一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌o157的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌O157的方法，包括以下步驟：步驟1）制備反應(yīng)液；步驟2）將上述反應(yīng)液放入63℃烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性;步驟3）使用臨床分離大腸桿菌O157菌株核酸，以及臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計(jì)引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)大腸桿菌O157，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【專利說明】一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，是一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌0157屬腸出血性大腸桿菌，引起腸出血性腹瀉，約2%~7%的病人會(huì)發(fā)展成溶血性尿毒綜合征，兒童與老人最容易出現(xiàn)后一種情況。致病性大腸桿菌通過污染飲水、食品、娛樂水體引起疾病暴發(fā)流行，病情嚴(yán)重者，可危及生命。急需特異性和敏感度高的快速診斷試劑。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由日本榮研(EIKEN)株式會(huì)社開發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測(cè)系統(tǒng)，無須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測(cè)法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)大腸桿菌0157特異性基因序列的一對(duì)外引物(E-F3和E-B3)和一對(duì)內(nèi)引物(E-FIP和E-BIP)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，提高了大腸桿菌0157的檢測(cè)和診斷效率。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，包括以下步驟:
步驟1)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
1OX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿1M
1OmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
E-FIP40umol
E-BIP40umol
外引物
E-F35umol
E-B35umol
標(biāo)本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul ；
步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性；
步驟3)使用臨床分離大腸桿菌0157菌株核酸，以及臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
[0006]進(jìn)一步的，所述外引物E-F3的序列為ACTGAAGAAATGCGATAGCT。
[0007]進(jìn)一步的，所述外引物E-B3的序列為CTAACCGGTAACGGTGAA。
進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物E-FIP的序列為 ACCATCCGAGCCTAGGTAGG-AATTTTGTTGCAATAATGGACTCo
[0008]進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物E-BIP 的序列為 GCTGGGGTTTGGGTTTCAAG-ACTCCTGATTCTGCACTC。
[0009]進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計(jì)引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)大腸桿菌0157，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面將結(jié)合實(shí)施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0012]一種高特異高敏感檢 測(cè)大腸桿菌0157的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液
反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX(MgS04 2mM)
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
E-FIP40umol
E-BIP40umol
外引物
E-F35umol
E-B35umol
標(biāo)本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul ；
選取腸出血性大腸桿菌特異性基因基因(基因序列來源美國國立生物技術(shù)信息中心-NCBI)，設(shè)計(jì)引物序列，所述外引物E-F3的序列為ACTGAAGAAATGCGATAGCT，所述外引物E-B3的序列為CTAACCGGTAACGGTGAA，所述內(nèi)引物E-FIP的序列為
ACCATCCGAGCCTAGGTAGG-AAITTTGTTGCAATAATGGACTC，所述內(nèi)引物 E-BIP 的序列為 GCTGGGGTTTGGGTTTCAAG-ACTCCTGATTCTGCACTC。
[0013]步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30_60min，渾濁為陽性；所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
[0014]步驟3)使用臨床分離大腸桿菌0157菌株2株核酸，以及臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，2株大腸桿菌0157核酸均為陽性，其余菌種為陰性。[0015]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)`包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內(nèi)引物 E-FIP40umol E-BIP40umol 外引物E-F35umolE-B35um ol標(biāo)本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul ； 步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性； 步驟3)使用臨床分離大腸桿菌0157菌株核酸，以及臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，其特征在于:所述外引物 E-F3 的序列為 ACTGAAGAAATGCGATAGCT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，其特征在于:所述外引物 E-B3 的序列為 CTAACCGGTAACGGTGAA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物E-FIP的序列為
ACCATCCGAGCCTAGGTAGG-AATTTTGTTGCAATAATGGACTCo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物 E-BIP 的序列為 GCTGGGGTTTGGGTTTCAAG-ACTCCTGATTCTGCACTC。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高特異高敏感檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，其特征在于:所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK103725753SQ201210380460
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月10日
【發(fā)明者】金京勛, 呂少波, 李蘇楊 申請(qǐng)人:蘇州四同醫(yī)藥科技有限公司