專利名稱：一種新型酯酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種新型酯酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酯酶(EC3. I. I. I)是指能夠催化水解酯鍵的一類重要生物酶，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、日用化工業(yè)和生物防護(hù)等領(lǐng)域，在群體感應(yīng)猝滅方面具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，許多人和動(dòng)植物的致病菌致病過(guò)程與群體感應(yīng)密切相關(guān)，它們具有的群體感應(yīng)系統(tǒng)不僅在致病菌侵染宿主定殖過(guò)程的早期發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，而且能調(diào)控致病菌毒力基因的表達(dá)，此外，病原菌具有通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)抗宿主的免疫防御系統(tǒng)和藥物作用的能力。因此，通過(guò)破壞致病菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種新的抗感染策略，達(dá)到防 治病原菌發(fā)病的目的。目前，實(shí)現(xiàn)群體感應(yīng)淬滅主要有三種策略一是通過(guò)底物類似物破壞信號(hào)分子(的合成；二是通過(guò)群體感應(yīng)淬滅酶(如AHLs-內(nèi)酯酶，PONs和AHLs-酰胺酶)直接降解致病菌產(chǎn)生的信號(hào)分子(如AHLs);三是合成信號(hào)分子的類似物與受體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合(如舭絡(luò)類化合物)。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones,縮寫(xiě)AHLs)是革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中最典型的一類信號(hào)分子，常見(jiàn)的AHLs如C4-HSL，C6-HSL,C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL和30C8-HSL。生物酶猝滅法是一種高效、環(huán)保的有效措施，其中AHLs-內(nèi)酯酶與AHLs-酰胺酶相比，具有更廣的降解譜。大量的研究結(jié)果表明AHLs-內(nèi)酯酶作為一種新型抗菌策略的工具酶具有巨大的應(yīng)用潛力。傳統(tǒng)獲得酯酶的方法是從土壤中進(jìn)行多輪篩選，獲得產(chǎn)酯酶的菌株，再進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)化等，獲得理想菌株。這種方法有一定的局限性，來(lái)源非常有限，生產(chǎn)成本高，酶制劑價(jià)格昂貴，或者達(dá)不到工業(yè)運(yùn)用的規(guī)模。隨著基因工程和分子生物學(xué)的發(fā)展，獲得酯酶的另一個(gè)途徑即是宏基因組方法。它以特定生態(tài)環(huán)境中微生物群體基因組的總和作為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，通過(guò)宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及基因克隆、異源表達(dá)等基本研究策略，篩選出有用的新基因及其產(chǎn)物。該方法充分利用了環(huán)境中蘊(yùn)藏的大量寶貴基因資源，在挖掘和利用未培養(yǎng)微生物資源和篩選新穎生物活性物質(zhì)方面表現(xiàn)出巨大的潛力，為生命科學(xué)提供了強(qiáng)有力的新方法，已成為當(dāng)前國(guó)際上微生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)。至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)通過(guò)該技術(shù)克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學(xué)特性及工業(yè)應(yīng)用潛力。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有利用宏基因組技術(shù)從吐魯番土樣中發(fā)現(xiàn)新型耐熱酯酶的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種新型酯酶的基因Estll2。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述新型酯酶的宏基因組學(xué)克隆方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供含有上述新型酯酶基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供利用上述表達(dá)載體構(gòu)建的重組酯酶及其制備方法。本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述重組酯酶在降解信號(hào)分子AHLs方面的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種新型酯酶的基因Estll2，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明中的新型酯酶的基因可以為如下(I)或(2)或(3)所示DNA分子(I)其核苷酸序列是SEQ ID NO : I所示DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下(I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(3)與⑴或⑵限定的DNA序列具有85%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。本發(fā)明中的新型酯酶蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。 本發(fā)明中的新型酯酶的蛋白可以是如下(a)或者(b)的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)與SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列具有85%以上的同源性且編碼所述蛋白并具有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性衍生蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種新型酯酶的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征是提取吐魯番土壤樣品的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接PUC118載體，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)原創(chuàng)平板顯色法快速篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)SEQ ID NO :4和SEQ IDNO 5中的引物，從而克隆到目的片段。