一種實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)病毒核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸核糖體結(jié)合體系的構(gòu)建，必先解決結(jié)合核酸的分離技術(shù)和定量檢測(cè)技術(shù)，目 前常采用放射性同位素病毒核酸標(biāo)記作為示蹤信號(hào)，進(jìn)行病毒核酸-核糖體結(jié)合研宄，對(duì) 于目標(biāo)RNA (完整病毒RNA)是否成功標(biāo)記并未能確定，難于標(biāo)記完整的病毒RNA，上述方法 主要是對(duì)于不需要帽子識(shí)別的而采用內(nèi)部核糖體結(jié)合識(shí)別的一些無(wú)帽子結(jié)構(gòu)的亞基因組 (片段）有用。帽子結(jié)構(gòu)是完整RNA與核糖體結(jié)合識(shí)別的一個(gè)重要基礎(chǔ)，我們的目的是研宄 核酸核糖體的結(jié)合藥物篩選體系，所以進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記的前提是要不能影響核酸與核糖體的 正常結(jié)合識(shí)別，否則就失去了操作本身的意義。因此，開(kāi)發(fā)一種能解決上述問(wèn)題的分析檢測(cè) 技術(shù)是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括RNA提取、PCR反應(yīng)、檢測(cè)步驟，具體包括： A、 RNA提?。禾崛「胁煵菘俁NA，提純TMV-RNA反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA ; B、 PCR反應(yīng)：根據(jù)Gen bank數(shù)據(jù)庫(kù)，以TMV外殼蛋白基因系列作為病毒核酸檢測(cè)的指 標(biāo)，設(shè)計(jì)合成特異引物，以cDNA為作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收和純化PCR產(chǎn)物； C、 檢測(cè)：對(duì)回收和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明可直接應(yīng)用于體系構(gòu)建，進(jìn)行體系中病毒核酸的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果具有 可靠性。同時(shí)也顯示出采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增循環(huán)的Ct值變化來(lái)進(jìn)行天然 物抗病毒藥理和活性篩選的良好前景。
【附圖說(shuō)明】
[0006] 圖1為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)示意圖； 其中：1-DNA marker I (最小 600bp)，2-總 RNA 模板，3、4、5_ 提純 TMV-RNA 模板，6-DNA marker II(100~600bp ladder)； 圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線示意圖； 圖3為cDNA系列稀釋相關(guān)性曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線）不意圖； 圖4為不同濃度RNA與檢測(cè)Ct的相關(guān)性曲線示意圖； 圖5為不同相對(duì)濃度RNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增熒光曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008] 本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，包括RNA提取、PCR反應(yīng)、 檢測(cè)步驟，具體包括： A、 RNA提?。禾崛「胁煵菘俁NA，提純TMV-RNA反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA ; B、 PCR反應(yīng)：根據(jù)Gen bank數(shù)據(jù)庫(kù)，以TMV外殼蛋白基因系列作為病毒核酸檢測(cè)的指 標(biāo)，設(shè)計(jì)合成特異引物，以cDNA為作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收和純化PCR產(chǎn)物； C、 檢測(cè)：對(duì)回收和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
[0009] A步驟中所述的反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：3ul 5 X RT Buffer，Iul IOmM dNTP， 0· 5ul 3 '端下游引物，0· 5ul RNAsin (40u/ul)，TMV-RNA 模板，Iul M-MLV (200U/ ul，promega產(chǎn)品），加 DEPC處理水補(bǔ)足15ul〇
[0010] A步驟中所述的反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為42~65°C水浴中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50~65min。
[0011] B步驟中所述的特異引物為： 5' 上游引物：5' CCGGAATTCGTCTTACAGTATCACTAC3'; 3' 下游引物：5' TAC AAG CTTAGTTGCAGG ACCAGAGG3'。
[0012] B步驟中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10 X PCR Buffer (含Mg+2 ) 2.5 ul， dNTP(10mM/each) 0· 5ul，5'上游引物 I. 0 ul，3'下游引物 1.0 ul，Taq 聚合酶 0· 3ul (5U/ul Takara)，加 CldH2O 補(bǔ)充至 25 μ 1 〇
[0013] B步驟中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min，進(jìn)行以下循環(huán)：94°C 變性30 sec，50°C退火30 sec，72°C延伸40 sec，2個(gè)循環(huán)后再接著以下循環(huán)反應(yīng)： 94°C變性 30 sec，55°C退火 30 sec，72°C延伸 40 sec，33 個(gè)循環(huán)后，94°C延伸 10min〇。
[0014] C步驟中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)的反應(yīng)體系為：2ul 10XPCR Buffer (含 Mg+2 )，0.2ul dNTP (10mM/each)，0· 4 ul 上游引物，0· 4ul 下游引物，0· 2ul Taq聚合酶，2ul RNA反轉(zhuǎn)錄（RT)產(chǎn)物，0. 5 ul熒光染料，加 ddH20補(bǔ)充至20ul。
[0015] C步驟中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min后開(kāi) 始以下循環(huán)：94°C變性30 sec，58°C退火30 sec，72°C延伸40 sec，39個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸5min，最后制作62°C到97°C擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線。
[0016] 實(shí)施例1 1、材料和方法 1.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Gen bank網(wǎng)上公布的TMV全核酸系列，以TMV相對(duì)保守的外殼蛋白基因系列作為 病毒核酸檢測(cè)的指標(biāo)，用DNAMN軟件設(shè)計(jì)特異引物（由于設(shè)計(jì)中考慮獲取具CP基因 cDNA 的質(zhì)粒，所以實(shí)際引物設(shè)計(jì)中包含了與質(zhì)粒載體連接的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，但這并不影響PCR 擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，考慮到上下游引物多設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，在實(shí)際擴(kuò)增中擴(kuò)增 的預(yù)期片段長(zhǎng)度為491bp)，設(shè)計(jì)的引物序列為： 5' 上游引物：5' CCG GAA TTC GTC TTA CAG TAT CAC TAC 3' ； 3'下游引物：5' TAC AAG CTT AGT TGC AGG ACC AGA GG3'。
