專利名稱：抗高血壓活性肽ivp的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩個(gè)抗高血壓活性肽，具體涉及一種通過(guò)構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative Structure-Activity Relationships, QSAR)數(shù)學(xué)模型和體外和體內(nèi)生物活性實(shí)驗(yàn)篩選出兩個(gè)抗高血壓的合成三肽。
背景技術(shù)：
我國(guó)高血壓患病率的態(tài)勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻，當(dāng)前常見(jiàn)的治療高血壓的藥物有以下六種利尿劑(可能引起低血鉀癥，影響糖代謝，使糖耐量下降)、3 —阻滯劑(可帶來(lái)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及血管系統(tǒng)的不良反應(yīng))、a 一阻滯劑、鈣拮抗劑(會(huì)導(dǎo)致水腫、頭痛、潮紅、多尿、低血壓以及心臟傳導(dǎo)受阻)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素II受體阻滯劑(可引起干咳、血鉀高、甚至血管性水腫)。由于大部分藥物都有副作用，所以科學(xué)家們一直致力于開(kāi)發(fā)含有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3. 4. 15. I)活性的小肽的功能食品，使高血壓患者得益。ACE酶是一種外肽酶，是調(diào)節(jié)血壓的重要因子，主要存在于血管的內(nèi)皮細(xì)胞，在肺毛中含量最為豐富。根據(jù)文獻(xiàn)趙海珍，陸兆新，劉戰(zhàn)民等.天然食品來(lái)源的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2004，25(5) :315-317及文獻(xiàn)陳強(qiáng).血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用治療腎小球疾病[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2001，10(3) :274-277的報(bào)道，ACE酶的主要作用有兩個(gè)，一個(gè)是使得血管緊張素I (AngI)轉(zhuǎn)化為血管緊張素II (Ang II)，另外一個(gè)是使緩激肽失活，以這兩個(gè)作用影響腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)來(lái)完成血壓的調(diào)節(jié)。血管緊張素II可以與血管組織中的特異性受體AT1相結(jié)合，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)作用，使得血管收縮，收縮腎小球出球小動(dòng)脈，使腎血流量下降，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓升高，緩激肽可以通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)作用，使血管舒張，舒張腎小球出球小動(dòng)脈，使腎血流量上升，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供兩種高效低毒的抗高血壓活性肽。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明使用以下技術(shù)方案兩種抗高血壓活性肽，其氨基酸序列分別為繳氨酸(Val)-異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱VIP)和異亮氨酸(lie)-纈氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱IVP)。本發(fā)明選擇了氨基酸的疏水性和氨基酸的空間占位(以分子量為衡量基準(zhǔn))建立了 ACE酶抑制效果(LogIC50)與乳源性抑制肽(3aa)的數(shù)學(xué)模型 Y=0. 560-0. 540*Xn_0. 007*X21_0. 054*X12+0. 010*X22+0. 696*X13+0. 006*X23。分析抗高血壓活性肽的結(jié)構(gòu)特征，如C-末端的氨基酸殘基的疏水性和其倒數(shù)第二個(gè)氨基酸的拓?fù)淇臻g結(jié)構(gòu)，以及結(jié)合已知的ACE抑制二肽樣本集，確定乳源抗高血壓小肽的篩選原則C_末端具有疏水性，以Pro、Phe> Trp和Tyr為主；C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸具有較小的拓?fù)淇臻g。選擇待測(cè)三肽序列，并通過(guò)構(gòu)建的QSAR數(shù)學(xué)模型，對(duì)其理論LogIC5tl值進(jìn)行分析，根據(jù)其值的大小確定體內(nèi)外活性檢測(cè)候選小肽序列并進(jìn)行合成，其中，Xu代表的是結(jié)構(gòu)性質(zhì)，其中，j = 1，2，3，代表的是乳源三肽中氨基酸的位置，i=l，2，分別代表的是氨基酸的疏水性和分子量，疏水性均取了正值來(lái)帶入方程進(jìn)行運(yùn)算。所選取的ACE酶抑制活性肽均取自牛奶中主要的蛋白質(zhì)，所選取出的這些小肽的LogIC50均為正值，即意味著具有ACE酶抑制活性，根據(jù)數(shù)學(xué)方程可知，C末端第一位氨基酸的疏水性具有重要的影響作用，因?yàn)?