專利名稱：Gdsl蛋白在制備脂肪酶中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及⑶SL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase,triacylglycerolacylhydrolases,EC3. I. I. 3)即三酸基甘油?；饷?，是工業(yè)酶制劑中最重要的酶類之一，能夠在油水界面催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，同時(shí)還能催化酯交換、轉(zhuǎn)酯、酯合成、醇解、酸解、氨解等多種化學(xué)反應(yīng)，通常具有催化效率高、催化條件簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。目前工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶大多為微生物產(chǎn)生的胞外酶，從反應(yīng)溫度來(lái)說(shuō)多為中溫酶(最適反應(yīng)溫度37-40°C )，在高溫下反應(yīng)受到限制。嗜熱酶是指最佳催化溫度60-85°C的酶，具有化學(xué)催化劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如催化效率高、作用溫度廣泛(在高溫下的穩(wěn)定性也 較好)、作用PH廣泛等，因而能克服中溫酶(20-55°C )及低溫酶(2-20°C )在應(yīng)用過(guò)程中出現(xiàn)的生物學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，可以取代傳統(tǒng)的中溫酶催化及化學(xué)催化，為優(yōu)化工藝流程開(kāi)辟了一條新途徑。利用熱穩(wěn)定性好的脂肪酶作為生物催化劑具有如下優(yōu)點(diǎn)⑴由于該脂肪酶的穩(wěn)定性高，可在室溫下分離提純和包裝運(yùn)輸、并能長(zhǎng)久保持活性，從而制備脂肪酶的成本降低；(2)對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)低，從而減少了能量消耗，且由于其耐高溫特性，在生產(chǎn)中不需要復(fù)雜的冷卻裝置，既節(jié)省了開(kāi)支又降低了冷卻過(guò)程對(duì)環(huán)境造成的污染；(3)隨反應(yīng)溫度的提高，酶分子運(yùn)動(dòng)速度加快，催化能力加強(qiáng)，加快了動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，從而使用效率得到了提高；(4)由于采用高溫反應(yīng)條件，降低了中溫微生物污染反應(yīng)體系的危險(xiǎn)，從而提高了產(chǎn)物純度，同時(shí)高溫反應(yīng)條件還提高了有機(jī)化合物的生物可利用性和可溶性，從而實(shí)現(xiàn)了有效的生物修復(fù)。脂肪酶的熱穩(wěn)定性問(wèn)題一直是脂肪酶研究及生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題，就目前脂肪酶的研究現(xiàn)狀來(lái)看，僅通過(guò)蛋白質(zhì)工程來(lái)改善脂肪酶特性，遠(yuǎn)不能解決各個(gè)領(lǐng)域?qū)χ久傅囊?。因此，尋找發(fā)現(xiàn)具有新特性、耐熱、高活力、符合現(xiàn)代生物工程要求的脂肪酶是一項(xiàng)非常有意義的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。本發(fā)明提供了⑶SL蛋白的應(yīng)用，為如下(I)或(2)(I)制備脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。應(yīng)用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物時(shí)，所述降解的反應(yīng)條件為30-80 V、pH6. 5-8. O，所述降解的反應(yīng)條件優(yōu)選為65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物為對(duì)硝基苯基乙酸酯、丁酸對(duì)硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒為將所述⑶SL蛋白的編碼基因插入載體pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述⑶SL蛋白的編碼基因具體可為如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的 DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備⑶SL蛋白的方法，是培養(yǎng)以上所述的重組菌，得到所述⑶SL蛋白。所述方法中，所述培養(yǎng)的具體步驟為將重組菌接種至LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)，振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)到O. 8，然后加入IPTG (誘導(dǎo)劑)至濃度為Immo/L，20°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。所述方法中，在培養(yǎng)重組菌后還包括超聲破碎和將超聲破碎的上清進(jìn)行親和層析的步驟。