專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水稻光敏核不育系的分子檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用2對(duì)光敏基因引物和2種核酸內(nèi)切酶檢測(cè)光敏核不育系的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
雜交水稻的推廣應(yīng)用已經(jīng)極大地促進(jìn)了全球稻米產(chǎn)量的増加。光敏核不育系(PGMS)是兩系農(nóng)作物雜交種的核心部分。利用光敏核不育系進(jìn)行的雜交水稻制種已獲得了非常成功的發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用。因而在雜交水稻育種中不育系的鑒定是非常重要的一環(huán)。光溫條件控制水稻育性轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制的研究目前已經(jīng)取得了 很大的進(jìn)展。大部分真核生物的基因組序列轉(zhuǎn)錄成了長(zhǎng)的非編碼RNA (lncRNAs)。其中長(zhǎng)日特定雄性育性相關(guān)RNA (LDMAR)調(diào)節(jié)水稻的PSMS。在長(zhǎng)日條件下植物正?；ǚ鄣陌l(fā)育需要足夠數(shù)量的LDMAR的轉(zhuǎn)錄。野生型和突變體之間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)改變了 LDMAR的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)。在長(zhǎng)日條件下，導(dǎo)致了發(fā)育中的花粉過(guò)早的細(xì)胞程序化死亡(PCD)，從而導(dǎo)致PSMS。有研究表明“農(nóng)墾58S”光敏不育性主要受第12染色體的一個(gè)主效基因座pmsl2-l控制。在正常水稻中，野生型PMS12-1的表達(dá)抑制了光敏不育的發(fā)生。PMS12-1編碼了ー個(gè)獨(dú)特的非編碼RNA，產(chǎn)生ー個(gè)名為osa-smR5864w的21個(gè)核苷酸的小分子RNA。與正常水稻品種相比，光敏不育水稻中pmsl2-l發(fā)生了 C-G的一個(gè)替換，該突變影響了小RNA的表達(dá)水平及其可能與靶基因的互作能力而產(chǎn)生雄性不育，是構(gòu)成粳稻光敏核不育系的原因。目前進(jìn)行光敏核不育系鑒定的主要方法是花粉鏡檢法和自交結(jié)實(shí)法。其中花粉鏡檢法因?yàn)橹庇^、操作簡(jiǎn)便和成本低可用于大群體鑒定而成為目前進(jìn)行不育系鑒定的主要方法。但這一方法存在如下一些缺點(diǎn)水稻生育期太長(zhǎng)而受時(shí)間限制、育性劃分模糊和較難判斷。光敏核不育系是因?yàn)閜msl2-l的點(diǎn)突變所致，與正常水稻相比，突變體發(fā)生了 C-G的一個(gè)替換，這為依據(jù)pmsl2-l的基因序列來(lái)鑒定光敏核不育系提供了依據(jù)。而對(duì)單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)有賴(lài)于操作簡(jiǎn)便、結(jié)果明了的檢測(cè)方法。較常見(jiàn)的單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法包括測(cè)序、SSCP、RFLP等方法。這些方法雖各有優(yōu)點(diǎn)，但也各有其不足之處。測(cè)序可以直接測(cè)出DNA序列中的所有突變位點(diǎn)的堿基替代情況，但該方法需要昂貴的儀器和較長(zhǎng)的步驟，成本較高；SSCP方法較為成熟，但操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果易造成誤判；PCR-RFLP方法要求待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)和某一酶切位點(diǎn)相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出水稻材料是否為光敏核不育系，從而提供ー種光敏核不育系的分子檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明方法可根據(jù)特異引物和核酸內(nèi)切酶來(lái)鑒定光敏核不育系。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的—種水稻光敏核不育系的分子檢測(cè)方法，包括如下步驟
a.抽提水稻葉片中基因組總DNA ;b.任選以下一對(duì)引物對(duì)提取的基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；c.將擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；如用引物GC-Dl擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶RsaI進(jìn)行酶切；如用引物GC-D2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶AccI進(jìn)行酶切；d.由酶切產(chǎn)物的帶譜推出該基因的SNP如果是G，則該材料為光敏核不育系；SNP如果是C，則不是光敏核不育系。所述的步驟d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3個(gè)條帶；如果SNP是C，得到605bp和108bp2個(gè)條帶；用AccI酶切，如果SNP是G，無(wú)酶切產(chǎn)物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2個(gè)條帶。一種水稻光敏核不育系的分子檢測(cè)試劑盒，包括引物GC-D I:正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，和核酸內(nèi)切酶RsaI;