，在所篩選出來(lái)的小肽中，首位為Ile和Val的小肽的抑制效果較好，即LogIC5tl的值較小。從中篩選出了 6個(gè)計(jì)算值比較理想的三肽分子異亮氨酸(Ile)-纈氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱IVP)，LogIC50=O. 2 ;異亮氨酸(Ile)-天冬酰胺(Asn)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱INP), LogIC50=O. 3878 ;異亮氨酸(Ile)-谷氨酰胺(Gln)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱 IQP)，LogIC50=O. 5278;纈氨酸(Val)-異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱 VIP)，LogIC50=O. 5855 ;纈氨酸(Val)-亮 氨酸(Leu)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱 VLP)，LogIC50=O. 6233 ;賴氨酸(Lys)-賴氨酸(Lys)-酪氨酸(Tyr)(簡(jiǎn)稱 KKY)，LogIC50=O. 674)。再通過(guò)體外和體內(nèi)生物活性驗(yàn)證篩選出2個(gè)抗高血壓能力最強(qiáng)的合成三肽IVP和VIP。較佳的，本發(fā)明所述三肽分子為直鏈。本發(fā)明所述三肽可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，如采用固相多肽合成方法合成，以VIP為例，包括以下具體步驟首先在脯氨酸二氯樹(shù)脂上接入芴甲氧羰基異亮氨酸，同時(shí)加入TBTU和DIEA進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)時(shí)間為30分鐘，并用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次去除末端芴甲氧羰基基團(tuán)，然后用六氫吡啶進(jìn)行脫保護(hù)，脫保護(hù)結(jié)束后再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次。抽干后加入芴甲氧羰基纈氨酸，TBTU和DIEA進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)時(shí)間為30分鐘，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次，用六氫吡啶進(jìn)行脫保護(hù)，再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次抽干，最后通過(guò)半制備型反相高效液相色譜(反相柱VYDAC —C18柱(4. 6 X 250mm，5 iim);線性梯度溶液A (溶解于分析純級(jí)乙腈的0. l%(v/v)三氟乙酸)，梯度5%-30% (v/v) 25分鐘、100% (v/v) 25. I分鐘、停止30分鐘;溶液B (溶解于純水的0. 1% (v/v)三氟乙酸)，梯度95%-70% (v/v)25分鐘、0%25. I分鐘、停止30分鐘；流速1. 0毫升/分鐘；分離收集洗脫峰，凍干后備用。IVP、INP、IQP、VLP和KKY的制備方法可同VIP制備方法，除了將VIP制備過(guò)程中所用氨基酸脯氨酸、異亮氨酸和纈氨酸替換為所需制備的三肽分子中相對(duì)應(yīng)的位置上的氨基酸即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明是通過(guò)構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系(QuantitativeStructure-Activity Relationships, QSAR)數(shù)學(xué)模型,利用乳源蛋白一級(jí)信息，篩選出6個(gè)計(jì)算值比較理想的具有抗高血壓功能的三肽分子，并通過(guò)體外和體內(nèi)生物活性驗(yàn)證篩選出2個(gè)抗高血壓能力最強(qiáng)的合成三肽。本發(fā)明獲得的具有抗高血壓能力的合成三肽，可分別用于抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE酶)的活性，降低血管緊張素II (Ang II)的生成水平，達(dá)到降低血壓的效果。其存在于乳源性蛋白中且抗高血壓活性肽具有高效低毒的特點(diǎn)，對(duì)于開(kāi)發(fā)治療高血壓藥物和功能食品有著較好的應(yīng)用前景。由于能通過(guò)人工化學(xué)合成技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模制備，為將來(lái)藥物開(kāi)發(fā)中低成本和高產(chǎn)率的制備奠定了基礎(chǔ)。


圖I為具體實(shí)施方式
中大鼠喂養(yǎng)異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(簡(jiǎn)稱 IPP) (I. 5mg/kg)后收縮壓(Systolic Blood Pressure, SBP)與時(shí)間關(guān)系。圖2為具體實(shí)施方式
中大鼠喂養(yǎng)IVP (I. 5mg/kg)后收縮壓(Systolic BloodPressure, SBP)與時(shí)間關(guān)系。圖3為具體實(shí)施方式
中大鼠喂養(yǎng)VIP (I. 5mg/kg)后收縮壓(Systolic BloodPressure, SBP)與時(shí)間關(guān)系。圖4為具體實(shí)施方式
