專利名稱：一種微量四環(huán)素類抗生素的熒光檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微量四環(huán)素類抗生素的熒光檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類抗生素是目前臨床使用最廣泛的廣譜類抗生素之一，常見的如四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素等。此外，由于四環(huán)素類抗生素具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高飼料利用率的作用，因此大約70%的抗生素被用作飼料添加劑用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。通過各種代謝途徑和遷移轉(zhuǎn)化途徑，四環(huán)類抗生素已經(jīng)在土壤、地表水、地下水等環(huán)境介質(zhì)檢出，而且該類物質(zhì)具有慢性毒性和積蓄毒性等危害，已經(jīng)對(duì)人體和生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)巨大威脅，如導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌或病毒的產(chǎn)生。因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、靈敏和高選擇性的檢測(cè)技術(shù)或方法對(duì)于監(jiān)控環(huán)境中四環(huán)素類抗生素污染等具有重要意義。傳統(tǒng)的四環(huán)素類檢測(cè)方法如色譜法、光譜法、微生物法、以及免疫法等由于其固有的缺陷，難以應(yīng)對(duì)當(dāng)前環(huán)境檢測(cè)需求?；诜肿佑≯E技術(shù)的傳感器對(duì)四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)具有高靈敏性和高選擇性的特點(diǎn)，但分子印跡膜制備過程復(fù)雜，檢測(cè)步驟繁瑣，影響到該方法的穩(wěn)定性。近年來(lái)，核酸適配子作為核酸探針的一種，能與對(duì)應(yīng)的配體靶物質(zhì)進(jìn)行高親和特異性結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)中。人們也已經(jīng)成功篩選和解析出對(duì)某些四環(huán)素類抗生素，如對(duì)四環(huán)素和土霉素具有特異性識(shí)別能力的核酸適配子(Bioorganic &Medicinal Chemistry, 2008, 16(15)， 7245-7253 ;Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008，16(3)，1254-1261)。已有文獻(xiàn)針對(duì)核酸適配子與土霉素的特異性識(shí)別作用報(bào)道了幾種檢測(cè)方法，如電化學(xué)檢測(cè)法(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, 33(1)，31-37),納米金比色法(Biosensors and Bioelectronics, 2010, 26(4)，1644-1649)，但這些方法操作復(fù)雜，背景噪聲高，穩(wěn)定性和靈敏性差。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是一種新興的常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，以環(huán)狀DNA為模板，在某些特殊DNA聚合酶催化下，將一個(gè)短的DNA引物擴(kuò)增成含有成百上千的重復(fù)片段的長(zhǎng)鏈DNA，與傳感器中的信號(hào)聯(lián)系后實(shí)現(xiàn)明顯的信號(hào)放大作用，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)用于小分子檢測(cè)還未見報(bào)道。此外，石墨烯具有優(yōu)異的熒光淬滅能力，有效降低熒光傳感器的噪聲值。據(jù)此建立一種利用滾環(huán)擴(kuò)增原理的信號(hào)放大作用以及基于石墨烯構(gòu)建的分子信標(biāo)的高選擇性用于分析測(cè)定痕量四環(huán)素類抗生素的熒光分析方法，同時(shí)為其他小分子物質(zhì)或污染物的檢測(cè)提供新的方法，應(yīng)用前景非常廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測(cè)四環(huán)素類抗生素方法操作復(fù)雜，靈敏性差的不足，提供了一種高靈敏、高選擇性檢測(cè)微量四環(huán)素類抗生素的方法。在目標(biāo)物分子存在下，目標(biāo)物首先與適配子特異性結(jié)合，并引起適配子構(gòu)型發(fā)生變化，形成較穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)，此時(shí)，該構(gòu)型的適配子很難與DNA引物結(jié)合，因此游離的DNA引物只能與加入的環(huán)狀DNA模板結(jié)合，在Phi29 DNA聚合酶和dNTPs等存在下，引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，DNA引物擴(kuò)增成成百上千含重復(fù)序列的長(zhǎng)鏈DNA，該滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)一步與石墨烯基分子信標(biāo)中的DNA探針結(jié)合，阻礙DNA探針中的染料與石墨烯之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過程，體系的熒光逐漸恢復(fù)，而且恢復(fù)程度與體系中目標(biāo)物的濃度在一定范圍內(nèi)正相關(guān)，從而為土霉素的定量分析提供依據(jù)。本發(fā)明是一種四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法，通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種四環(huán)素類抗生素的熒光檢測(cè)方法，具體步驟如下:(I) 25 150 nM適配子探針與不同濃度的四環(huán)素類抗生素充分混合，1(T40°C反應(yīng)20 40 min后，加入25 150 nM DNA引物，并在37°C反應(yīng)l(T60min。加入100 300 nM環(huán)狀DNA模板，25 40°C反應(yīng)0.5 2 h，分別加入0.025 0.1 U/μ L Phi29 DNA聚合酶，50 200 nMdNTPs在25 40°C反應(yīng)5 h，水浴加熱到60 70 °C保溫10 20 min終止反應(yīng)。(2)20^200 nM染料標(biāo)記的DNA探針與2 20 Pg/mL石墨烯混合反應(yīng)10 60 min,在
