專利名稱：一種應(yīng)用熒光假單胞菌生產(chǎn)天然藍(lán)色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藍(lán)色素的生產(chǎn)技術(shù)方法及其生產(chǎn)菌株，尤其是低能耗清潔生產(chǎn)天然藍(lán)色素的技術(shù)方法，屬于生物化工及著色劑生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
色素，也稱著色劑，廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、印染、食品等行業(yè)領(lǐng)域，能夠在很大程度上改善產(chǎn)品性狀及影響產(chǎn)品品質(zhì)。人工合成色素和天然色素是兩類應(yīng)用廣泛的主要色素。盡管人工合成色素色澤鮮艷，價(jià)格低廉，著色性及穩(wěn)定性良好，但其對(duì)人體健康普遍存在一定程度的毒性，甚至具有致畸、致突變、致癌作用。許多國(guó)家已對(duì)人工合成色素的使用種類、應(yīng)用范圍、添加劑量等作出明確規(guī)定，有些國(guó)家甚至完全禁止使用合成色素。天然色素主要來(lái)源于動(dòng)物、植物、微生物，絕大多數(shù)無(wú)毒副作用，安全性高，而且許多天然色素還兼 具營(yíng)養(yǎng)及生理藥理功能，符合人們對(duì)“安全、天然、營(yíng)養(yǎng)、多功能”色素產(chǎn)品的需求。天然藍(lán)色素是稀有貴重色素，產(chǎn)品附加值很高。目前常用的天然藍(lán)色素為桅子藍(lán)色素和藻藍(lán)色素，分別以桅子果實(shí)和螺旋藻及念珠藻為生產(chǎn)原料，而這些原料多產(chǎn)于溫暖濕潤(rùn)地區(qū)，這使得天然藍(lán)色素的自然資源非常稀缺，不利于天然藍(lán)色素的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。產(chǎn)藍(lán)色素微生物菌株極為少見(jiàn)，已報(bào)道的主要為放線菌(如海洋放線菌M259、天藍(lán)鏈霉菌100、鏈霉菌ZLT菌株等)，但這些菌株產(chǎn)藍(lán)色素生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)色素的溫度范圍窄，生長(zhǎng)過(guò)程中形成菌絲體不利于發(fā)酵進(jìn)行，因此色素產(chǎn)量比較低。發(fā)酵產(chǎn)藍(lán)色素的細(xì)菌有熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) BI菌株(CGMCC No. 1194)(邪新會(huì)等，發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00410074325. O)和黃桿菌{Flavobacterium 577. )B29 菌株(CGMCC No. 3699)(唐琦勇等，發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010166734. 9)，但它們以菌體為色素制備原料來(lái)源，這限制了藍(lán)色素的規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是應(yīng)用一種能夠產(chǎn)生大量胞外藍(lán)色素的熒光假單胞菌株，通過(guò)發(fā)酵提取制備大量天然藍(lán)色素制品。本發(fā)明提供了一種應(yīng)用藍(lán)色素產(chǎn)生菌-突光假單胞菌iPseudomonas
fluorescens BMG-1)菌株生產(chǎn)天然藍(lán)色素的發(fā)酵及制備工藝方法。本發(fā)明所應(yīng)用的產(chǎn)藍(lán)色素突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1)已于2012年5月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 6060。由突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1)菌株生產(chǎn)藍(lán)色素的步驟如下
I)種子液制備刮取經(jīng)瓊脂平板復(fù)壯培養(yǎng)的熒光假單胞菌{Pseudomonasfluorescens BMG-1)培養(yǎng)物，均勻分散于發(fā)酵培養(yǎng)液中，制成發(fā)酵用種子液。以每個(gè)直徑
09cm瓊脂平板使用IOmL發(fā)酵培養(yǎng)液的比例配制發(fā)酵用種子液。
2)發(fā)酵培養(yǎng)以2%_8%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，在20°C _28°C靜置發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)。本發(fā)明采用淺盤培養(yǎng)發(fā)酵方式，盤中培養(yǎng)液層厚度為l-2cm。3)色素制備離心除去發(fā)酵培養(yǎng)液中的菌體，收集上清液并低溫真空濃縮至原體積的1/5-1/10。以乙醇沉降濃縮液，收集藍(lán)色沉集物以5-10倍蒸餾水洗滌，合并水洗液并真空濃縮干燥可制得藍(lán)色素粗制品。合并水洗液過(guò)硅膠柱層析可制得藍(lán)色素精制品。所述復(fù)壯菌種用瓊脂平板含有下過(guò)物質(zhì)10-40克葡萄糖，100-300克新鮮馬鈴薯的沸水浸出物，18-20克瓊脂粉，加蒸餾水至1000毫升。優(yōu)選的，步驟I)中瓊脂平板配制為20克葡萄糖，200克新鮮馬鈴薯的沸水浸出物，18克瓊脂粉，加蒸餾水至1000毫升，121°C滅菌20分鐘，pH為7. O。優(yōu)選的，步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)液配制為20克葡萄糖，200克新鮮馬鈴薯的沸水浸出物，加蒸餾水至1000毫升，121。。滅菌20分鐘，pH為7. O。 