或者引物GC-D2:正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，和核酸內(nèi)切酶AccI;或者以上兩對(duì)引物和兩種核酸內(nèi)切酶。本發(fā)明的試劑盒還包括用于PCR擴(kuò)增和酶切的常規(guī)試劑。本發(fā)明的技術(shù)效果在于1)本發(fā)明從分子水平建立了一個(gè)檢測(cè)光敏核不育系的方法及檢測(cè)工具，傳統(tǒng)的鑒定水稻育性的方法主要是根據(jù)花粉育性觀察來(lái)判斷的，但是水稻生育期長(zhǎng)，因而從花粉育性來(lái)判別的話耗時(shí)長(zhǎng)，也不利于材料的合理利用。本發(fā)明利用光敏核不育材料的野生型和突變體之間光敏基因的單核苷酸多肽性(SNP)來(lái)判斷其是否為光敏核不育系。這就可以直接在苗期來(lái)對(duì)光敏水稻材料的育性進(jìn)行檢測(cè)。隨著育種的推迸，很多不育系的來(lái)源屬于光敏還是溫敏已變得模糊，通過(guò)本方法可準(zhǔn)確地檢測(cè)出不育材料是否為光敏不育系或光敏不育來(lái)源，從而更好地引導(dǎo)育種。2)本發(fā)明中根據(jù)農(nóng)墾58Spmsl2-l設(shè)計(jì)的2對(duì)引物和核酸內(nèi)切酶可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出單堿基多態(tài)性位點(diǎn)。只需根據(jù)酶切產(chǎn)物就可檢測(cè)出該光敏基因的SNP是C還是G，從而鑒定該材料的育性，為光敏核不育系的鑒定提供了有力的鑒定依據(jù)。相對(duì)于其它單堿基多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)方法，PCR-RFLP耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)単、不需測(cè)序，這樣就可以節(jié)約成本。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的說(shuō)明，而不會(huì)造成對(duì)本發(fā)明的限制。


圖I為GC-D1、GC-D2引物對(duì)不同不育系及可育系對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果。I:農(nóng)墾 58; 2:農(nóng)墾 58S;3:安農(nóng) N ;4 :安農(nóng) S-I ；5 :培矮 64S ；6 :雙 88S ；7 Y58S ；8 :株 1S。圖2為用RsaI和AccI兩種核酸內(nèi)切酶對(duì)不同不育系及可育系對(duì)照組PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果。I:農(nóng)墾58; 2:農(nóng)墾58S;3:安農(nóng)N;4 :安農(nóng)S-I ；5 :培矮64S ；6 :雙88S ；7 Y58S ；8 :株 1S。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I : 選用的水稻材料為農(nóng)墾58、農(nóng)墾58S、安農(nóng)N、安農(nóng)S_l、培矮64S、雙88S、Y58S、株IS和農(nóng)墾58SX農(nóng)墾58的Fl種子(以上均是常見(jiàn)和公知的水稻品種，本領(lǐng)域技術(shù)人員均知曉這些品種是否屬于光敏不育植株)，按照常規(guī)DNA抽提方法從幼苗葉片中抽提出符合質(zhì)量要求的基因組總DNA。選用GC-D1、GC-D2共2個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，并分別用內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切和檢測(cè)。獲得的圖片結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)期完全一致，再根據(jù)野生型和突變型之間光敏基因的單堿基核苷酸差異，由酶切產(chǎn)物的帶譜推導(dǎo)出該基因的SNP是C還是G，最終從分子水平上檢測(cè)出水稻樣本是否為光敏不育植株。(I)水稻葉片DNA的抽提選用的水稻材料為農(nóng)墾58、農(nóng)墾58S、安農(nóng)N、安農(nóng)S_l、培矮64S、雙88S、Y58S、株IS和農(nóng)墾58SX農(nóng)墾58的Fl種子，8個(gè)材料葉片DNA的抽提均按照Murry等CTAB的方法。取O. 5g幼苗葉片放入研缽中，用液氮研磨至粉末狀，然后迅速轉(zhuǎn)移至I. 5ml離心管；加入 65°C預(yù)熱的 700 μ I 提取液(IOOmMTris-Hcl (ΡΗ8. O), 20mM EDTA (PH8. O)，I. 4M Nacl，2%CTAB，調(diào)至PH8. 0，加入2ml疏基こ醇，用超純水定容至1L)，輕輕混勻，在65°C水浴30 40min，冷卻至室溫；加入等體積的氯仿/異戊醇(24 :1)，溫和上下顛倒離心管數(shù)次；4°C、12000rpm離心IOmin ;取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管，并加等體積的氯仿/異戊醇，離心取上清，加入450 μ I預(yù)冷的異丙醇；-20°C放置I. 5h ;4°C、12000rpm離心IOmin ;用70%こ醇漂洗DNA沉淀2 3次，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干，加入50 μ I TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆?。按照常?guī)DNA抽提方法，可以從水稻葉片中抽提出符合質(zhì)量要求的基因組總DNA。
(2) PCR擴(kuò)增及檢測(cè)分析以不同材料的基因組DNA為模板，選用GC-Dl和GC-D2這2對(duì)引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)成分為2 X Buffer :10 μ I ；dNTP(2mM) :4 μ I ;引物(IOmM) 1. 2μ I ； Taq SI (lu/μ I)
O.4μ I ;模板DNA :1 μ I ；ddH20 :3. 4 μ 1，總體積20 μ I。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性2分鐘，然后980C 10秒，520C 30秒，68°C I分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，降溫到4°C，完成PCR擴(kuò)增程序。GC-Dl Forward primer GCATGCTTCACCAGCACGTCCAReverse primer TAGCTTGCTTCATCTTGGTATGProduct length 713bp。
