專利名稱:定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1a1基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域,尤其涉及一種在臨床樣本中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒。
背景技術(shù):
尿苷二憐酸葡萄糖醒酸基轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphoglucuronateglucucronosy I transferase, UGT)是生物體內(nèi)進(jìn)行第II相生物轉(zhuǎn)化時(shí)最重要的酶之一,屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族。UGT共有2個(gè)亞家族,UGTlA和UGT2家族。UGTlAl是一種對(duì)許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進(jìn)行解毒,加強(qiáng)其排泄的重要酶類,UGTlAl基因的遺傳多態(tài)性對(duì)減輕藥物的毒副作用有重要的臨床意義。目前發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性主要包括(TA) η重復(fù)序列啟動(dòng)子(UGT1A1*28)的多態(tài)性和UGT1A1*6基因序列的多態(tài)性。在中國(guó)人中,UGT1A1*28只發(fā)現(xiàn)兩種類型(TA)6和(TA)7,可組合成TA6/6、TA6/7和TA7/7三種等位基因。相對(duì)于TA6/6表·型患者,TA7/7表型患者的UGTlAl酶活性降低約50%。UGT1A1*6基因突變主要發(fā)生在第一號(hào)外顯子第211核苷酸上G突變成A,導(dǎo)致其編碼的甘氨酸變?yōu)榫彼?G71R)。UGTlAl基因表達(dá)減少會(huì)增加人體對(duì)某些藥物的敏感性,可能發(fā)生未預(yù)期的毒性。伊立替康(Irinotecan,CPT-11),是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑,可誘導(dǎo)單鏈DNA損傷,從而阻斷DNA復(fù)制叉,阻止DNA鏈的重新組裝,引起DNA雙鏈的斷裂,造成細(xì)胞死亡。主要治療成人晚期轉(zhuǎn)移性大腸癌,對(duì)小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌和卵巢癌亦有療效。伊立替康為前體藥物,在體內(nèi)經(jīng)過(guò)羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物。羧酸酯酶將伊立替康分子10位的哌啶側(cè)鏈裂解,產(chǎn)生7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38),其活性較伊立替康強(qiáng)100到1000倍。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-GT,主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代謝)葡萄糖醛酸化滅活,生成葡萄糖醛酸化SN-38 (SN-38G),從而保護(hù)健康細(xì)胞免受伊立替康毒性的影響。但UGTlAl酶的UGT1A1*28的形式不能催化SN-38,結(jié)果聚集在體內(nèi)的SN-38引發(fā)腹瀉或嗜中性白血球減少癥等其他毒性,UGT1A1*28的突變使UGTlAl的轉(zhuǎn)錄活性下降三分之二,UGT1A1*6的突變導(dǎo)致酶活性降為野生型的49%,因此,2005年,美國(guó)FDA要求在伊立替康藥品標(biāo)簽上加入警示,建議患者在使用伊立替康前先檢查是否帶有UGT1A1*28 突變。目前醫(yī)院用于UGTlAl基因分型檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是PCR-直接測(cè)序法,但直接測(cè)序法的敏感性不高,只能檢測(cè)出突變細(xì)胞比率在10-20%以上的腫瘤組織,對(duì)于含〈10%突變細(xì)胞的腫瘤組織以及外周血,常規(guī)PCR+直接測(cè)序法幾乎無(wú)能為力。相比于直接測(cè)序法,焦磷酸測(cè)序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測(cè)序(確定DNA中核苷酸的順序)方法,是新一代DNA序列分析技術(shù)。它是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng),在每一輪測(cè)序反應(yīng)中,只加入一種dNTTP,若該dNTP與模板配對(duì),聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào),并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。通過(guò)分析出峰情況,達(dá)到測(cè)定DNA序列的目的目前市場(chǎng)上還沒(méi)有利用焦磷酸技術(shù)進(jìn)行UGTlAl的基因多態(tài)性檢測(cè)的產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性高、準(zhǔn)確性好、能夠定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒。為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測(cè)序引物對(duì),所述引物對(duì)為如下引物