所述超聲破碎的具體參數(shù)為功率300W、總工作時(shí)間90min,每工作5s間歇8s), 12000rpm離心IOmin,收集上清液。所述親和層析具體可為鎳柱親和層析。本發(fā)明還保護(hù)一種降解脂肪酶的底物的方法，是采用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物。所述降解的反應(yīng)條件為30-80°C、pH6. 5-8. O。所述降解的反應(yīng)條件優(yōu)選為65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物具體可為對(duì)硝基苯基乙酸酯、丁酸對(duì)硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述GDSL蛋白具有脂肪酶活性，將所述GDSL蛋白用作脂肪酶，具有如下優(yōu)點(diǎn)可以采用較高的反應(yīng)溫度；具有良好的熱穩(wěn)定性；可以在堿性條件下作用；具有良好的PH穩(wěn)定性；對(duì)02-(12的底物均可發(fā)揮作用；酶活力較高。本發(fā)明為涉及脂肪酶的工藝流程開(kāi)辟了一條新途徑，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I為實(shí)施例I中60°C培養(yǎng)條件下復(fù)篩獲得脂肪酶菌株。圖2為實(shí)施例I中各個(gè)菌株的酶活初測(cè)結(jié)果。圖3為⑶SL蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。圖4為重組質(zhì)粒pET_28a - B2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)⑶SL蛋白的SDS-PAGE ;1、分子量標(biāo)記，2、對(duì)照菌得到的上清液、3、重組菌得到的上清液。圖6為對(duì)硝基苯酚一吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為純化后蛋白的電泳圖。圖8為目的蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
圖9為實(shí)施例3中的最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。圖10為實(shí)施例3中的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。圖11為實(shí)施例3中各個(gè)試劑對(duì)酶活的影響。圖12為實(shí)施例3中各個(gè)有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響。圖13為實(shí)施例3中去污劑對(duì)酶活的影響。圖14為實(shí)施例3中蛋白酶對(duì)酶活的影響。 圖15為實(shí)施例4中對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度底物特異性。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。載體pET-28a(+) :Novagen，GR201023。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，CD601-01。對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP) :Sigma，1492-30-4。對(duì)硝基苯酚(PNP)Sigma,4043-96-3。CHAPS 的英文全稱為 3-[ (3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate )。實(shí)施例I、野生菌的獲得以及脂肪酶的發(fā)現(xiàn)一、產(chǎn)脂肪酶菌株篩選初篩培養(yǎng)基(g/L)=(NH4)2SO4 lg、NH4N03 lg、NaCl lg、MgS04 ·7Η20 0. lg、K2HP03lg、FeSO4 · 7Η20 O. Olg、Na2CO3 調(diào) PH 至 8. O,再加 I. 0% 橄欖油，滅菌。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉10g、(NH4)2SO4 5g、K2HPO3 lg、玉米漿粉20g、黃豆餅粉20g、三油精10g，pH8. O。初篩池塘底泥樣品取自浙江嘉興欣欣飼料有限公司的混養(yǎng)魚(yú)池塘，取樣時(shí)間為2009年7月，4°C條件保存樣品。將池塘底泥樣用無(wú)菌PBS緩沖液進(jìn)行十倍梯度稀釋，取100微升涂布于初篩培養(yǎng)基，放于60°C溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)脂肪酶菌株能夠降解橄欖油產(chǎn)生透明圈，依據(jù)產(chǎn)生透明圈直徑和菌落直徑比值大的甄別其脂肪酶活性強(qiáng)弱。復(fù)篩將分離純化的具有脂肪酶活性的菌株接種入復(fù)篩固體(復(fù)測(cè)產(chǎn)真脂肪酶菌株)或液體發(fā)酵培養(yǎng)基(誘導(dǎo)產(chǎn)酶測(cè)活性)，固體平板放入30或60°C溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察降解透明菌。通過(guò)高溫篩選策略和羅丹明橄欖油篩選方法初步獲得26株耐高溫脂肪酶產(chǎn)生菌，再通過(guò)三油精復(fù)篩策略獲得12株菌顯示出較大透明圈。