本發(fā)明制備的藍(lán)色素，易溶于水，在690nm處有一個(gè)最大吸收峰，在pH2. 2_10. O范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，具有非常良好的熱穩(wěn)定性和自然光穩(wěn)定性，具有一定程度的抗氧化能力。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)速度快，在20°C _28°C溫度范圍內(nèi)都可發(fā)酵產(chǎn)色素，發(fā)酵產(chǎn)色素過(guò)程為淺盤靜置自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)設(shè)備及條件要求粗放，能耗低，色素產(chǎn)量大(藍(lán)色素粗品產(chǎn)量一般可以達(dá)到I. 5-2. 5克/升發(fā)酵液，藍(lán)色素精制品產(chǎn)量一般可以達(dá)到
0.5-1克/升發(fā)酵液)，制備工藝簡(jiǎn)單，便于產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵制得的藍(lán)色素為純天然色素產(chǎn)品，對(duì)動(dòng)物體無(wú)任何毒副作用，可以廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、印染、食品等行業(yè)領(lǐng)域。


圖I所示為熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)藍(lán)色素吸收光譜曲線圖。圖2所示為不同溫度對(duì)熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。圖3所示為pH2. 2-8. O值對(duì)熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。圖4所示為pH8. 6-10. 6值對(duì)熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。圖5所示為不同氧化還原劑對(duì)熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、熒光假單胞菌BMG-1 CGMCC No. 6060的培養(yǎng)
將保藏的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 在 PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，檢測(cè)菌落顏色及培養(yǎng)基顏色的變化；將復(fù)壯的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，淺盤靜置、自然通氣方式培養(yǎng)，培養(yǎng)液層厚度為l-2cm, 26°C恒溫培養(yǎng),至整個(gè)培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯钏{(lán)綠色時(shí)結(jié)束培養(yǎng)過(guò)程。
實(shí)施例2、菌種發(fā)酵培養(yǎng)及藍(lán)色素提取制備
I、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
將由復(fù)壯的BMG-I菌種制備的種子液以3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)液層厚度lcm，22°C恒溫培養(yǎng)，至72小時(shí)整個(gè)培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯钏{(lán)綠色時(shí)結(jié)束培養(yǎng)過(guò)程。2、藍(lán)色素的提取制備
收集發(fā)酵培養(yǎng)液在8000r/min下離心15min,合并上清液在40°C下真空濃縮至原體積的1/6。以6倍體積無(wú)水乙醇洗滌濃縮液，收集沉集物。以10倍濃縮液體積的蒸餾水洗滌沉集物，合并水洗液并在40°C下真空濃縮、干燥可制得藍(lán)色素粗制品，得率為2. 52g/L發(fā)酵液。將此經(jīng)濃縮的水洗液過(guò)60-100目硅膠柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集藍(lán)色洗脫組分，濃縮干燥后可制得藍(lán)色素精制品，得率為O. 98g/L發(fā)酵液。
實(shí)施例3、菌種發(fā)酵培養(yǎng)及藍(lán)色素提取制備
1、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
將由復(fù)壯的BMG-I菌種制備的種子液以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)液層厚度I. 5cm，24°C恒溫培養(yǎng)，至60小時(shí)整個(gè)培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯钏{(lán)綠色時(shí)結(jié)束培養(yǎng)過(guò)程。
2、藍(lán)色素的提取制備
收集發(fā)酵培養(yǎng)液在8000r/min下離心15min,合并上清液在40°C下真空濃縮至原體積 的1/8。以8倍體積無(wú)水乙醇洗滌濃縮液，收集沉集物。以10倍濃縮液體積的蒸餾水洗滌沉集物，合并水洗液并在40°C下真空濃縮、干燥可制得藍(lán)色素粗制品，得率為2. llg/L發(fā)酵液。將此經(jīng)濃縮的水洗液過(guò)60-100目硅膠柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集藍(lán)色洗脫組分，濃縮干燥后可制得藍(lán)色素精制品，得率為O. 73g/L發(fā)酵液。
實(shí)施例4、菌種發(fā)酵培養(yǎng)及藍(lán)色素提取制備
1、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
