKL3基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，CDKL3基因是一個原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，CDKL3基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的CDKL3基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0083]下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京:科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
[0084]實施例1針對人⑶KL3基因RNAi慢病毒的制備
[0085]1.篩選針對人⑶KL3基因的有效的siRNA靶點
[0086]從Genbank 調(diào)取 CDKL3 (NM 001113575.1 或 NM 016508.3)基因信息；利用上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計軟件Genechem設(shè)計針對CDKL3基因的有效的siRNA靶點。在⑶KL3基因(匪001113575.1)的編碼序列(⑶S)區(qū)域內(nèi)，每隔一個堿基起始獲得21個堿基的序列，表1列出了其中32條針對⑶KL3基因的有效siRNA靶點序列。
[0087]表1靶向于人⑶KL3基因的siRNA靶點序列[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的人CDKL3基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤之任
O
3.一種降低腫瘤細(xì)胞中CDKL3基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含: a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與CDKL3基因雜交的核苷酸序列；或者 b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與CDKL3基因雜交的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與⑶KL3基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與CDKL3基因中的靶序列基本相同。
5.如權(quán)利要求3-4任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述CDKL3基因來源于人。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述CDKL3基因的靶序列含有SEQID NO: 1-32中之任 一序列。
7.如權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA，該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO:45所示。
8.如權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:33所示。
9.一種CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體,含有編碼權(quán)利要求3-8任一權(quán)利要求所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達(dá)所述shRNA。
10.如權(quán)利要求9所述CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體為干擾慢病毒載體。
11.如權(quán)利要求10所述CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤細(xì)胞中可被檢測的標(biāo)記物的核苷酸序列。
12.如權(quán)利要求10或11所述CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.1-puro-CMV-TagRFP, pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP,pLK0.l-puro-UbC-TagFP635> pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG-3xLac0> pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
13.—種CDKL3基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求10-12任一權(quán)利要求所述干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
14.一種用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有權(quán)利要求3-8任一所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求9-12任一權(quán)利要求所述CDKL3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求13所述的CDKL3基因干擾慢病毒。
15.權(quán)利要求14所述藥物組合物在制備治療結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤之任一的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
16.一種分離的⑶KL3基因的RNA干擾靶序列，為SEQ ID NO: 1-32中任一條序列。
17.權(quán)利要求16所述的CDKL3基因的RNA干擾靶序列在制備治療結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤之任一的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
18.一種用于降低腫瘤細(xì)胞中的CDKL3基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括:存在于容器中的，權(quán)利要求3-8任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求9-12任一權(quán)利要求所述CDKL3基因干擾核酸 構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求13所述的CDKL3基因干擾慢病毒。
【文檔編號】C12N15/867GK103468786SQ201210185287
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月6日
【發(fā)明者】韓海雄, 孫琴, 譚暢, 李楊, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請人:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司