專利名稱：快速檢測(cè)空腸彎曲菌的lamp試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)空腸彎曲菌的LAMP劑盒，屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
空腸彎曲菌(c. jejuni)菌體輕度彎曲似逗點(diǎn)狀，長(zhǎng)I. 5 5 μ m，寬O. 2 O. 8 μ m。菌體一端或兩端有鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。有莢膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2. 5 5%氧和10%C02的環(huán)境中生長(zhǎng)最好。最適溫度為37 42°C。在正常大氣或無(wú)氧環(huán)境中均不能生長(zhǎng)?？漳c彎曲茵是一種人畜共患病病原茵，可以引起人和動(dòng)物發(fā)生多種疾病，并且是一種食物源性病原茵，被認(rèn)為是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要原因。空腸彎曲菌有內(nèi)毒素能侵襲小腸和大腸粘膜引起急性腸炎，亦可引起腹瀉的暴發(fā)流行或集體食物中毒。潛伏期一般為3 5天，對(duì)人的致病部位是空腸、回腸及結(jié)腸。主要癥狀為腹 瀉和腹痛，有時(shí)發(fā)熱，偶有嘔吐和脫水。因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因定性檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定性檢測(cè)的重要方法之一。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術(shù)是一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。該技術(shù)具有不需要PCR儀、擴(kuò)增產(chǎn)物不需要開(kāi)蓋，用肉眼即可判斷結(jié)果及反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測(cè)空腸彎曲菌的培養(yǎng)方法，需要分離、篩選和生化鑒定，必要時(shí)還需要血清學(xué)鑒定，一般為4 6d，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，具有靈敏度低、特異性差、假陽(yáng)性、耗時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。各種常規(guī)PCR方法具有敏感性強(qiáng)、特異性高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，有較多應(yīng)用于空腸彎曲菌檢測(cè)的報(bào)道，但由于存在PCR后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性等問(wèn)題以及需要特殊的儀器設(shè)備而限制了其在基層單位的應(yīng)用。因此隳待開(kāi)發(fā)精確、靈敏、快速、無(wú)污染的臨床檢驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種快速檢測(cè)空腸彎曲菌的LAMP試劑盒及其使用方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種快速檢測(cè)空腸彎曲菌的LAMP試劑盒，該試劑盒包括a) LAMP反應(yīng)液，b)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，c)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；LAMP反應(yīng)液含有引物，引物為以下5組特異性引物中的任意
一組(I)上游外引物 F3 :5' -TGTAATGCATGCTTGCGG-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ；(SEQ ID No. 2)
上游內(nèi)引物FIP :5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTTCATGATGGACATACTACTTCT-3/ ；(SEQ ID No. 3)下游內(nèi)引物BIP V -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3/ ；(SEQ ID No. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游內(nèi)引物FIP :
5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTGATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3'；(SEQ ID No. 7)下游內(nèi)引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；(SEQ ID No. 8)(3 )上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3' ; (SEQ ID No. 9 )下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ; (SEQ ID No. 10)上游內(nèi)引物FIP :5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3'；(SEQ ID No. 11)下游內(nèi)引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；(SEQ ID No. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3; ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ; (SEQ ID No. 14)上游內(nèi)引物FIP :5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGCT-3'；(SEQ ID No. 15)下游內(nèi)引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；(SEQ ID No. 16)(5)上游外引物 F3 :5' -GCAAAGTATTTAGCAAGTCAGAA-3' ; (SEQ ID No. 17)下游外引物B3 :5' -ACTTCAATGCTATAACTATCCG-3' ; (SEQ ID No. 18)上游內(nèi)引物FIP :5' -CATTGCCTTAGCACCACCCAGGCACTCTAAATCTTTATTTTCAAC-3' ;(SEQ ID No. 19)下游內(nèi)引物BIP :5' -AGTGATTATGTTTTTGGATGGCACAAAGAAGCCATCATCGCAC-3'；(SEQ ID No. 20)具體地說(shuō)，a) LAMP 反應(yīng)液LAMP反應(yīng)液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L 的內(nèi)引物、5mol/L 甜菜堿、50mmol/L MgSO4 和 IOmmoI/L dNTPs 組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，LAMP反應(yīng)液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L內(nèi)引物FIP、BIP各 2· 0 μ1，10 μ mol/L 外引物 F3、Β3 各 L O μ 1，IOmmoI/L dNTPs3. 0 μ 1，50mmol/L MgSO4