60°C培養(yǎng)條件下復(fù)篩獲得脂肪酶菌株見(jiàn)圖I。其中B2、B6、B9、B12為高溫培養(yǎng)條件篩選到的脂肪酶菌。采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基在200r/min，60°C搖床培養(yǎng)48h。將菌體12，OOOrpm離心2min，取上清，將菌體重懸于50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液中，用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞(4s/次，間隔10s，破碎30次)，13，000rpm，4°C離心lOmin，即得菌體胞內(nèi)酶上清。將上清進(jìn)行酶活初測(cè)。通過(guò)對(duì)胞外及胞內(nèi)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)篩選獲得的細(xì)菌菌株胞外檢測(cè)到的酶活均高于胞內(nèi)酶活。酶活初測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。取酶活最高的B2菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。二、菌株的鑒定提取B2菌株基因組DNA，并采用16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rDNA的 PCR 擴(kuò)增。27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R :5’ -TACCTTGTTACGACTT-3，。反應(yīng)體系10X PCR buffer 5 μ L, dNTP mix (2. 5mmol/L) 4 μ L、Taq (5U/μ L)0. 5 μ L、27F(25 μ mol/L) I μ L、1492R(25 μ mol/L) I μ L、模板 DNA I μ L、ddH20 8 μ L、總體積50 μ L0PCR 反應(yīng)條件95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，32 個(gè)循環(huán)后；72°C延伸 IOmin0測(cè)序所得16S rDNA基因序列長(zhǎng)度大約1500bp，如序列表的序列I所示。將菌株的16S rDNA基因序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)與Geobacillus toebii (EU391540)具有較高相似性，初步判斷其屬于Geobacillus sp.。三、脂肪酶的發(fā)現(xiàn)
從B2菌株中發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白，具有脂肪酶的功能，將其命名為GDSL蛋白，如序列表的序列2所示。將編碼GDSL蛋白的基因命名為GDSL基因，其開(kāi)放閱讀框如序列表的序列
3所示。⑶SL蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖見(jiàn)圖3。實(shí)施例2、⑶SL蛋白的制備一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建I、合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子。2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用B2F和B2R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。B2F: 5 ’ -GACGAATTCATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC-3’ (下滑線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切識(shí)別序列);B2R: 5 ’ -GACGCGGCCGCTTGTTTGTCCTCCTCCGTCCAC-3’ (下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶NotI的酶切識(shí)別序列)。PCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min ；94°C 30sec、60°C 30sec、72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切載體pET_28a(+)，回收載體骨架(約5300bp)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pET_28a - B2。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET-28a - B2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在載體pET_28a(+)的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的雙鏈DNA分子(插入的雙鏈DNA分子的3’末端與載體上的His標(biāo)簽編碼基因融合，以便于進(jìn)行后續(xù)的蛋白純化)。