專利名稱：一種鯉春病毒血癥病毒rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于魚類病毒檢測技術領域，具體涉及一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，還涉及一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法。
背景技術：
趣春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV),屬單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales),彈狀病毒科(Rhabdoviridae),水泡性口炎病毒屬(Vesiculovirus)的暫定種，目前僅有一個血清型。SVCV引起的鯉春病毒血癥(SpringViraemia of Carp, SVC)是一種急性、出血性并有高度傳染的流行病，嚴重危害漁業(yè)生產(chǎn)并 能造成毀滅性打擊。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必報的重要疫病。2008年我國新頒 布的動物疫病名錄中將其列為一類動物疫病，是新中國成立以來第一個也是唯一一個魚類病毒疫病被列為一類傳染病。SVC對水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是鯉科魚類養(yǎng)殖的危害巨大。由于暫時沒有較好的防治藥物和方法，對該病的防控需要依賴實驗室的診斷，因此建立快速準確的檢測方法至關重要。SVCV檢測的“金標準”是通過細胞培養(yǎng)分離病毒，利用免疫學技術或分子生物學技術進行鑒定，這個過程耗時長，程序復雜。另外制備高效價抗血清困難，也限制了免疫學方法的使用。OIE水生動物疾病診斷手冊、我國關于SVCV檢測的國標和行標，已經(jīng)將RT-PCR列為診斷方法。在現(xiàn)有的關于RT-PCR檢測SVCV的公開文獻中，絕大多數(shù)是采用傳統(tǒng)的兩步法RT-PCR技術，即將反轉(zhuǎn)錄和PCR反應分管分步進行。RT-PCR檢測病原在近年來越來越趨向于采用一步法進行反應。與兩步法相比，簡化了操作程序、降低了樣品交叉污染的可能性，對反應的干擾因素少，能獲得良好的重現(xiàn)性，又降低了成本，為開發(fā)同時檢測多種病原的多重RT-PCR創(chuàng)造了有利條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是在于提供了一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，通過分析比對GenBank中已有的鯉春病毒血癥病毒G基因序列(AY527273，EF593133至EF593150, AY842484 至 AY842489, DQ227500 至 DQ227504, EU370915, Z37505),設計并篩選了一對引物，從分子水平對鯉春病毒血癥病毒進行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法。，本方法可在3小時內(nèi)準確檢測出樣品中的SVCV，能檢測SVCV感染的病魚組織，也能檢測SVCV感染的細胞(例如EPC細胞)，非常適用于SVCV的快速檢測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括以下成分
該試劑盒包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 SVCVF 和 SVCVR，AMV 酶，Taq 酶。SVCVF:5， -ggaatccccatatttgttccatc-3，；SVCVR:5， -tcacaagttgttttccattcagc-3，；一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，其步驟是I、病毒RNA的獲取采用TRIzol 或TRIzd LS試劑或柱吸附洗脫法等提取樣本總RNA。2、RT-PCR 擴增采用25μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5yL，5XAMV buffer·(25mM) 0. 5 μ L,引物(10 μ Μ)各0.5 μ L，AMV酶0.5 μ L，Taq酶0.5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行 RT-PCR 反應，先 45°C 30min,95°C 3min，再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置陽性對照和陰性空白對照。模板RNA在95°C 5分鐘后迅速置于冰浴中的預處理可以增加檢測的靈敏度。3、檢測結(jié)果判定取擴增產(chǎn)物，用2% (w/v,以下相同)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示在210bp大小處有條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。一種鯉春病毒血癥病毒的檢測方法(最佳條件)，其步驟是I、病毒RNA的獲取采用TRfed 或TRIzol LS試劑或柱吸附洗脫法等提取樣本總RM,模板RNA在950C 5分鐘后迅速置于冰浴中的預處理可以增加檢測的靈敏度。2、RT-PCR 擴增采用25μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5yL，5XAMV bufferI μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物(10 μ M)各0· 5 μ L，AMV酶0· 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR 反應，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置陽性對照和陰性空白對照。3、檢測結(jié)果判定取擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示在210bp大小處有條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點I、本發(fā)明公開了一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，能夠檢測出目前分離的所有SVCV病毒株；特異性好，能有效檢測出SVCV病毒；2、全部采用國產(chǎn)試劑，大大降低了檢測成本；3、一步法提高了檢測效率，縮短了檢測時間。


圖I為一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR試劑盒檢測結(jié)果的特異性的示意圖的總RNA、GCRV-104 株感染 CIK 細胞的總 RNA、SVCV 感染 EPC 細胞的總 RNA、DL2, OOOMarker0
具體實施例方式下列實例進一步說明本發(fā)明，但不應該當做對本發(fā)明的限制。若無特別說明，本發(fā)明所用試劑均為上海生工生物工程公司生產(chǎn)。實施例I :一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括以下成分該試劑盒它包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 SVCVF 和 SVCVR，AMV 酶，Taq 酶。實施例2 鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測方法所用緩沖液的優(yōu)化 一、取待檢樣品提取病毒RNA:培養(yǎng)鯉上皮乳頭瘤細胞(EPC細胞)至匯合單層，吸出培養(yǎng)液，以感染復數(shù)為O. I的劑量，接種ImL經(jīng)4000r/min離心5min除去細胞碎片的鯉春病毒血癥病毒(張朋，劉葒，陳孝煊，等.鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J]，中國預防獸醫(yī)學報，2011,33(4):305-308.)細胞毒材料，添加 10 μ L 的 Polybrene(終濃度 10 μ g/ml)，置于 26°C培養(yǎng)箱中吸附lh，使病毒吸附細胞，吸附過程中每20min輕輕晃動培養(yǎng)瓶一次，使病毒液與細胞單層充分均勻接觸，吸附Ih后，吸棄病毒液，加入5mL 2%胎牛血清(V/V)的培養(yǎng)液，置26 V培養(yǎng)，直至細胞出現(xiàn)明顯的致細胞病變效應，收集細胞病變材料，于-80 °C至室溫(20-25°C )反復凍融 3 次，5000r/min 離心 30min,取上清 250 μ 1，用TRIzol LS( Invitrogen)試劑按照說明書提取RNA，最后溶于50 μ I滅菌水，_80°C保存?zhèn)溆谩６?