3.0μ 1，5. Omol/L甜菜堿4. 5μ l，Bst DNA聚合酶大片段I. 0 μ I組成，反應(yīng)液總體積20 μ I。b)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有空腸彎曲菌高度保守基因hipO基因314個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pMD18-T-hip0載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。hipO基因的核苷酸序列為5 ' -CCTTATAAAAGCAAAAAAGAAAATGTAATGCATGCTTGCGGTCATGATGGACATACTACTTCTTTATTGCTTGCTGCAAAGTATTTAGCAAGTCAGAATTTTAATGGTACTCTAAATCTTTATTTTCAACCTGCTGAAGAGGGCTTGGGTGGTGCTAAGGCAATGATAGAAGATGGATTGTTTGAAAAATTTGATAGTGATTATGTTTTTGGATGGCACAATATGCCTTTTGGTAGCGATAAGAAATTTTATCTTAAAAAAGGTGCGATGATGGCTTCTTCGGATAGTTATAGCATTGAAGTTATTGGAAGAGG-3'。(SEQ ID No. 21)實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pMD18-T_hip0，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，_20°C保存。c)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。本試劑盒的工作原理使用本發(fā)明提供的快速可視化檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒，在恒溫條件下(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，并伴隨產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。反應(yīng)結(jié)束后，12000r/min離心30s，即可用肉眼觀察管底白色沉淀。在本發(fā)明提供的快速檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒中，針對(duì)空腸彎曲菌檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物、dNTPs、Mg2+濃度、甜菜堿等的優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了檢測(cè)空腸彎曲菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，并研制出檢測(cè)空腸彎曲菌的LAMP試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速檢測(cè)空腸彎曲菌的要求。使用本發(fā)明的LAMP試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法，包括以下步驟①用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國(guó)標(biāo)法培養(yǎng)待檢樣品l_4h ；②用水煮法從待測(cè)樣品中提取DNA ；③將DNA加入到LAMP試劑盒的反應(yīng)體系中，65°C保溫Ih ；④反應(yīng)結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對(duì)樣品進(jìn)行定性分析。本發(fā)明中提供的快速檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒可對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行定性檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清法檢測(cè)方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果I、與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，檢測(cè)速度快，僅lh，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過(guò)5h。2、特異性好，靈敏度高；3、步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；4、可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)。


圖I為實(shí)施例I中空腸彎曲菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，4一空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,5—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，6—空腸彎曲菌陰性樣本，7—空腸彎曲菌陰性樣本，8—空腸彎曲菌陰性樣本；圖2為實(shí)施例I中空腸彎曲菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖，圖中M-DNA Marker, I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板,2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,4一空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,5—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，6—空腸彎曲菌陰性樣本，7—空腸彎曲菌陰性樣本，8—空腸彎曲菌陰性樣本；圖3為實(shí)施例2中空腸彎曲菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，4一空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,5—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，6—空腸彎曲菌陰性樣本，7—空腸彎曲菌陰性樣本，8—空腸彎曲菌陰性樣本；圖4為實(shí)施例3中空腸彎曲菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中
I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，4一空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,5—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，6—空腸彎曲菌陰性樣本，7—空腸彎曲菌陰性樣本，8—空腸彎曲菌陰性樣本；圖5為實(shí)施例4中空腸彎曲菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，4一空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,5—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，6—空腸彎曲菌陰性樣本，7—空腸彎曲菌陰性樣本，8—空腸彎曲菌陰性樣本；圖6為實(shí)施例5中空腸彎曲菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，4一空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本,5—空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本，6—空腸彎曲菌陰性樣本，7—空腸彎曲菌陰性樣本，8—空腸彎曲菌陰性樣本；圖7為實(shí)施例6中空腸彎曲菌LAMP試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2—陰性對(duì)照，3—空腸彎曲菌樣本，4一單核細(xì)胞增生李斯特氏菌樣本，5—痢疾志賀氏菌樣本，6—甲型副傷寒沙門氏菌樣本，7—金黃色葡萄球菌樣本，
8—大腸桿菌樣本；圖8為實(shí)施例7中空腸彎曲菌LAMP試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I一稀釋10 1倍,2一稀釋10 2倍,3一稀釋10 3倍,4一稀釋10 4倍,5一稀釋10 5倍，6一稀釋10 6倍，7一稀釋10 7倍,8一稀釋10 8倍,9一稀釋10 9倍，10一稀釋10 10倍。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D. L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I :新型可視化快速檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒組成與配制試劑組成a) LAMP反應(yīng)混合液LAMP 反應(yīng)混合液由 LAMP 10 X buffer 2· 5 μ I，10 μ mol/L 內(nèi)引物 FIP、BIP 各2.0 μ 1，10 μ mol/L 夕卜弓 I 物 F3、B3 各 I. O μ 1，10mmol/L dNTPs 3· O μ 1，50mmol/LMgS04