重組質(zhì)粒pET-28a - B2的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖4。二、重組菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pET_28a - B2導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。將載體pET_28a(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到對(duì)照菌。三、⑶SL蛋白的表達(dá)和鑒定I、將重組菌或?qū)φ站臃N至5mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、將步驟I的菌液以1/100的體積比接種至20mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到O. 6 ;然后加入IPTG (誘導(dǎo)劑)至濃度為lmmo/L，20°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 12 小時(shí)。3、取步驟2得到的菌液離心并收集菌體，然后將菌體進(jìn)行超聲破碎(功率300W、總工作時(shí)間90min,每工作5s間歇8s), 12000rpm離心lOmin,收集上清液。4、將重組菌步驟3得到的上清液和對(duì)照菌步驟3得到的上清液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖5。重組菌得到的上清液中具有分子量約為29. 5kD的預(yù)期蛋白條帶，而對(duì)照菌得到的上清液不顯示該蛋白條帶。將目的蛋白從SDS-PAGE上切下來(lái)，送天津生物芯片技有有限公司進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明，該蛋白確實(shí)為序列表的序列2所示的GDSL蛋白。5、將重組菌步驟3得到的上清液和對(duì)照菌步驟3得到的上清液分別作為待測(cè)溶液進(jìn)行脂肪酶酶活檢測(cè)。
采用對(duì)硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖6。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=57. 548x-0. 9233，R2=O. 9993，y代表酶活(單位為μ mol/min), x代表采用分光光度計(jì)測(cè)定得到的405nm光吸收值。通過(guò)脂肪酶將對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)降解為黃色的對(duì)硝基苯酚(PNP)原理，采用分光光度法檢測(cè)待測(cè)溶液(或其稀釋液)的脂肪酶活性。具體操作過(guò)程如下將試管中按順序加入I. 8mL溶液B和O. ImL溶液A，37°C水浴保溫5min ;將試管分為對(duì)照管和樣品管，對(duì)照管中加入已高溫煮沸滅活的待測(cè)溶液(或其稀釋液)0. ImL并混勻，樣品管中加入待測(cè)溶液(或其稀釋液)O. ImL并混勻，立即計(jì)時(shí)，37°C反應(yīng)IOmin后每個(gè)試管加入ImL 95%乙醇水溶液以終止反應(yīng)；采用分光光度計(jì)測(cè)定405nm光吸收值。溶液A :稱取90mg對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯溶于30mL異丙醇。溶液B 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. O)。I個(gè)酶活單位脂肪酶的定義在pH8. 0、37°C條件下，每分鐘釋放I μ mo I對(duì)硝基酚所需要的酶量。酶活計(jì)算公式A=([At-A0] XK+C0) XVlXn/(V2Xt)A 一待測(cè)溶液的酶活(U/mL)，At 一反應(yīng)后樣品管的光吸收值，A0 一反應(yīng)后對(duì)照管的光吸收值，K=57. 4，Co=O. 9233，η 一稀釋倍數(shù)，Vl 一反應(yīng)液的體積(2mL)，V2 一加入試管的待測(cè)溶液(或其稀釋液)的體積(O. ImL), t 一反應(yīng)時(shí)間(lOmin)。重組菌步驟3得到的上清液的酶活為4. 48U/mL,對(duì)照菌步驟3得到上清液的酶活為 OU/mL。四、⑶SL蛋白的表達(dá)和純化I、將重組菌接種至50mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、將4mL步驟I的菌液接種至200mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到0. 8 ;然后加入IPTG (誘導(dǎo)劑)至濃度為lmmo/L，20°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。3、取步驟2得到的菌液離心并收集菌體，然后將菌體進(jìn)行超聲破碎(功率300W、總工作時(shí)間90min,每工作5s間歇8s), 12000rpm離心lOmin,收集上清液。4、將步驟3得到的上清液進(jìn)行親和層析(鎳柱)。采用ImL 的 NTA 柱。洗脫過(guò)程中的緩沖液(pH均為 7. 6)如下ΝΤΑ-0 :含 20mmol/L Tris-HCl.O. 5mol/LNaCl 和 10g/100mL 甘油；NTA_60 :含 20mmol/L Tris-HCl、60mmol/L 咪唑、O. 5mol/LNaCl和 lOg/lOOmL 甘油；NTA-200 含 20mmol/L Tris-HCl、200mmol/L 咪唑、0. 