實(shí)際上，擴(kuò)增上述任一所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述引物對(duì)中，所述引物的一條引物序列如SEQ ID NO :4所示，另一條引物序列如SEQ ID NO 5 所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種新型酯酶表達(dá)載體，是含有上述新型酯酶基因Estll2的表達(dá)載體pET-28a(+)-Estll2。本發(fā)明所述新型酯酶表達(dá)載體為在載體pET_28a ( + )的多克隆位點(diǎn)插入SEQ IDNO 1所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組酯酶的制備方法，包括用上述的新型酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。在重組酯酶的制備方法中，所述的寄主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌。上述重組酯酶的制備方法，其具體過(guò)程為包括上述新型酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至寄主細(xì)胞大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)的重組酯酶。在重組酯酶的制備方法中，所述的IPTG終濃度優(yōu)選為O. Γ1. 5mM，誘導(dǎo)溫度優(yōu)選為 18 37°C。本發(fā)明提供的重組酯酶，包括用上述新型酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酶的步驟的方法制備。即本發(fā)明中的重組制備是通過(guò)將新型酯酶表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的，新型酯酶表達(dá)載體為在表達(dá)載體pET-28a ( + )的多克隆位點(diǎn)插入新型酯酶基因Estll2得到的新型酯酶表達(dá)載體。也就是說(shuō)，含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的上述重組酯酶在降解信號(hào)分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯AHLs方面的應(yīng)用。本發(fā)明中所述的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯AHLs包括C4-HSL，C6-HSL，C8-HSL，ClO-HSL, C12-HSL或30C8-HSL中的一種或它們的混合物。在上述重組酯酶在降解信號(hào)分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯AHLs方面的應(yīng)用中，降解溫度優(yōu)選為0 65 °C，尤其是降解溫度在20 V、25 °C、30 V、35 °C、40 V、45 °C、50 V、55 °C或60°C時(shí)，降解效果更好；降解時(shí)的pH優(yōu)選為4. 9. 5，當(dāng)pH為5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5或8. O時(shí)，降解效果更好。本發(fā)明中的重組酯酶，其耐熱性好，可以作為生防酶制劑的活性組分，用于降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果①.本發(fā)明以吐魯番土壤為樣品構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，利用功能篩選方法，從中克隆到一個(gè)新的酯酶DNA序列；②.本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)酯酶基因的功能研究，發(fā)現(xiàn)該序列在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)，經(jīng)蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，初步確定分子量約為 35. 9kDa ；③.本發(fā)明將SEQ ID NO. I所示的DNA序列克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下(I)在大腸桿菌表達(dá)體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達(dá)；(2)用對(duì)硝基苯酚乙酸酯為底物，測(cè)得重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為60°C，在溫度低于50°C非常穩(wěn)定，50°C保溫12h后，剩余相對(duì)酶活性為91. 9%，表明該酶具有熱穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH為7. 5，在pH 5. (T9. O下處理24h，酶的相對(duì)活力保持在80%以上，說(shuō)明其有較好的酸堿耐受性；④.本發(fā)明通過(guò)測(cè)定重組酯酶的酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)重組酯酶對(duì)信號(hào)分子C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL和30C8_HSL有強(qiáng)降解作用，高效液相色譜分析表明重組酯酶可完全降解C8-HSL, C10-HSL和C12-HSL,對(duì)C6-HSL和30C8_HSL的降解率高達(dá)90%以上，對(duì)C4-HSL的降解率為64. 7%。因此，該酶在去除群體感性信號(hào)分子(高絲氨酸內(nèi)酯)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為實(shí)施例I中的SDS-PAGE電泳圖； 其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量maker，I為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白；圖2為實(shí)施例2中以對(duì)硝基苯酚乙酸酯為底物重組酶的最適溫度(A)和熱穩(wěn)定性(B)結(jié)果的折線圖；圖3為實(shí)施例2中以對(duì)硝基苯酹乙酸酯為底物重組酶的最適pH (Δ)和pH穩(wěn)定性(▲)結(jié)果的折線圖；圖4為實(shí)施例3中重組酶對(duì)底物不同降解結(jié)果的高效液相色譜圖，其中A、B、C、D、E 和 F 分別為重組酶對(duì) C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL 和 30C8_HSL 的降解結(jié)果，箭頭所示為底物降解前后的吸收峰。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例I宏基因組文庫(kù)的建立和陽(yáng)性克隆子的獲得、基因克隆與表達(dá)I、總DNA的提取稱取吐魯番土壤樣品10g，加入13. 5mL DNA提取緩沖液(O. IM Tris, O. IMEDTA-Na, O. IM Na3PO4,1. 5M NaCl，1%CTAB, pH 值 8· O)，劇烈振蕩 5min,加入 I. 5ml 20%SDS,65°C水浴2h,5000rpm離心5min,取上清液,用等體積氯仿抽提2次，16000rpm離心IOmin,取上清，加入O. 6倍體積的異丙醇,室溫放置2h, 16000rpm離心20min,棄上清,沉淀加IOmL預(yù)冷的70%乙醇，16000rpm離心lOmin，收集DNA沉淀，風(fēng)干，用適量超純水溶解。 