3.Ομ 1，5. Omol/L甜菜堿4. 5μ l，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I組成，反應(yīng)液總體積20 μ I。其中引物序列如下上游外引物F3:5' -TGTAATGCATGCTTGCGG-3'；下游外引物B3:5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'；上游內(nèi)引物FIP :5'-AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTTCATGATGGACATACTACTTCT-3'； 下游內(nèi)引物BIP :5'-TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3/ ；b)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD18-T_hip0是含有空腸彎曲菌高度保守基因hipO基因314個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pMD18-T-hip0載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖；實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pMD18-T-hip0，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，-20°C保存。c)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中空腸彎曲菌的PCR試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法，包括以下步驟a、食物樣品預(yù)處理取3份經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定的空腸彎曲菌陽(yáng)性食品，3份空腸彎曲菌陰性食品，分別稱取25g樣品放入盛有225mL BPff的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min 10000r/min均質(zhì)Imin 2min,或置于盛有225mL BPff的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打Imin 2min。若樣品為液態(tài),不需要均質(zhì),振蕩混勻即可。無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36°C ±1°C培養(yǎng)l_4h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在450C以下不超過(guò)15min解凍。b、細(xì)菌模板DNA的制備分別取100 μ L細(xì)菌培養(yǎng)物，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無(wú)菌水,充分混勻，100°C水浴lOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。c、LAMP反應(yīng)分別取5 μ I b)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應(yīng)液中，65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。d、結(jié)果判定待反應(yīng)結(jié)束后12000r/min離心30S，觀察有無(wú)沉淀產(chǎn)生(見(jiàn)附圖I)。取5 μ I LAMP產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性樣本都有條帶，陰性樣本則無(wú)條帶(見(jiàn)附圖2)。附圖I為離心后觀察白色沉淀結(jié)果，附圖2為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。e、結(jié)論反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀或電泳條帶，對(duì)照組均無(wú)沉淀或電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌效果良好，沉淀觀察法與電泳檢測(cè)法效果一致，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例2 I.新型快速可視化檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下
上游外引物F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3'；下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'；上游內(nèi)引物FIP:5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTGATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3/ ；下游內(nèi)引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中空腸彎曲菌的PCR試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。 實(shí)施例3:I.新型快速可視化檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3'；下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'；上游內(nèi)引物FIP :5'-AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3/ ；下游內(nèi)引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中空腸彎曲菌的PCR試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖4)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例4:I.新型快速可視化檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3'；下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'；上游內(nèi)引物FIP:5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGCT-3/ ；下游內(nèi)引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中空腸彎曲菌的PCR試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖5)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例5:I.新型快速可視化檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -GCAAAGTAITTAGCAAGTCAGAA-3'；下游外引物B3:5' -ACTTCAATGCTATAACTATCCG-3'；上游內(nèi)引物FIP:
5' -CATTGCCTTAGCACCACCCAGGCACTCTAAATCTTTATTTTCAAC-3/ ；下游內(nèi)引物BIP :5' -AGTGATTATGTTTTTGGATGGCACAAAGAAGCCATCATCGCAC-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中空腸彎曲菌的PCR試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖6)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例6 :基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中空腸彎曲菌的PCR試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)a、DNA模板的制備分別取經(jīng)過(guò)DNA有效性驗(yàn)證的空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生李 斯特氏菌、痢疾志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的菌液10 μ 1，12000r/min離心2min,去上清,加入50 μ L無(wú)菌水,充分混勻，10CTC水浴lOmin, 12000r/min離心2min，上清即為模板DNA。b、LAMP反應(yīng)分別取5μ I a)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應(yīng)液中，65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。