檢測大腸桿菌o157:h7的雙抗elisa試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種檢測大腸桿菌〇157:H7的雙抗 ELISA試劑盒。
【背景技術】
[0002] 大腸桿菌0157:H7是一種重要的人獸共患病原菌。自1975年被首次分離、1982年 被確認為致病菌以來的20多年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。大腸桿菌 0157:H7感染可使人患腹瀉、出血性結腸炎（hemorrhagic colitis，HC)，還可在5%-10% 的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板減少 紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導致死亡。 大腸桿菌〇157:H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加 劇病情的危險性等特點，已經成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
[0003] 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)是一種以免疫學反應為基礎，將免疫反應與酶對底物 的高效催化作用相結合的生化技術，它具有特異、靈敏、快速等特點。目前對抗原的檢測多 采用夾心法ELISA，即將抗體包被至固相載體捕捉待檢抗原形成抗原-抗體復合物，然后 加入能夠催化底物變色的酶標二抗，可根據顏色反應的深淺對待檢抗原進行定性或定量分 析。ELISA的敏感性和特異性主要取決于抗體的親和力和特異性。Choong等建立的大腸桿 菌0157多克隆抗體雙夾心ELISA法可直接檢測血性糞便標本，其特異性和敏感性分別為 99. 5%和91. 2%。Reymond等用大腸桿菌0157脂多糖（LPS)作為抗原包被，檢測病人血 清，其敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為95 %、94 %、80 %、98 %。劉紅亮等以 LPS為抗原，通過雜交瘤技術制備出大腸桿菌0157:H7LPS的單克隆抗體，并建立大腸桿菌 0157 :H7雙抗體夾心ELISA檢測方法，與受試的菌株無交叉反應，對大腸桿菌0157:H7純培 養(yǎng)菌液的檢出下限是3 X 104CFU/mL。葛萃萃等建立的大腸桿菌0157雙抗夾心ELISA檢測 方法對純培養(yǎng)菌液檢出限為10 5CFU/mL，具有良好的敏感性及特異性，并且染菌食品經過選 擇性培養(yǎng)后，該方法可檢出培養(yǎng)12h后接種量為0. 1~lCFU/g(mL)的樣品。
[0004] 現有技術存在以下缺陷：全菌抗原作為免疫原，成分復雜，難以篩選到高滴度且特 異性高的單克隆抗體，并且操作過程中，存在生物安全的風險；提取的LPS為多糖類物質， 將其作為免疫原，抗原性一般較差，且很難達到特異性檢測致病血清型大腸桿菌〇157:H7 的目的。正是由于上述免疫原選擇的欠缺，可能導致夾心ELISA方法敏感性和特異性較低。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明針對現有技術存在的缺陷，旨在提供一種檢測大腸桿菌0157:H7的雙抗 ELISA試劑盒。
[0006] 本發(fā)明具體通過以下技術方案實現：
[0007] 檢測大腸桿菌0157: H7的雙抗ELISA試劑盒，包括：1)酶標板，2)單抗，3)酶標試 劑，4)底物顯色液，5)終止液，6)陽性標準抗原，7)陰性標準對照，8) 10X洗滌液，所述的酶 標板為包被有兔源大腸桿菌0157: H7多克隆抗體的96孔板，包被濃度為3. 2ug/mL。所述的 多克隆抗體指菌體濃度為IO9CFUAiL的大腸桿菌0157:H7,甲醛滅活后，四次免疫家兔后制 備所得。
[0008] 所述的酶標板包被液為pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，且酶標板為2塊。
[0009] 所述的單抗指PBS緩沖液1:400稀釋的緊密素單克隆抗體E006,所述的E006 單克隆抗體為高效的雜交瘤細胞4C4分泌的，效價高達1:102000,對應緊密素抗原表位 QTSSEQRSGVSS。
[0010] 所述的酶標試劑為PBS緩沖液1:5000稀釋的HRP-羊抗鼠 IgG，所述的HRP-羊抗 鼠 IgG購自Boster公司。
[0011] 所述的底物顯色液為單組份3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺溶液。
[0012] 所述的終止液為2M的硫酸溶液。
[0013] 所述的標準抗原指大腸桿菌0157:H7甲醛滅活48h所制備的全菌抗原，所述的陰 性標準對照為大腸桿菌0157:H7培養(yǎng)用EC肉湯培養(yǎng)基。
[0014] 所述的10\洗滌液為含有質量濃度分別為5%1'肌^11-20、8.5%氯化鈉、0.2%氯 化鉀、2. 9 %磷酸氫二鈉和0. 2 %磷酸氫二鉀的水溶液。
[0015] 本發(fā)明檢測大腸桿菌0157:H7的雙抗ELISA試劑盒的操作步驟如下：
[0016] 1)準備：從冰箱取出試劑盒，室溫放置30min。用蒸餾水將IOX洗滌液稀釋成I X 洗滌液；
[0017] 2)加樣：取出酶標板，固定于框架上，分別設置陰陽性對照孔、待檢樣品孔和空白 對照，記錄各孔位置。待檢樣品、陽性標準抗原和陰性標準對照分別加入待樣品孔、標準品 孔，IOOuL/孔?？瞻讓φ湛詹患?；
[0018] 3)溫育：37°C濕盒內孵育Ih ;
[0019] 4)洗板：棄去液體，吸水紙拍干，每孔加洗滌液250uL，靜置3min，甩去洗滌液，如 此重復洗板3次；
[0020] 5)加酶標試劑：每孔加入酶標試劑IOOuL ;
[0021] 6)洗板：同步驟（4);
[0022] 7)顯色：每孔加入底物顯色液100uL，輕輕震搖30s，室溫避光反應15min ;
[0023] 8)終止：每孔加入50uL終止液終止反應；
[0024] 9)測值：在自動酶聯(lián)檢測儀測定各孔的光密度吸收值（0D450nm);
[0025] 10)結果判定。
[0026] 本發(fā)明試劑盒檢測大腸桿菌0157:H7抗原的結果判定標準為：光密度吸收值 彡0. 231，且S/N彡2. 1為陽性；光密度吸收值〈0. 231，且S/N〈2. 1為陰性。
[0027] 本發(fā)明的有益效果為選用大腸桿菌0157:H7特有的緊密素 γ 1亞型的C端序列， 選取主要功能區(qū)，合成多肽，制備緊密素抗原，免疫小鼠，獲得高滴度的單克隆抗體Ε006,用 于研制夾心ELISA方法，提高檢測敏感新和特異性。Ε006單克隆抗體是由高效的雜交瘤細 胞4C4分泌的，效價高達1:102000,該單克隆抗