GC-D2 Forward primer CCCATATATCTTGTCCAGTGCTReverse primer TAGCTTGCTTCATCTTGGTATGProduct length 777bp。瓊脂糖凝膠電泳1%的瓊 脂糖，120V電壓電泳30分鐘后，用凝膠成像儀拍照(圖I)。(3) PCR產(chǎn)物的酶切及分析用GC-Dl擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶RsaI (GT/AC)進(jìn)行酶切；用GC-D2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶AccI(GT/MKAC)進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為=IOXBuffer 2μ I ;PCR 產(chǎn)物5μ I ;內(nèi)切酶(均為 IOu/μ I) 0. 5μ I ；ddH20 :12. 5 μ 1，總體積 20 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?7°C，4小吋。酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，獲得的結(jié)果與預(yù)期一致用RsaI (GT/AC)酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp這3個(gè)條帶；如果SNP是C，得到605bp和108bp2個(gè)條帶。用AccI (GT/MKAC)酶切，如果SNP是G，無(wú)酶切產(chǎn)物；如果SNP是C，得到443bp和334bp這2個(gè)條帶。實(shí)施例結(jié)果顯示，根據(jù)農(nóng)墾58Spmsl2_l基因序列設(shè)計(jì)的2對(duì)引物和2個(gè)核酸內(nèi)切酶通過(guò)PCR-RFLP方法能夠準(zhǔn)確地推導(dǎo)出水稻材料中的SNP，從而用于檢測(cè)水稻光敏核不育
系O
權(quán)利要求
1.一種水稻光敏核不育系的分子檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 a.抽提水稻葉片中基因組總DNA； b.任選以下一對(duì)引物對(duì)提取的基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA, 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG ；GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT， 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG ； c.將擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切； 如用弓I物GC-Dl擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶RsaI進(jìn)行酶切；如用引物GC-D2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶AccI進(jìn)行酶切； d.由酶切產(chǎn)物的帶譜推出該基因的SNP如果是G，則該材料為光敏核不育系；SNP如果是C,則不是光敏核不育系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水稻光敏核不育系的分子檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的步驟d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3個(gè)條帶；如果SNP是C，得到605bp和108bp2個(gè)條帶； 用AccI酶切，如果SNP是G，無(wú)酶切產(chǎn)物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2個(gè)條帶。
3.—種水稻光敏核不育系的分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括 引物GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA, 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG， 和核酸內(nèi)切酶RsaI ； 或者引物GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT， 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG， 和核酸內(nèi)切酶AccI ； 或者以上兩對(duì)引物和兩種核酸內(nèi)切酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒別水稻光敏核不育基因pms12-1的分子標(biāo)記方法和試劑盒，包括基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切分析。根據(jù)pms12-1的序列設(shè)計(jì)了2對(duì)引物和2種核酸內(nèi)切酶，以此引物通過(guò)PCR反應(yīng)，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，確定光敏基因的SNP類(lèi)型，從而鑒定是否含有光敏核不育基因或者可育基因，并能進(jìn)一步區(qū)別pms12-1基因的純合體和雜合體，達(dá)到快速簡(jiǎn)便鑒定水稻光敏核不育系的目的，從而指導(dǎo)田間選育，加速育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864227SQ20121035587
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者曹孟良, 李丁, 趙迎曦, 夏玉梅, 袁隆平, 高婧, 沈春修, 方真 申請(qǐng)人:湖南雜交水稻研究中心, 湖南隆平高科基因科技有限公司