C、結(jié)果判定待反應(yīng)結(jié)束后12000r/min離心30S，觀察有無(wú)沉淀產(chǎn)生(見(jiàn)附圖7)。附圖7為空腸彎曲菌LAMP試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果。d、結(jié)論結(jié)果顯示只有陽(yáng)性對(duì)照組和空腸彎曲菌有白色沉淀，而單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、痢疾志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和陰性對(duì)照沒(méi)有白色沉淀。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本試劑盒具有良好的特異性。實(shí)施例7 :快速檢測(cè)空腸彎曲菌LAMP試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)a、取Iml過(guò)夜培養(yǎng)的空腸彎曲菌培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋，稀釋至10_9。取每個(gè)稀釋度的菌液10 μ 1,120001'/111；[11離心2111；[11,去上清,加入5(^ L無(wú)菌水,充分混勻，100°C水浴lOmin, 12000r/min 離心 2min,上清即為模板 DNA。b、LAMP反應(yīng)取5 μ I a)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應(yīng)液中，65°C恒溫?cái)U(kuò)增 60min。C、結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后，12000r/min離心30s觀察管底是否產(chǎn)生白色沉淀，結(jié)果顯示KT1-KT8樣本管底均有白色沉淀，10_9-10_1(1樣本管底則沒(méi)有白色沉淀(見(jiàn)附圖8)。附圖8為空腸彎曲菌LAMP試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果。d、結(jié)論結(jié)果顯示當(dāng)菌液稀釋至10_8時(shí)仍能檢測(cè)出，最低檢測(cè)極限為50CFU/ml。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本試劑盒具有良好的靈敏度。從上述實(shí)例可以說(shuō)明，LAMP檢測(cè)方法特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，而且LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需不到5個(gè)小時(shí)就能完成，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法約需I周左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。該試劑盒的操作只需I人即可完成整個(gè)操作過(guò)程，一次可檢測(cè)多個(gè)(由實(shí)際檢測(cè)需要決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
權(quán)利要求
1.ー種快速檢測(cè)空腸彎曲菌的LAMP試劑盒，其特征在于由LAMP反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；LAMP反應(yīng)液含有引物，引物為以下5組特異性引物中的任意一組 (I)上游外引物 F3 :5' -TGTAATGCATGCTTGCGG-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'； 上游內(nèi)引物FIP 5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTTCATGATGGACATACTACTTCT-3'； 下游內(nèi)引物BIP :5'-TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'； (2 )上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'； 上游內(nèi)引物FIP 5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTGATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'； (3 )上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'； 上游內(nèi)引物FIP 5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'； (4 )上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3'； 上游內(nèi)引物FIP 5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGCT-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'； (5 )上游外引物 F3 :5' -GCAAAGTATTTAGCAAGTCAGAA-3'； 下游外引物 B3 :5' -ACTTCAATGCTATAACTATCCG-3'； 上游內(nèi)引物FIP 5' -CATTGCCTTAGCACCACCCAGGCACTCTAAATCTTTATTTTCAAC-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' -AGTGATTATGTTTTTGGATGGCACAAAGAAGCCATCATCGCAC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的LAMP試劑盒，其特征是，LAMP反應(yīng)液由BstDNA聚合酶大片段、LAMPlO X buffer、10 μ mol/L 的外引物、10 μ mol/L 的內(nèi)引物、5mol/L 舌甘菜喊、50mmol/LMgSO4 和 10mmol/L dNTPs 組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的LAMP試劑盒。其特征是，陽(yáng)性模板是含有空腸彎曲菌高度保守基因hipO基因314個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pMD18-T-hip0載體，hipO基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示。
4.使用權(quán)利要求I 3所述的LAMP試劑盒檢測(cè)空腸彎曲菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 ①用緩沖蛋白胨水按照國(guó)標(biāo)法培養(yǎng)待檢樣品l_4h； ②用水煮法從待測(cè)樣品中提取DNA；③將DNA加入到LAMP試劑盒的反應(yīng)體系中，65°C保溫Ih；④反應(yīng)結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀 ，對(duì)樣品進(jìn)行定性分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)空腸彎曲菌的LAMP試劑盒，由LAMP反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；LAMP反應(yīng)液含有Bst DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜堿。引物分為正向引物和反向引物。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高，快速簡(jiǎn)便，可重復(fù)性高以及肉眼可判斷結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)工業(yè)食品中空腸彎曲菌進(jìn)行快速定性檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)診斷方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102864229SQ20121035637
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者王業(yè)富, 鄭虎, 盧晅 申請(qǐng)人:武漢真福醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司