專利名稱：一種鱇浪白魚心臟細胞系的構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種錬浪白魚心臟細胞系的構建方法，屬于淡水生物細胞培養(yǎng)技術。
背景技術：
錬浪白魚Anabarilius grahami 隸屬于鯉形目 Cypriniforms、鯉科 Cyprinidae、白魚屬Anabarilius,俗稱白魚,是僅產(chǎn)于云南撫仙湖的珍稀魚種,是云南四大名魚之一。此魚肉細嫩鮮美，軟刺薄鱗，清香可口。該魚曾是撫仙湖的主產(chǎn)魚種，多年來，由于外來魚種入侵，以及水質惡化，捕撈過度，已處于瀕危邊緣。雖然1999年以來，中科院昆明動物研究所人工繁殖成功，保護并挽救了這一珍稀魚種，使其近年產(chǎn)量保持平穩(wěn)。但野生種群仍在銳減，且并未給出基于錬浪白魚自身的種群衰減原因。而細胞系的建立可望作為環(huán)境毒理學研究環(huán)境污染物的模型，對淡水水體中存在的各種環(huán)境污染物，包括基因毒物、致癌物和環(huán)境激素等，進行污染檢測和安全性評價；還可應用于魚類病毒的分離、繁殖、病毒疫苗研制，在分子細胞水平尋找種群衰減的原因。 經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明的相同報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行的錬浪白魚心臟細胞系的構建方法，以彌補現(xiàn)有技術的不足，滿足對錬浪白魚理論研究以及在環(huán)境毒理學中的應用。本發(fā)明的錬浪白魚心臟細胞系的構建方法，其具體步驟如下a.制備細胞培養(yǎng)液選擇L-15培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清的終濃度為20%,人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為3 ng/ml,硫酸軟骨素的濃度為0.5吒/ml。pH值為7. 0-7. 4，置于4°C冰箱中保存，備用；b.原代培養(yǎng)先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒，以75%酒精再次消毒，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其心臟，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡心臟組織，其中青霉素的濃度為200 IU/ml，鏈霉素的濃度為200呢/ml，慶大霉素的濃度為100吒/ml，浸泡20 min后，將心臟組織用PBS+200 IU/ml青霉素+200^g/ml鏈霉素+100 ^g/ml慶大霉素的溶液清洗三次，剪成組織小塊，用0. 5%透明質酸酶和0. 2%11型膠原酶聯(lián)合消化30 min,收集心臟組織塊，并將其均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，28°C培養(yǎng)箱中，正置干貼過夜，次日加入L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5吒/ml硫酸軟骨素+100 IU/ml青霉素+100呢/ml鏈霉素的培養(yǎng)液5 ml，在28°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每隔3天半量更換培養(yǎng)液，第8天細胞開始遷出，第45天細胞長成單層；C.繼代培養(yǎng)待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用不含抗生素的PBS溶液清洗兩遍，加入0.125%的胰蛋白酶I. 5 ml，消化2 min，細胞變圓后，加入L_15+20%FBS+3 ng/mlbFGF+O. 5 l^g/ml硫酸軟骨素+100 IU/ml青霉素+100 l^g/ml鏈霉素的細胞培養(yǎng)液8. 5 ml，用吸管吹打，制成細胞懸液；然后接種于兩個新培養(yǎng)瓶內(nèi)，原貼有心臟組織塊的培養(yǎng)瓶亦加入 5 ml L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5 l^g/ml 硫酸軟骨素 +100 IU/ml 青霉素 +100呢/ml鏈霉素細胞培養(yǎng)液，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以后7天傳代一次，傳至第2代時，培養(yǎng)液中的抗生素濃度減半，傳至第3代時，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液替換成L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5呢/ml硫酸軟骨素細胞培養(yǎng)液5 ml，傳至第8代時，將培養(yǎng)液中血清含量降至10%，此時，細胞系建立成功。本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。本發(fā)明的有益效果在于I、操作簡便易行； 2、構建的錬浪白魚心臟細胞系(AGH)細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)為成纖維樣細胞，能連續(xù)傳代40代以上，直接用于環(huán)境毒理學研究環(huán)境污染物的模型，進行污染檢測和安全性評價；還能應用于魚類病毒的分離、繁殖、病毒疫苗研制。3、該構建方法也適用于其他魚類構建心臟的細胞系
具體實施例方式本發(fā)明的錬浪白魚心臟細胞系的構建方法，該構建方法的具體步驟如下a.制備細胞培養(yǎng)液選擇L-15培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清的體積占總體積的終濃度為20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為3 ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為0.5吒/ml。pH值為7. 0-7. 4，置于4°C冰箱中保存，備用；b.原代培養(yǎng)先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒，以75%酒精再次消毒，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其心臟，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡心臟組織，其中青霉素的濃度為200 IU/ml，鏈霉素的濃度為200呢/ml，慶大霉素的濃度為100吒/ml，浸泡20 min后，將心臟組織用PBS+200 IU/ml青霉素+200^g/ml鏈霉素+100 ^g/ml慶大霉素的溶液清洗三次，剪成組織小塊，用0. 5%透明質酸酶和0. 2%11型膠原酶聯(lián)合消化30 min,收集心臟組織塊，并將其均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，28°C培養(yǎng)箱中，正置干貼過夜，次日加入L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5吒/ml硫酸軟骨素+100 IU/ml青霉素+100呢/ml鏈霉素細胞培養(yǎng)液5 ml，在28°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每隔3天半量更換培養(yǎng)液，第8天細胞開始遷出，第45天細胞長成單層；c.繼代培養(yǎng)待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用不含抗生素的PBS溶液清洗兩遍，加入0.125%的胰蛋白酶I. 5 ml，消化2 min，細胞變圓后，加入L_15+20%FBS+3 ng/mlbFGF+0. 