中空白組大鼠收縮壓收縮壓(Systolic Blood Pressure,SBP)與時(shí)間關(guān)系。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :三肽分子抗高血壓活性測(cè)試·實(shí)驗(yàn)材料新西蘭大白兔上海交通大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；20周齡雄性高血壓模式大鼠(SHR):上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；VPP、IPP、KKY、IVP、INP、IQP、VLP、VIP，吉爾生化(上海)有限公司制備;微量移液器(100 1000 u L, 20^200 u L, 10^100 u L, 0. 5 IOy L)，Eppendorf Ltd ;過(guò)濾器(O 50mm),上海醫(yī)藥工業(yè)研究所；微孔濾膜(①50mm,孔徑為0. 22 ii m),上海摩速科學(xué)器材有限公司；Centrifuge 5415 D小型高速離心機(jī)，EppendorfLtd ;AKTApurifier 10 層析系統(tǒng)，Superdex 30 prep grade 層析柱(GE Healthcare, USA)；Zorbax SB-C18反相色譜柱(Agilent);摩爾超純水機(jī)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；GL-22M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器廠JY2002型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器，上海醫(yī)用核子儀器廠；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；Lab Dancer試管振蕩器，IKA Works Guangzhou ；ElectroluxB⑶-252T型冰箱，伊萊克斯(中國(guó))電器有限公司；DW-HW138型超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；分析天平，Meitelei-tolido, German ;大鼠血壓計(jì)SoftronBP_98A,北京軟隆生物技術(shù)有限公司。合成三肽的體外ACE酶抑制活性結(jié)果分析馬脲酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL)在 ACE 的催化下快速分解產(chǎn)生馬尿酸(Hippuric Acid, HA)和二肽histidyl-leucine (HL),加入ACE抑制劑后，ACE的活性受到抑制，HA和HL的生成量減少，通過(guò)RP-HPLC方法(色譜柱=ZorbaxSB-C18 柱(80 A, 5 y m, 4. 6mmX 250mm ;流動(dòng)相20%(v/v)分析純乙腈+0. l%(v/v)三氟乙酸；流速I. 0毫升/分鐘)測(cè)定228nm下HA的生成量，按公式I評(píng)價(jià)ACE抑制劑對(duì)ACE的抑制率。ACE抑制率(%) =IOOX (A對(duì)照一A樣品)/ (A對(duì)照一A空白)(公式I) A對(duì)照IOOmM硼酸鈉緩沖液(BBS，pH 8. 3)代替三肽時(shí)生成HA的峰面積；A樣品，三肽樣品時(shí)生成HA的峰面積；A空白，鹽酸先于HHL加入時(shí)IOOmM硼酸鈉緩沖液(BBS，pH8. 3)代替三肽時(shí)生成HA的峰面積。反應(yīng)體系和條件見(jiàn)表I :表 I
權(quán)利要求
1.ー種抗高血壓活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列為異亮氨酸-纈氨酸-脯氨酸。
2.如權(quán)利要求I所述的抗高血壓活性肽在制備治療或預(yù)防高血壓的藥物和食物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗高血壓活性肽，其氨基酸序列為異亮氨酸-纈氨酸-脯氨酸；本發(fā)明是通過(guò)構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系數(shù)學(xué)模型，利用乳源蛋白一級(jí)信息，并通過(guò)體外和體內(nèi)生物活性驗(yàn)證篩選抗高血壓能力最強(qiáng)的合成三肽，本發(fā)明獲得的具有抗高血壓能力的合成三肽，可分別用于抑制ACE酶的活性，降低AngII的生成水平，達(dá)到降低血壓的效果。其存在于乳源性蛋白中且抗高血壓活性肽具有高效低毒的特點(diǎn)，對(duì)于開(kāi)發(fā)治療高血壓藥物和功能食品有著較好的應(yīng)用前景；由于能通過(guò)人工化學(xué)合成技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模制備，為將來(lái)藥物開(kāi)發(fā)中低成本和高產(chǎn)率的制備奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A23L1/305GK102786580SQ20121024817
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者張建華, 沈珊齊, 索庚, 薛婷, 趙艷云, 鄧云, 金雅芳, 錢炳俊, 駱亞麗 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)