5mol/LNaCl 和lOg/lOOmL 甘油。洗脫過(guò)程(1)柱子用10_20mL水平衡，每次加5mL待流凈后再加，以后皆同；(2)用NTA-O平衡15-20mL，然后上樣5mL步驟3得到的上清液；(3)用5mL NTA-60進(jìn)行洗脫，以去除雜蛋白；(4)用5mL NTA-200洗脫目的蛋白，收集過(guò)柱后的溶液，即為⑶SL蛋白液。5、將步驟4得到的⑶SL蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，親和層析后得到了電泳純的GDSL蛋白。6、切下步驟5中的目的條帶并進(jìn)行質(zhì)譜氨基酸測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖8，結(jié)果表明該目的蛋白確實(shí)為序列表的序列2所不的GDSL蛋白。實(shí)施例3、⑶SL蛋白作為脂肪酶的性質(zhì)鑒定 采用實(shí)施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液進(jìn)行實(shí)施例3的各個(gè)實(shí)驗(yàn)。—、最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定I、最適 pH檢測(cè)⑶SL蛋白液的最適pH，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用不同的緩沖液作為溶液B，分別采用如下緩沖液pH2. 0-3. 6的50mmol/L Gly-HCl緩沖液、pH3. 6-5. O 的 50mmol/L HAc-NaAc 緩沖液、ρΗ5· 0-8. O 的 50mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液、pH8. 0-9. O 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液和 ρΗ9· 0-12. O 的 50mmol/L Gly-NaOH 緩沖液。采用pH7. 5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液作為溶液B時(shí)酶活最高，將該最高酶活作為100%，計(jì)算采用其它緩沖液作為溶液B的條件下的相對(duì)酶活，部分結(jié)果見(jiàn)圖9(a)。圖9(a)中，PH8. O的點(diǎn)為T(mén)ris-HCl緩沖液，ρΗ9· O的點(diǎn)為Gly-NaOH緩沖液。結(jié)果表明，⑶SL蛋白作為脂肪酶的最適pH為7. 5，在pH6. 5-8.0范圍內(nèi)酶活性可以維持在60%以上，pH在5以下或9以上時(shí)沒(méi)有酶活檢出。2、pH 穩(wěn)定性預(yù)處理將I體積份⑶SL蛋白液與10體積份不同緩沖液混合，37°C處理60min。分別采用如下緩沖液pH3. 0-5. O的50mmol/L HAc-NaAc緩沖液、pH5. 0-8. O的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液、pH8. 0-9. O 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液和 pH9. 0-12. O 的 50mmol/L Gly-NaOH 緩沖液。將預(yù)處理后的蛋白液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。采用PH12. O的Gly-NaOH緩沖液進(jìn)行預(yù)處理時(shí)酶活最高，將該最高酶活作為100%，計(jì)算采用其它預(yù)處理?xiàng)l件下的相對(duì)酶活，部分結(jié)果見(jiàn)圖9(b)。圖9 (a)中，pH5.0的點(diǎn)為檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH8. O的點(diǎn)為T(mén)ris-HCl緩沖液，pH9. O的點(diǎn)為Gly-NaOH O緩沖液。結(jié)果表明，⑶SL蛋白在pH 4.0- 12. O范圍內(nèi)較穩(wěn)定，剩余酶活性能保持70%以上，隨著pH值增加該酶越穩(wěn)定,說(shuō)明此酶在中性及堿性條件下具有較好的pH穩(wěn)定性。二、最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定I、最適溫度將GDSL蛋白液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用PH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液并且采用不同的反應(yīng)溫度(20_80°C )。
采用65°C進(jìn)行反應(yīng)時(shí)酶活最高，將該最高酶活作為100%，計(jì)算采用其它反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖10 (a)。結(jié)果表明，GDSL蛋白作為脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為65°C，并且在30-80°C間具有較高的活性，保持50. 0%以上的活性；OTSL蛋白作為脂肪酶在30-65°C時(shí)隨著反應(yīng)溫度的增加酶活性亦隨之增加，反應(yīng)溫度超過(guò)65°C后酶活呈下降趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度80°C，剩余酶活為62. 0%。2、熱穩(wěn)定性預(yù)處理，將⑶SL蛋白液在不同溫度下處理3小時(shí)，并分別于O. 5、I、2、3小時(shí)取樣，