將由復(fù)壯的BMG-I菌種制備的種子液以7%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)液層厚度2. 0cm, 26°C恒溫培養(yǎng)，至48小時(shí)整個(gè)培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯钏{(lán)綠色時(shí)結(jié)束培養(yǎng)過(guò)程。
2、藍(lán)色素的提取制備
收集發(fā)酵培養(yǎng)液在8000r/min下離心15min,合并上清液在40°C下真空濃縮至原體積的1/10。以10倍體積無(wú)水乙醇洗滌濃縮液，收集沉集物。以10倍濃縮液體積的蒸餾水洗滌沉集物，合并水洗液并在40°C下真空濃縮、干燥可制得藍(lán)色素粗制品，得率為I. 58g/L發(fā)酵液。將此經(jīng)濃縮的水洗液過(guò)60-100目硅膠柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集藍(lán)色洗脫組分，濃縮干燥后可制得藍(lán)色素精制品，得率為O. 59g/L發(fā)酵液。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用突光假單胞菌 iPseudomorms fl uorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 發(fā)酵、生產(chǎn)制備天然藍(lán)色素的方法，包括如下步驟 1).將保藏的突光假單胞菌fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 使用PDA培養(yǎng)基活化、擴(kuò)大培養(yǎng)； 2).將步驟I)的菌株培養(yǎng)物以2%-8%的接種量接種于H)培養(yǎng)液中，200C-280C淺盤靜置、自然通氣方式培養(yǎng)36-60小時(shí)； 3).將步驟2)的培養(yǎng)液除去菌體，收集上清液，以蒸餾水提取其中的藍(lán)色素，經(jīng)濃縮干燥后獲得藍(lán)色素粗制品及精制品； 根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所選生產(chǎn)藍(lán)色素的H)培養(yǎng)液含有下述物質(zhì)20克葡萄糖，200克鮮馬鈴薯的沸水浸出物，加蒸餾水至1000毫升，121°C滅菌20分鐘，pH為 7. O。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述含藍(lán)色素上清液是通過(guò)離心除去培養(yǎng)液中的菌體后得到的，離心轉(zhuǎn)速為3000-8000r/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述含藍(lán)色素上清液是通過(guò)離心除去培養(yǎng)液中的菌體后得到的，離心轉(zhuǎn)速為3000-8000r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于低溫(35°C-45°C )真空濃縮離心除菌后的含藍(lán)色素上清液至原體積的1/5-1/10 ;以乙醇沉降濃縮液，收集藍(lán)色沉集物以5-10倍蒸餾水洗滌，合并水洗液并低溫(35°C -45°C )真空濃縮干燥可制得藍(lán)色素粗制品；合并水洗液經(jīng)濃縮后過(guò)硅膠柱層析可制得藍(lán)色素精制品。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的方法，其特征在于所述沉降含藍(lán)色素上清濃縮液的乙醇為無(wú)水乙醇，用量為濃縮液的5-10倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或7或8所述的方法，其特征在于所述柱層析采用60-100目或100-200目試劑級(jí)硅膠，以蒸餾水為洗脫劑；收集洗脫液真空干燥后獲得藍(lán)色素精制品；所述藍(lán)色素精制品在690nm處有一個(gè)最大吸收峰。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用熒光假單胞菌生產(chǎn)天然藍(lán)色素的方法。本發(fā)明使用熒光假單胞菌BGM-1菌株(PseudomonasfluorescensBGM-1)CGMCCNo.6060生產(chǎn)胞外水溶性藍(lán)色素，生產(chǎn)方法為將產(chǎn)藍(lán)色素?zé)晒饧賳伟鶥GM-1菌株以2%-8%接種量接種于淺盤PD培養(yǎng)液中，20-28℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)24-48小時(shí)得到發(fā)酵液。離心除去菌體，濃縮發(fā)酵上清液。以乙醇浸洗經(jīng)濃縮的發(fā)酵上清液，收集沉集物并以蒸餾水浸洗，將水洗液減壓濃縮干燥后得藍(lán)色素粗制品。收集水洗液除沉、濃縮后過(guò)硅膠柱層析，經(jīng)減壓濃縮干燥后得到藍(lán)色素精制品。所得藍(lán)色素具有很好的光熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，對(duì)動(dòng)物無(wú)任何毒副作用，為純天然藍(lán)色素產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、食品等工業(yè)各領(lǐng)域。本發(fā)明為天然藍(lán)色素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了新的方法及途徑。
文檔編號(hào)C12P1/04GK102899355SQ201210218018
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者毛得獎(jiǎng), 朱亞玲 申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院