UGT1A1*6 正向擴(kuò)增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ IDN0. I);UGT 1A1*6 反向擴(kuò)增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ IDN0. 2)UGT1A1*6 測(cè)序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)UGT1A1*28 正向擴(kuò)增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQID NO. 4)UGT1A1*28 反向擴(kuò)增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQID NO. 5)UGT1A1*28 測(cè)序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ ID NO. 6)其中,UGT1A1*6正向擴(kuò)增引物(SEQ ID NO. I)和 UGT1A1*28 (SEQ IDN0.4)正向擴(kuò)增引物的5'端分別進(jìn)行生物素標(biāo)記。一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的測(cè)序試劑盒,所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液1,含有SEQ ID NO. 5所示反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液2,SEQ ID NO. I和SEQ IDN0. 4所示的正向擴(kuò)增引物,SEQ IDNO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測(cè)序引物;其中,SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5,端進(jìn)行生物素標(biāo)記。進(jìn)一步地,所述試劑盒中還包括質(zhì)控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對(duì)照品的超純水;質(zhì)控序列是由QIAGEN設(shè)計(jì)合成的一段寡聚核苷酸鏈,用于檢測(cè)PyroMark Q24測(cè)序儀的各項(xiàng)性能指標(biāo)。進(jìn)一步地,所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品1,UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品2,UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品3 ;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品1,UGTIAl氺28陽(yáng)性對(duì)照品2,UGTIAl氺28陽(yáng)性對(duì)照品3 ;所述UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒;所述UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒;UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*6質(zhì)?;旌衔铮凰鯱GT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*28質(zhì)?;旌衔?;其中,質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒;所述UGT1A1*6質(zhì)?;旌衔镏蠻GT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為I: I ;所述UGT1A1*28質(zhì)?;旌衔镏蠻GT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液2中其他組分為常規(guī)的IOx PCR Buffer、dNTP和H2O,各組分按常規(guī)體積比配置(IOx PCR Buffer、dNTP、H2O和反應(yīng)液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測(cè)序的常規(guī)試劑,如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙 磷酸酶組成的酶混合物,由5’-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物,尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果為I)本發(fā)明提供的定量檢測(cè)UGTlAl基因分型的焦磷酸測(cè)序試劑盒定性準(zhǔn)確,具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),樣品處理簡(jiǎn)單,測(cè)序速度快,高通量,半個(gè)小時(shí)完成一次上機(jī)反應(yīng),直接給出檢測(cè)位點(diǎn)頻率分析,結(jié)果直觀。2)本發(fā)明提供的定量檢測(cè)UGTlAl基因分型的焦磷酸測(cè)序試劑盒靈敏度和特異性高;3)本發(fā)明提供的定量檢測(cè)UGTlAl基因分型的焦磷酸測(cè)序試劑盒檢測(cè)速度快;4)本發(fā)明提供的定量檢測(cè)UGTlAl基因分型的焦磷酸測(cè)序試劑盒步驟簡(jiǎn)單;5)本發(fā)明提供的定量檢測(cè)UGTlAl基因分型的焦磷酸測(cè)序試劑盒可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)。6)本發(fā)明的試劑盒中設(shè)置了空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,能更好的確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于設(shè)計(jì)了靈敏度高,特異性好的引物,并且選擇了合適的方法,本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)GTlAl基因分型進(jìn)行快速檢測(cè)。本發(fā)明的試劑盒可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程,反應(yīng)時(shí)間短,PCR產(chǎn)物簡(jiǎn)單處理即可上焦磷酸測(cè)序儀測(cè)序,操作簡(jiǎn)便,反應(yīng)時(shí)間短,高通量,比金標(biāo)準(zhǔn)——毛細(xì)管電泳測(cè)序靈敏度高,更適合用于突變分析。