立即置在冰水上。將預(yù)處理后的蛋白液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。
將不進(jìn)行預(yù)處理的酶活作為100%，將該最高酶活作為100%，計(jì)算采用各個(gè)預(yù)處理溫度條件下的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖10 (b)。結(jié)果表明，⑶SL蛋白在60-80°C處理3h后剩余酶活達(dá)60%以上，在60°C條件下酶活幾乎不受影響高達(dá)92%，90V處理后酶活可達(dá)47%，表明⑶SL蛋白是高溫脂肪酶。三、不同金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響在反應(yīng)體系中加入不同試劑(金屬離子或化學(xué)試劑)，來(lái)檢測(cè)試劑對(duì)酶活性的影響，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用PH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。試劑在反應(yīng)體系中終濃度為ImmoI/L或IOmmoI/L。以不加入試劑的反應(yīng)體系作為對(duì)M(CK)0以CK處理組的酶活作為100%，計(jì)算各個(gè)處理組的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖11。在低濃度(ImM)時(shí)，Zn2+和β巰基乙醇對(duì)GDSL蛋白的脂肪酶酶活有激活作用，而其它金屬離子的影響不明顯。IOmM濃度下，Zn2+、K+、Li+、Na+和β巰基乙醇對(duì)⑶SL蛋白的脂肪酶酶活有激活作用，其它離子對(duì)GDSL蛋白的脂肪酶酶活都會(huì)有不同程度的抑制作用，而Ca2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+和Pb2+的抑制效果最明顯，剩余酶活均低于30%。四、有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響預(yù)處理在⑶SL蛋白液中加入不同有機(jī)試劑(體積百分含量為10%或30%)，40 °C反應(yīng)lOmin。以加入等體積水的反應(yīng)體系作為對(duì)照(CK)。將預(yù)處理后的蛋白液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。以CK處理組的酶活作為100%，計(jì)算各個(gè)處理組的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖12。在濃度10%時(shí)，甲醇、異丙醇和正辛醇對(duì)GDSL蛋白的脂肪酶酶活有微弱地激活作用，異丁醇具有抑制作用，其它有機(jī)溶劑對(duì)酶活幾乎無(wú)影響。在濃度30%時(shí)，甲醇、異丙醇和正辛醇對(duì)GDSL蛋白的脂肪酶酶活仍具微弱地激活作用，異丁醇和乙醇對(duì)酶活有較強(qiáng)的抑制作用，其它有機(jī)溶溶劑對(duì)酶活仍無(wú)影響。五、不同去污劑對(duì)酶活的影響預(yù)處理在⑶SL蛋白液中加入不同去污劑(使去污劑的質(zhì)量百分含量為O. 01%或O. 10%)，40°C反應(yīng)lOmin。以加入等體積水的反應(yīng)體系作為對(duì)照(CK)。將預(yù)處理后的蛋白液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。
以CK處理組的酶活作為100%，計(jì)算各個(gè)處理組的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖13。CTAB在低濃度或高濃度時(shí)均對(duì)GDSL蛋白的脂肪酶酶活具有激活作用，可提高酶活約20%。O. 1%的Txrion 100和PTTO對(duì)⑶SL蛋白的脂肪酶酶活有微弱地抑制作用，但是剩余酶活仍達(dá)80%以上。其它表面活性劑對(duì)酶活幾乎無(wú)影響。六、抗蛋白酶能力測(cè)定預(yù)處理在⑶SL蛋白液中加入不同的蛋白酶，處理2小時(shí)。蛋白酶為胰蛋白酶時(shí)，加入劑量為150U，處理?xiàng)l件為pH 7.0、25°C。蛋白酶為蛋白酶K時(shí)，加入劑量為10U，處理?xiàng)l件為pH7. 5、37°C。蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶A時(shí)，加入劑量為5U，處理?xiàng)l件為pH 7.5，37 °C ο蛋白酶為胃蛋白酶時(shí)，加入劑量為18U，反應(yīng)條件為pH 2.0，37°C。當(dāng)?shù)鞍酌笧棣?糜蛋白酶時(shí)，加入劑量為10U，反應(yīng)條件為pH 7. 5，25°C。將預(yù)處理后的蛋白液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異僅在于采用PH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。設(shè)置不進(jìn)行預(yù)處理的對(duì)照(CK)。 