5 l^g/ml硫酸軟骨素+100 IU/ml青霉素+100 l^g/ml鏈霉素細胞培養(yǎng)液8. 5 ml，用吸管吹打，制成細胞懸液；然后接種于兩個新培養(yǎng)瓶內(nèi)，原貼有心臟組織塊的培養(yǎng)瓶亦加入5 ml L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5 l^g/ml 硫酸軟骨素 +100 IU/ml 青霉素 +100 l^g/ml鏈霉素的培養(yǎng)液，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以后7天傳代一次，傳至第2代時，培養(yǎng)液中的抗生素濃度減半，傳至第3代時，培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液替換成L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5呢/ml硫酸軟骨素的細胞培養(yǎng)液5 ml，傳至第8代時，將培養(yǎng)液中血清含量降至10%，此時，細胞系建立成功。d.細胞凍存與復蘇對上述構建的心臟細胞進行凍存，配置細胞凍存液，分別取胎牛血清、L-15和DMSO,按5:3. 5:1. 5的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。細胞凍存取處于對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)上述胰酶消化后獲得細胞懸液，1000 rpm離心10 min，棄掉上清液。向細胞沉淀中加入適量配置好的細胞凍存液，重懸，使細胞濃度至3X IO6個/ml，將I ml細胞懸液轉移至I. 8 ml無菌凍存管中。按一定程序降溫，4°C冰箱60 min，-20°C冰箱45 min，-80°C冰箱過夜，最后放入液氮中長期保存。對上述凍存的細胞進行復蘇，將凍存管從液氮罐中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌條件下將解凍細胞轉移至10 ml離心管中，1000 rpm離心10 min, 去除上清，收集細胞。用10 ml L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5吒/ml硫酸軟骨素+100 IU/ml青霉素+100呢/ml鏈霉素細胞培養(yǎng)液重懸細胞，并轉移至兩個細胞培養(yǎng)瓶中，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長成單層后，按上述方法(步驟c)傳代，此時換成L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5 Mg/ml硫酸軟骨素培養(yǎng)液，每瓶5 ml。
權利要求
1.一種錬浪白魚心臟細胞系的構建方法，其特征在于該構建方法的具體步驟如下 a.制備細胞培養(yǎng)液 選擇L-15培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清的終濃度為20%,人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為3 ng/ml,硫酸軟骨素的濃度為O. 5 Pg/ml。pH值為7. 0-7. 4，置于4°C冰箱中保存，備用； b.原代培養(yǎng) 先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min，對魚進行整體消毒，以75%酒精再次消毒，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其心臟，置于12孔板中，加入PBS+200 IU/ml青霉素+200 Pg/ml鏈霉素+100 Pg/ml慶大霉素的溶液浸泡心臟組織,浸泡20 min后，將心臟組織用PBS+200 IU/ml青霉素+200 Pg/ml鏈霉素+100 Pg/ml慶大霉素的溶液清洗三次，剪成組織小塊，用O. 5%透明質酸酶和O. 2%11型膠原酶聯(lián)合消化30 min，收集心臟組織塊，并將其均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，28°C培養(yǎng)箱中，正置干貼過夜，次日加入L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5 Pg/ml 硫酸軟骨素+100 IU/ml 青霉素+100 gg/ml 鏈霉素的細胞培養(yǎng)液5ml，在28°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每隔3天半量更換培養(yǎng)液，第8天細胞開始遷出，第45天細胞長成單層； c.繼代培養(yǎng) 待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用不含抗生素的PBS溶液清洗兩遍，加入O. 125% 的胰蛋白酶 I. 5 ml，消化 2 min，細胞變圓后，加入 L_15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5Pg/ml硫酸軟骨素+100 IU/ml青霉素+100 Pg/ml鏈霉素的細胞培養(yǎng)液8. 5 ml,用吸管吹打，制成細胞懸液；然后接種于兩個新培養(yǎng)瓶內(nèi)，原貼有心臟組織塊的培養(yǎng)瓶亦加入L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0. 5 Pg/ml 硫酸軟骨素 +100 IU/ml 青霉素 +100 Pg/ml 鏈霉素的細胞培養(yǎng)液5 ml,在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以后7天傳代一次，傳至第2代時,培養(yǎng)液中的抗生素濃度減半，傳至第3代時，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液替換成L-15+20%FBS+3 ng/mlbFGF+0. 5 μδ/πι1硫酸軟骨素的細胞培養(yǎng)液5ml，傳至第8代時，將培養(yǎng)液中血清含量降至10%，此時，細胞系建立成功。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鱇浪白魚心臟細胞系的構建方法，屬于淡水生物細胞培養(yǎng)技術領域。該方法以鱇浪白魚心臟組織為材料，清洗剪碎后，采用透明質酸酶和II型膠原酶聯(lián)合消化獲得游離心臟細胞和疏松組織塊，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含有胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子和硫酸軟骨素的L-15培養(yǎng)液，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3天半更換培養(yǎng)液，待細胞長成單層后，采用胰蛋白酶消化法進行傳代。本發(fā)明的有益效果在于1、操作簡便；2、構建的鱇浪白魚心臟細胞系的細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)為成纖維樣細胞，能連續(xù)傳代40代以上，直接用于環(huán)境毒理學研究環(huán)境污染物的模型，進行污染檢測和安全性評價；3、該方法也適用于其他魚類構建心臟細胞系。
文檔編號C12N5/077GK102766595SQ20121028847
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權日2012年8月7日
發(fā)明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛, 陳小勇 申請人:中國科學院昆明動物研究所