4°C保存?zhèn)溆谩?3)取步驟(I)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟(2)制備的2(Γ200 nM石墨烯基分子信標(biāo)混合，體積比控制在1:4 14，室溫下測(cè)定體系中標(biāo)記染料的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線，測(cè)定體系中染料的熒光強(qiáng)度時(shí)間變化曲線，根據(jù)測(cè)量土霉素標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。(4)對(duì)不同樣品重復(fù)步驟(I)、步驟(2)和步驟(3)進(jìn)行檢測(cè)，得到的檢測(cè)結(jié)果與步驟(3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行對(duì)比，得到樣品中四環(huán)素類抗生素含量。上述的熒光檢測(cè)方法，所述的四環(huán)素類抗生素為:土霉素、四環(huán)素。上述的熒光檢測(cè)方 法，所述的環(huán)狀DNA模板的制備步驟如下:磷酸化的2飛μ M padlock探針與4 8 μ M DNA引物充分混合，水浴加熱到80 95°C，保持5 15 min，然后退火冷卻到37°C保溫0.5 2 h，加入2 6 U/μ L Τ4 DNA連接酶，1(T25°C過夜反應(yīng)。分別加入0.05、.2 U/μ L核酸外切酶I，和0.05、.2 U/μ L核酸外切酶III在37°C保溫0.5^2 h降解未反應(yīng)的單鏈DNA引物，水浴加熱到8(T95°C并保溫5^15 min終止反應(yīng)。最后用粒徑10 K的納濾膜對(duì)制備的環(huán)狀DNA模板分離純化，除去大分子酶，得到的環(huán)狀DNA模板分散在緩沖液中，并于_20°C保存?zhèn)溆?。上述的熒光檢測(cè)方法，所述的石墨烯采用傳統(tǒng)水熱還原石墨氧化物的方法制備。本發(fā)明具有如下特點(diǎn):(I)靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)0.87nM (S/N=3)。(2)選擇性高，噪聲值低。(3)操作簡(jiǎn)單，與傳統(tǒng)的適配子電化學(xué)傳感器相比，該方法避免了對(duì)適配子的化學(xué)修飾或標(biāo)記過程，有利于保持適配子對(duì)目標(biāo)物的結(jié)合能力。(4)整個(gè)反應(yīng)過程在水相中進(jìn)行，避免了電化學(xué)檢測(cè)過程中存在的固定、孵化、沖洗等步驟。


圖1是本發(fā)明所述的檢測(cè)微量四環(huán)素類抗生素的方法過程示意圖。圖中:a適配子，bDNA引物，c四環(huán)素類抗生素分子，d環(huán)狀DNA模板(padlock探針)，ePhi29 DNA聚合酶，f石墨烯分散液，gFAM標(biāo)記的DNA探針。圖2是本發(fā)明的方法獲得的檢測(cè)土霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1，牛奶樣品中土霉素含量的測(cè)定(I)環(huán)狀DNA模板的制備取5 μ L磷酸化的padlock探針(最終濃度4 μ M)與10 μ L DNA引物(最終濃度5.6 μΜ)在50 uL 1ΧΤ4 DNA連接酶緩沖液中充分混合，水浴加熱到95 ° C，并保持5 min，然后退火冷卻到37 ° C保溫I h，然后加入T4 DNA連接酶(最終濃度3.5 U/uL),5 yL 0.05% BSA，和50 yL高純水，16 ° C過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，分別加入I yL10 XExonuclease I 緩沖液，I μ L 10 XExonuclease I 緩沖液，Exonuclease I (最終濃度 0.1 U/μ L)，和 Exonuclease III (最終濃度 0.1 U/yL)在 37 ° C 保溫 I h 降解未反應(yīng)的單鏈DNA引物，水浴加熱到90 ° C并保溫10 min終止反應(yīng)。最后用納濾膜(10 K，美國(guó)Pall公司)對(duì)制備的環(huán)狀DNA模板分離純化，除去大分子酶，得到的環(huán)狀DNA模板分散在PBS緩沖液(20 mM，pH= 7.4)中，并于-20 ° C保存?zhèn)溆谩?2)石墨烯的制備石墨烯采用傳統(tǒng)水熱還原方法制備，將40 mL 0.1 mg/mL石墨氧化物水溶液轉(zhuǎn)入襯底為聚四氟的水熱反應(yīng)釜中，180 ° C反應(yīng)8 h，自然冷卻至室溫后備用。(3)石墨烯基分子信標(biāo)的制備取100 nM FAM染料標(biāo)記的DNA探針與8 Pg/mL步驟(2)制備的石墨烯在PBS緩沖液(20 mM，含100 mM NaCl，pH 7.4)中混合，反應(yīng)30 min后在4 ° C保存?zhèn)溆谩?4)檢測(cè)方法取10 μ L適配子探針(最終濃度75 nM)與10 μ L不同濃度的土霉素在40 μ L緩沖液(20 mM Tris-HCl，含 100 mM NaCl，2 mM MgCl2, 5 mM KCL, I mM CaCl2,0.02% Tween20,pH 7.4)中充分混合，25 ° C反應(yīng)20 min后，加入10 μ L DNA引物(最終濃度60 nM),并在37 ° C反應(yīng)30 min，然后加入20 μ L步驟(I)制備的環(huán)狀DNA模板(最終濃度170nM)，40 ° C反應(yīng)I h，最后分別加入100 μ L lXPhi29 DNA聚合酶緩沖液，dNTPs (最終濃度0.5 mM),Phi29 DNA聚合酶(最終濃度4 U/μ L)和0.2 mg/mL BSA，在30 ° C反應(yīng)5h后，水浴加熱到65 ° C保溫10 min終止反應(yīng)。取滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物加入步驟(3)制備的石墨烯基分子信標(biāo)，體積比控制在1:9，室溫下測(cè)定體系中FAM染料的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為494 nm,發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定為518 nm。( 5)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制步驟(4)中隨著樣品中土霉素濃度的增加，傳感器的熒光恢復(fù)程度和速率逐漸增力口，在10-100 nM范圍內(nèi)，熒光恢復(fù)速率與土霉素濃度有較好的線性關(guān)系，線性關(guān)系系數(shù)R =0.998 ο(6)牛奶樣品中土霉素含量的測(cè)定用于樣品檢測(cè)的牛奶未檢出土霉素，故采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。首先牛奶樣品首先用10 %的三氯乙酸和氯仿處理,超聲15 min后,離心去除沉淀物,用Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH到
8.0左右，再過膜(截留量3 K)去除樣品中的大分子。然后將樣品用于步驟(4)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與步驟(5)得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)比，計(jì)算出土霉素的濃度，結(jié)果如表I所示。表I加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種微量四環(huán)素類抗生素的熒光檢測(cè)方法，其特征包括如下步驟: (1)25 150 nM適配子探針與四環(huán)素類抗生素充分混合，10^40°C反應(yīng)2(T40min后，力口入25 150 nM DNA引物，并在37°C反應(yīng)l(T60min ;加入100 300 nM環(huán)狀DNA模板，25 40°C反應(yīng)0.5 2h，分別加入2 10 U/μ L Phi29 DNA聚合酶，0.25 I mM dNTPs在25 40°C反應(yīng)5h，水浴加熱到6(T70°C保溫1(T20 min，終止反應(yīng)； (2)20^200 nM染料標(biāo)記的DNA探針與2 20 Pg/mL石墨烯混合反應(yīng)l(T60min，4°C保存?zhèn)溆茫? (3)取步驟(I)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟(2)制備的2(Γ200nM石墨烯基分子信標(biāo)混合，體積比1:4 14，室溫下測(cè)定體系中標(biāo)記染料的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線，測(cè)定體系中染料的熒光強(qiáng)度時(shí)間變化曲線，根據(jù)測(cè)量土霉素標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線； (4)對(duì)不同樣品重復(fù)步驟(I)、步驟(2)和步驟(3)進(jìn)行檢測(cè)，得到的檢測(cè)結(jié)果與步驟(3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行對(duì)比，得到樣品中四環(huán)素類抗生素含量。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，所述的四環(huán)素類抗生素為土霉素、四環(huán)素。
3.如權(quán)利要求1或2所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，所述的環(huán)狀DNA模板的制備步驟如下: 磷酸化的2 6 μ M padlock探針與4 8 μ M DNA引物充分混合，水浴加熱到80 95°C，保持5 15min，然后退火冷卻到37°C保溫0.5 2h，加入2 6 U/μ L Τ4 DNA連接酶，10 25°C過夜反應(yīng)；先后加入0.05、.2 U/μ L核酸外切酶I和0.05、.2 U/μ L核酸外切酶III，在37°C保溫0.5 2h降解未反應(yīng)的單鏈DNA引物，水浴加熱到8(T95°C并保溫5 15 min終止反應(yīng)；最后用粒徑10 K的 納濾膜對(duì)制備的環(huán)狀DNA模板分離純化，除去大分子酶，得到的環(huán)狀DNA模板分散在緩沖液中，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的石墨烯采用水熱還原石墨氧化物的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微量四環(huán)素類抗生素的熒光檢測(cè)方法。本發(fā)明利用四環(huán)素類抗生素分子與其適配子特異性結(jié)合作用，滾環(huán)擴(kuò)增信號(hào)放大作用以及石墨烯分子信標(biāo)高選擇作用，結(jié)合熒光分光光度計(jì)，獲得石墨烯分子信標(biāo)的熒光信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)痕量四環(huán)素類抗生素的定量檢測(cè)。本發(fā)明克服了已有技術(shù)在檢測(cè)時(shí)存在過于復(fù)雜等諸多缺點(diǎn)，提高了靈敏度和選擇性，同時(shí)為其他小分子物質(zhì)或污染物的檢測(cè)提供新的方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103115903SQ20131001659
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者趙慧敏, 劉猛, 高升, 全燮 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)