以CK處理組的酶活作為100%，計(jì)算各個(gè)處理組的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖14。⑶SL蛋白經(jīng)蛋白酶K、胃蛋白酶、糜蛋白酶、枯草蛋白酶和胰蛋白酶和處理后仍具有60%以上的脂肪酶活性，說(shuō)明該酶具有一定的蛋白酶抗性。實(shí)施例4、GDSL蛋白作為脂肪酶對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物特異性的測(cè)定將實(shí)施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測(cè)溶液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異如下(I)制備溶液A時(shí)，用其它底物取代對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯并使底物濃度為ImM ; (2)采用pH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。各個(gè)底物如下4_Nitrophenyl acetate (C2,對(duì)硝基苯基乙酸酯，SigmaN8130)、4_Nitrophenyl butyrate (C4, 丁酸對(duì)硝基苯酯，Sigma N9876)、4_Nitrophenylcaproate (C6,己酸對(duì)硝基苯酷，Sigma 956-75-2) 4_Nitrophenyl caprylate (C8，4_ 硝基苯基辛酸酷，Sigma 21742)、4_Nitro phenyl decanoate (CIO, 4-硝基苯基奏酸酷，SigmaN0252)、4_Nitrophenyl dodecanoate (C12, 4_ 硝基苯基月桂酸酷，Sigma61716)。當(dāng)?shù)孜餅?-Nitrophenyl acetate時(shí)，⑶SL蛋白液的酶活為166U/mL。當(dāng)?shù)孜餅?-Nitrophenyl butyrate時(shí)，⑶SL蛋白液的酶活為190U/mL。當(dāng)?shù)孜餅?-Nitrophenyl caproate時(shí)，⑶SL蛋白液的酶活為246U/mL。當(dāng)?shù)孜餅?-Nitrophenyl caprylate時(shí)，⑶SL蛋白液的酶活為297U/mL。當(dāng)?shù)孜餅?-Nitrophenyl decanoate時(shí)，⑶SL蛋白液的酶活為231U/mL。當(dāng)?shù)孜餅?-Nitrophenyl dodecanoate 時(shí)，GDSL 蛋白液的酶活為 109U/mL。以4-Nitrophenyl caprylate作為底物得到的酶活結(jié)果作為100%,計(jì)算采用其它底物的相對(duì)酶活。結(jié)果見(jiàn)圖15。GDSL蛋白最大可降解鏈長(zhǎng)為C12個(gè)碳鏈，在底物為C2-C8時(shí)降解能力隨著鏈長(zhǎng)的增加活性也相應(yīng)地增加，底物為C2時(shí)相對(duì)活性達(dá)到56%。底物的鏈長(zhǎng)大于C8后降解活性隨之下降，ClO時(shí)為78%，C12時(shí)為37%。實(shí)施例5、重組酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定將實(shí)施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測(cè)溶液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5,差異如下(I)制備溶液A時(shí),用4-Nitrophenyl caprylate (或4-Nitrophenyl decanoate)取代對(duì)硝基苯酹棕櫚酸酯并使其濃度為ImM ； (2)采用pH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液；(3)依次在2、3、5、7、10、15、20、30min時(shí)終止酶活反應(yīng)，并測(cè)定光吸收值。通過(guò)計(jì)算酶活性與反應(yīng)時(shí)間的比值大小，如該酶在某個(gè)時(shí)間段內(nèi)比值不變時(shí)，則在該時(shí)間段內(nèi)的酶促反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)，來(lái)確定此時(shí)間內(nèi)為測(cè)Km和Vmax的反應(yīng)最佳時(shí)間。根據(jù)確定的一級(jí)反應(yīng)時(shí)間,4-Nitrophenyl caprylate測(cè)定Km值及Vmax的反應(yīng)時(shí)間為 lOmin, 4-Nitrophenyl decanoate 測(cè)定 Km 值及 Vmax 的反應(yīng)時(shí)間為 lOmin。將實(shí)施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測(cè)溶液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5，差異如下(1)制備溶液A時(shí)，用不同量的4-Nitrophenylcaprylate (或4-Nitrophenyl decanoate)取代對(duì)硝基苯酌·棕櫚酸酯,使其濃度為1、0.8、O. 4、O. 2、O. 15 或 O. ImM ; (2)采用 ρΗ7· 5 的 50mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液；(3)采用前段確定的反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)公式計(jì)算出反應(yīng)速度，采用米氏方程雙倒數(shù)方法求得Km值及Vmax。再按雙倒 數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)來(lái)轉(zhuǎn)化其結(jié)構(gòu)式