圖I為臨床樣本UGT1A1*6野生型的焦磷酸測(cè)序圖;圖2為臨床樣本UGT1A1*6突變雜合型的焦磷酸測(cè)序圖;圖3為臨床樣本UGT1A1*6突變純合型的焦磷酸測(cè)序圖;圖4為臨床樣本UGT1A1*28野生型的焦磷酸測(cè)序圖。圖5為臨床樣本UGT1A1*28突變雜合子型的焦磷酸測(cè)序圖。圖6為臨床樣本UGT1A1*28突變純合子型的焦磷酸測(cè)序圖。圖7為臨床質(zhì)控品control oligo的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖;圖8為臨床空白對(duì)照的焦憐酸測(cè)序結(jié)果圖;圖9為多組設(shè)計(jì)引物的凝膠電泳圖;圖中①、②表明非特異性條帶,③表明特異性和片段大小均比較合適,④表明目的帶片段大小不對(duì)。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白,下面結(jié)合附圖及實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例I :試劑盒的制備I.引物的設(shè)計(jì)與合成研究表明目前針對(duì)UGTlAl基因多態(tài)性主要是UGT1A1*6和UGT1A1*28兩種基因多態(tài)性,UGT1A1*6基因突變主要發(fā)生在第一號(hào)外顯子第211核苷酸上G突變成A,導(dǎo)致其編碼的甘氨酸變?yōu)榫彼?G71R),UGT1A1*28的多態(tài)性是(TA)n重復(fù)序列啟動(dòng)子,使用PyroMarkAssay Design2. O軟件,根據(jù)這兩個(gè)突變位點(diǎn)(表I)設(shè)計(jì)并確定了 PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物(表2),試劑盒中最主要的影響試劑盒的準(zhǔn)確性的就是引物,包括擴(kuò)增引物和測(cè)序引物,在設(shè)計(jì)的初期,我們?cè)O(shè)計(jì)了多組引物進(jìn)行比較(見圖9);其中擴(kuò)增引物和測(cè)序引物先經(jīng)過(guò)PAGE純化,再經(jīng)HPLC純化,其中UGT1A1*6正向擴(kuò)增引物(SEQ ID NO. I)和UGT1A1*28(SEQ ID NO. 4)正向擴(kuò)增引物的5'端分別進(jìn)行生物素標(biāo)記。表I.突變位點(diǎn)與類型
權(quán)利要求
1.一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的測(cè)序引物對(duì),其特征在于,所述引物對(duì)為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴(kuò)增引物,SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 5所示的反向擴(kuò)增引物,SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 6所示的測(cè)序引物;其中,SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
2.一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的焦磷酸測(cè)序試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液1,含有SEQID NO. 5所示反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液2,SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴(kuò)增引物,SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 6 所示的測(cè)序引物;其中,SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 5 PJf示引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質(zhì)控品和空白對(duì)照品。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于,所述空白對(duì)照品為水。
5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品I,UGTlAl氺6陽(yáng)性對(duì)照品2,UGTlAl氺6陽(yáng)性對(duì)照品3 ;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品1,UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品2,UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品3 ; 所述UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒;所述UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒;UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*6質(zhì)?;旌衔铮? 所述UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*28質(zhì)?;旌衔?; 其中,質(zhì)粒載體為PMD18-T質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,所述UGT1A1*6質(zhì)粒混合物中UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,所述UGT1A1*28質(zhì)?;旌衔镏蠻GT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒,屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域,所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增引物、焦磷酸測(cè)序引物、以及陽(yáng)性對(duì)照品;本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高,特異性好,PCR產(chǎn)物簡(jiǎn)單處理即可上焦磷酸測(cè)序儀測(cè)序,操作簡(jiǎn)便,反應(yīng)時(shí)間短,比金標(biāo)準(zhǔn)——毛細(xì)管電泳測(cè)序靈敏度高,更適合用于突變分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899406SQ20121034797
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者周姍 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙三濟(jì)生物科技有限公司