2、試劑盒法純化DNA :按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3、宏基因組電泳檢測(cè)用O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的純度和質(zhì)量。4、酶切總DNA :用限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切總DNA，回收3_10kb的酶切片段，方法同試劑盒法純化DNA。5、酶切片段的電泳檢測(cè)方法同宏基因組電泳檢測(cè)。6、酶切片段的連接與純化將回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)載體連接過(guò)夜；按照微量回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化。7、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化向100 μ L的大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)中加入5 μ L連接產(chǎn)物，2500V/cm(Eppdorf2510電擊儀)電擊I次，46°C熱激6min，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)lh，吸取適量培養(yǎng)物涂布于含氨芐青霉素(100 μ g/ml)、IPTG (ImM)和X_gal (24 μ g/ml)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。由此構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量約26，000個(gè)轉(zhuǎn)化子的宏基因組文庫(kù)。8、文庫(kù)篩選和陽(yáng)性克隆子的鑒定將文庫(kù)中所有的白板單菌落點(diǎn)種至含50 μ g/mL氨芐青霉素、O. 5mM IPTG、100 μ MX-caprylate的LB篩選培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)48h后觀察平板，能夠產(chǎn)生明顯的藍(lán)色水解圈的即為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆子挑出并接種至IOmL含氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取2mL菌體提取質(zhì)粒pUC118_A，并對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI的BLASTn軟件分析比較目的序列，發(fā)現(xiàn)該DNA由816個(gè)堿基組成，其核酸序列如SEQID NO. I所示，該DNA編碼的多肽，含271個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，將其命名為Est112，其中SEQ ID NO. 2為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 3的對(duì)照?qǐng)D。9、基因片段的克隆根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)引物est 112-F和est 112-R，引物兩端引入能插入pET-28a(+)載體的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，引物estll2-F的序列如SEQ ID NO. 4和引物estll2-R的序列如SEQ ID NO. 5所示。est 112-F: 5，-CGCGGATCCATGCCGCATGTAGAGAACGA-3，(下劃線為引入的 BamHI 酶切位點(diǎn))estll2-R:5’ -CCGGAATTCTCAGGACACCAATGAAGCTTCTCGA-3> (下劃線為引入的EcoRI酶切位點(diǎn))以質(zhì)粒pUC118-A為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系如下
質(zhì)粒 pUCI18-A (50 ng/iiL)O.SuL
SxBufferI μ
dNTP (2.5 mM)4 pL
estJll-Ψ (20 μΜ)I |iL
est 112-R (20 μΜ)I pL
PrimerSTAR (2.5 U/μΙ)0.5 μ
補(bǔ)充水至50 μ PCR反應(yīng)條件如下第一階段94°C預(yù)變性3min ;第二階段94°C變性30sec，65°C退火15sec，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；第三階段72°C延伸IOmin ;最后于4°C保存。用膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物純化并用BamHI和EcoRI于37°C雙酶切8h，與用BamHI和EcoRI雙酶切的pET_28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行連接，取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取5株單菌落接種提取質(zhì)粒DNA，雙酶切驗(yàn)證后，送交測(cè)序。10、重組酯酶Estll2粗酶液的獲得及分子量檢測(cè)將重組工程菌劃線至含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜活化，隨機(jī)挑取I株重組菌接種至含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，按1:100的接種量轉(zhuǎn)接至50mL的含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體密度OD6tltl=L I時(shí)加入IPTG至終濃度O. 5mM，30°C、220rpm搖床培養(yǎng)8h。14000rpm離心5min,棄上清,將菌體重懸于50mL,0. 05M的Tris-HCl (pH=6. 8)緩沖液中，用超聲波破碎儀(Sonics公司)破碎細(xì)胞。4°C，HOOOrpm離心lOmin，收集上清，得到粗重組蛋白，將粗重組蛋白用Ni-NTA Agerose (QIAGEN)親和柱純化重組蛋白，親和柱具體操作步驟按QIAGEN公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將獲得的粗重組蛋白和純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(10%)將粗酶液中蛋白的各個(gè)組分分開(kāi)，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色,蛋白maker估計(jì)酶蛋白的大小。通過(guò)蛋白純化試劑盒純化酶蛋白，SDS-PAGE電泳得到一條單一的蛋白條帶。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，SEQ ID NO. 2所述核苷酸序列所編碼的多肽在大腸桿菌BL21(DE3)中得到高效表達(dá)，且所有重組蛋白均是可溶的，無(wú)包涵體形成，初步估計(jì)重組蛋白的分子量約為35. 9kDa(其中含4kDa融合標(biāo)簽)(如附圖I所示)。