「01411 I[m V I I IGDSL 蛋白對(duì) C8 底物的 Kni=O. 26mmol/L, Vmax=149. 25 μ mol/min/mg。GDSL 蛋白對(duì)CIO 底物的 Km=O. 41mmol/L, Vmax=71. I μ mol/min/mg。實(shí)施例6、重組酶B2比活的測(cè)定比活力單位的定義為每毫克酶蛋白所含的酶活力單位。將實(shí)施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測(cè)溶液進(jìn)行酶活測(cè)定，方法參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟三的5,差異如下(I)制備溶液A時(shí),用4-Nitrophenyl caprylate取代對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯，使其濃度為ImM ; (2)采用pH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。通過(guò)伯樂(lè)公司的蛋白定量試劑盒測(cè)定GDSL蛋白液中的蛋白濃度。酶活與蛋白濃度的比值即為⑶SL蛋白的比活力。以C8為底物計(jì)算得到⑶SL蛋白的比活力是498U/mg。
權(quán)利要求
1.⑶SL蛋白的應(yīng)用，為如下(I)或(2) (O制備脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物； 所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述(2)中，所述降解的反應(yīng)條件為30-80°C>pH6. 5-8. O。
3.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述(2)中，所述脂肪酶的底物為對(duì)硝基苯基乙酸酯、丁酸對(duì)硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述GDSL蛋白為權(quán)利要求7所述方法制備得到的蛋白質(zhì)。
5.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒為將GDSL蛋白的編碼基因插入載體pET_28a(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒； 所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于所述GDSL蛋白的編碼基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。
7.一種制備⑶SL蛋白的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求5或6所述的重組菌，得到⑶SL蛋白；所述GDSL蛋白是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
8.一種降解脂肪酶的底物的方法，是采用GDSL蛋白降解脂肪酶的底物； 所述GDSL蛋白是如下(a)或(b) : (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述降解的反應(yīng)條件為30-80°C、pH6. 5-8. O ;所述脂肪酶的底物為對(duì)硝基苯基乙酸酯、丁酸對(duì)硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述GDSL蛋白為權(quán)利要求7所述方法制備得到的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。本發(fā)明提供了GDSL蛋白的應(yīng)用，為如下(1)或(2)(1)制備脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述GDSL蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GDSL蛋白具有脂肪酶活性，將GDSL蛋白用作脂肪酶具有如下優(yōu)點(diǎn)可以采用較高的反應(yīng)溫度；具有良好的熱穩(wěn)定性；可以在堿性條件下作用；具有良好的pH穩(wěn)定性；對(duì)C2-C12的底物均可發(fā)揮作用；酶活力較高。本發(fā)明為涉及脂肪酶的工藝流程開(kāi)辟了一條新途徑，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102876643SQ201210356229
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者周志剛, 何夙旭, 徐俐, 楊雅麟, 張美超, 李青 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所