[0017] 引物合成由北京塞百勝生物工程公司按我們?cè)O(shè)計(jì)進(jìn)行合成，用DDW稀釋成20uM。
[0018] 1. 2普通PCR擴(kuò)增--定量PCR檢測(cè)前的初步檢測(cè)條件探試 用所設(shè)計(jì)合成的引物，首先用感病煙草所提總RNA以及提純TMV-RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后在普通PCR儀上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)行設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增成功性及特異性初步考 證，并對(duì)實(shí)際構(gòu)建體系中對(duì)擴(kuò)增可能具有影響的一些因素的進(jìn)行實(shí)際RT-PCR影響的定性。 反應(yīng)條件如下： 反轉(zhuǎn)錄（RT) :15u體系中分別加入以下成分： 3ul 5 X RT Buffer, Iul IOmM dNTP, 0.5ul 3'端下游引物， 0. 5ul RNAsin(40u/ul), TMV-RNA 模板， Iul M-MLV (200U/ul，promega 產(chǎn)品）， DEPC處理水補(bǔ)足15ul，， 加好后混勻短暫點(diǎn)時(shí)離心，42°C水浴中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50min，65°C /10 min后置于冰箱中 待用。
[0019] PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系：25ul體系中加入以下成分： dd H2O 17. 7ul 10 X PCR Buffer (含 Mg+2 ) 2.5 ul dNTP(10mM/each) 0. 5ul 5'上游引物：1. 0 ul 3'下游引物：1. Oul 反轉(zhuǎn)錄（RT)產(chǎn)物：2ul Taq 聚合酶：0.3ul(5U/ul Takara) 擴(kuò)增程序：加好后短暫點(diǎn)式離心，在PCR儀上按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于包括RNA提取、PCR反應(yīng)、 檢測(cè)步驟，具體包括： A、RNA提?。禾崛「胁煵菘俁NA，提純TMV-RNA反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA; B、PCR反應(yīng)：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，以TMV外殼蛋白基因系列作為病毒核酸檢測(cè)的指 標(biāo)，設(shè)計(jì)合成特異引物，以cDNA為作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收和純化PCR產(chǎn)物； C、 檢測(cè)：對(duì)回收和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于A步驟 中所述的反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：3ul 5 X RT Buffer，lul IOmM dNTP，0. 5ul 3'端下游引 物，0? 5ul RNAsin (40u/ul)，TMV-RNA模板，Iul M-MLV (200U/ul, promega產(chǎn)品），加DEPC 處理水補(bǔ)足15ul。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于A步驟 中所述的反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為42~65°C水浴中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50~65min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于B步驟 中所述的特異引物為： 5'上游引物：5'CCGGAAITCGTCTTACAGTATCACTAC3'; 3' 下游引物：5'TACAAGCTTAGTTGCAGGACCAGAGG3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于B步驟 中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10 X PCR Buffer(含Mg+2)2.5 ul，dNTP(10mM/each) 0.5ul，5'上游引物L(fēng)O ul，3'下游引物1.0ul，Taq聚合酶0.3ul (5U/ul Takara)，加 ddH20補(bǔ)充至25yl。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于B步驟 中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min，進(jìn)行以下循環(huán)：94°C變性30 sec， 50°C退火30 sec，72°C延伸40 sec，2個(gè)循環(huán)后再接著以下循環(huán)反應(yīng)：94°C變性30 sec ，55°C退火30 sec，72°C延伸40 sec，33個(gè)循環(huán)后，94°C延伸IOmin0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于C步 驟中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)的反應(yīng)體系為：2ul 10XPCR Buffer(含Mg+2)， 0. 2ul dNTP(10mM/each)，0? 4 ul上游引物，0? 4ul下游引物，0? 2ul Taq聚合酶，2ul RNA反轉(zhuǎn)錄（RT)產(chǎn)物，0. 5 ul熒光染料，加ddH20補(bǔ)充至20ul。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，其特征在于C步 驟中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min后開(kāi)始以下循環(huán)： 94°C變性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，39 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸 5min，最 后制作62°C到97°C擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的方法，包括RNA提取、PCR反應(yīng)、檢測(cè)步驟，具體包括：提取感病煙草總RNA，提純TMV-RNA反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；根據(jù)Gen bank數(shù)據(jù)庫(kù)，以TMV外殼蛋白基因系列作為病毒核酸檢測(cè)的指標(biāo)，設(shè)計(jì)合成特異引物，以cDNA為作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收和純化PCR產(chǎn)物；對(duì)回收和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明可直接應(yīng)用于體系構(gòu)建，進(jìn)行體系中病毒核酸的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果具有可靠性。同時(shí)也顯示出采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增循環(huán)的Ct值變化來(lái)進(jìn)行天然物抗病毒藥理和活性篩選的良好前景。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68, C12R1-94
【公開(kāi)號(hào)】CN104726617
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510174302
【發(fā)明人】陳齊斌, 滕曉紅, 吳德喜, 楊永紅, 蘇發(fā)武, 趙明富, 馬曉東, 李重九
【申請(qǐng)人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月14日