實(shí)施例2重組酯酶Estl 12的酶學(xué)性質(zhì)研究I、重組酯酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性將重組酯酶的粗酶液在30_75°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)體系為410 μ L，其組成為400 μ L含40 μ M的對(duì)硝基苯乙酸酯的磷酸鉀溶液(ρΗ7. 5)和10 μ L酶溶液。該反應(yīng)體系在60°C下反應(yīng)4min，隨后于405nm波長(zhǎng)處測(cè)定該過(guò)程中釋放的對(duì)硝基苯酚的吸光度，同時(shí)做不加酶液的空白對(duì)照。測(cè)定其酶活性，得到其最適反應(yīng)溫度(以酶活力最高時(shí)記為100%)。在50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 5)，將重組酯酶酶液分別置于不同40°C、45° C、50°C、55° C、60° C和65°C保溫40h后，測(cè)定殘余酶活，以處理Omin酶液的酶活力為100%。檢測(cè)結(jié)果如附圖2所示，重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為60°C，該酶在50°C下保溫12h，剩余酶活力為91. 9%，表明該酯酶具有良好的穩(wěn)定性。2、重組酯酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性以對(duì)硝基苯酹乙酸酯為底物，在最適溫度下檢測(cè)不同pH值(pH 5. O 9. O)條件下檢測(cè)重組酯酶的最適反應(yīng)pH。取等量的酶液，分別在不同pH值的緩沖液(pH 5. O 9. O)中30°C靜置24h，確定重組酯酶的pH·穩(wěn)定性。以酶活力最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如附圖3所示，重組蛋白的最適反應(yīng)pH為7. 5。經(jīng)過(guò)在各pH值的緩沖液中放置24h后，重組蛋白在pH 5. O 9. O下可以保持80%以上的酶活力，表現(xiàn)出較好的pH穩(wěn)定性。實(shí)施例3重組酯酶Estl 12對(duì)AHLs的降解能力測(cè)定I、反應(yīng)體系將I μ mo I 的 C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL 和 30C8_HSL 溶于 50 μ L 的甲醇中，并加入950 μ L的50mM的磷酸鉀緩沖液，即配制成ImM的AHLs底物溶液，31 μ g的重組酶粉與Iml ImM底物混合，30° C反應(yīng)30min后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，同時(shí)滅火酶粉作為空白對(duì)照。2、HPLC 分析色譜條件如下
HPLC條件
色 |:l； Diamonsil C18 coIlium (250 mm x 4.6 mm, 5 pin)
流動(dòng) 411 acetonitrile: phosphate buffer (100 mM, pH 3.0) (75:25, v/v)
流速0.8 mL/min
柱溫簾溫
檢測(cè)波K 210 nm進(jìn)樣-I 20 nL經(jīng)HPLC 檢測(cè)分析，重組酯酶對(duì) C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL 和 30C8_HSL的降解率分別達(dá)到64. 7%,96. 2%、100%、100%、100%和94. 3%，表明其具有廣泛的底物特異性和較高的AHLs降解能力(降解圖譜如4所示)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種新型酯酶基因Estll2，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.與權(quán)利要求I限定的新型酯酶的基因序列具有85%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
3.一種新型酯酶蛋白，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.與權(quán)利要求3所述新型酯酶蛋白的氨基酸序列具有85%以上的同源性且編碼所述蛋白并具有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求I所述的新型酯酶基因Estl12的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征是提取吐魯番土壤樣品的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接pUC118載體，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)原創(chuàng)平板顯色法快速篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5中的引物，從而克隆到目的片段。
6.一種新型酯酶表達(dá)載體，其特征是是含有權(quán)利要求I中所述的新型酯酶基因Estll2 的表達(dá)載體 pET-28a(+)-Estll2。
7.—種重組酯酶的制備方法，其特征是包括用權(quán)利要求5所述的新型酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組酯酶的制備方法，其特征是所述的寄主細(xì)胞為大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組酯酶的制備方法，其特征是其具體過(guò)程為包括用權(quán)利要求5所述的新型酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至寄主細(xì)胞大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)的重組酯酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組酯酶的制備方法，其特征是所述的IPTG終濃度為O.Γ1. 5mM，誘導(dǎo)溫度為18 37°C。
11.一種重組酯酶，其特征是包括用權(quán)利要求6所述的新型酯酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酶的步驟的方法制備。
12.權(quán)利要求11所述的重組酯酶在降解信號(hào)分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯AHLs方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。還公開(kāi)了含上述新型酯酶基因的表達(dá)載體、重組酯酶及該重組酯酶在降解高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子的應(yīng)用。該新型酯酶在大腸桿菌表達(dá)體系中高效可溶性表達(dá)，具有較好的熱穩(wěn)定性，且對(duì)高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子有強(qiáng)降解作用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102732539SQ20121019690
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者劉玉煥, 范新炯 申請(qǐng)人:中山大學(xué)