、RT-PCR擴增的反應體系采用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5 μ L (預處理的方法模板RNA在95°C 5分鐘后迅速置于冰浴中的預處理可以增加檢測的靈敏度，以下同。)，5 X AMVbuffer，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) ,MgC12 (25mM) 2 μ L, dNTPs (25mM) O. 5 μ L,引物(10 μ Μ)各0.5 μ L，AMV酶0.5 μ L，Taq酶0.5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行 RT-PCR 反應，先 45°C 30min,95°C 3min，再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置空白對照。其中5XAMVbuffer 和 Taq 酶 IOXPCRbuffer (Mg2+free)米用不同的組合I) 5 X AMV buffer O μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L2) 5 X AMV buffer I μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+ffee) 2 μ L3) 5 X AMV buffer 2 μ L, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) I. 5μ L4) 5 X AMV buffer 3 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) I μ L5) 5 X AMV buffer 4 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 0. 5 μ L6) 5 X AMV buffer 5 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) OyL三、檢測結(jié)果判定取8 μ I擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示 5XAMV buffer I μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L 時結(jié)果最好。實施例3
鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒不同濃度的Mg2+的優(yōu)化一、取待檢樣品提取病毒RNA:待SVCV感染的EPC細胞出現(xiàn)90%病變后收獲(制備方法同實施例2)，于_80°C至室溫反復凍融3次，5000r/min離心30min,取上清250 μ 1，用TRi/οΓ LS試劑按照說明書提取RNA，最后溶于50 μ I滅菌水，_80°C保存?zhèn)溆?。二、RT-PCR擴增的反應體系采用25μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5yL，5XAMV bufferI μ L, Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM)，dNTPs (25mM) 0. 5 μ L,弓 I 物(10 μ Μ)各O. 5 μ L，AMV酶O. 5 μ L，Taq酶0· 5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR 反應，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置空白對照。 其中MgCl2 (25mM)添加量分別為 O μ L、0. 5 μ L、I μ L、I. 5 μ L 和 2 μ L。三、檢測結(jié)果判定取8 μ I擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示MgCl2 (25mM)添加量為I μ L時結(jié)果最好。實施例4 鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測方法的特異性—、取待檢樣品提取病毒RNA:SVCV (張朋，劉葒，陳孝煊，等.鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J]，中國預防獸醫(yī)學報，2011，33 (4) :305-308.)感染的EPC細胞、CRV (曾令兵、徐進、李艷秋，等.斑點叉尾鮰出血病病原呼腸孤病毒的分尚與鑒定[J]，病毒學報，2009, 25(6) =460-466.)感染的 CCO 細胞、GCRV-104 株(CCTCC N0:V201217)感染的 CIK 細胞出現(xiàn)90%病變后收獲(上述病毒的制備方法同SVCV)，于-80°C至室溫反復凍融3次，5000r/min離心301^11，取上清25(^1，用11112()_1^試劑按照說明書提取1 ^，最后溶于5(^1滅菌水，-80°C保存?zhèn)溆?。二、RT-PCR擴增的反應體系采用25μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5yL，5XAMV bufferI μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物(10 μ M)各0· 5 μ L，AMV酶0· 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR 反應，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置空白對照。三、檢測結(jié)果判定取8 μ I擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示能夠檢測出SVCV，而GCRV-104、CRV和空白對照均無法檢出(圖I)。
權(quán)利要求
1.一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括以下成分 該試劑盒包括以下成分5XAMV緩沖液，無鎂Taq酶IOXPCR緩沖液，MgCl2，dNTPs，引物 SVCVF 和 SVCVR，AMV 酶，Taq 酶；SVCVF: 5’ - ggaatccccatatttgttccatc - 3f ；SVCVR: 5’ - tcacaagttgttttccattcagc - 3’。
2.利用權(quán)利要求I所述的一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，其步驟是 1)、病毒RNA的獲取 采用TRIzof或TRIzofLS試劑或柱吸附洗脫法提取樣本總RNA ； 2)、RT-PCR擴增: 采用25 μ I反應體系在PCR管中加入步驟I)中獲得的總RNA 5 μ L，5XAMV緩沖液I μ L，無鎂 Taq 酶 IOXPCR buffer 緩沖液 2yL，25mM MgCl2 I μ L,25mM dNTPs O. 5 μ L,10μ M 引物 SVCVF 和 SVCVR 各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 yL，Taq 酶 0.5 μ L，補加滅菌水至 25 μ L ;放入 PCR 儀進行 RT-PCR 反應，先 45°C 30 min，95°C 3min，再按 95°C 20s -55°C 20s -72°C20s作35個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C下保溫，同時設置陽性對照和陰性空白對照； 所述的引物SVCVF為SEQ ID NO. I所示，SVCVR為SEQ ID NO. 2所示； 3)、檢測結(jié)果判定，采用下述方式 取擴增產(chǎn)物，用2% w/v的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示在210bp大小處有條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，屬于魚類病毒檢測技術領域，一種鯉春病毒血癥病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括以下成分5×AMV緩沖液，無鎂Taq酶10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTPs，引物SVCVF和SVCVR，AMV酶，Taq酶。本發(fā)明具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點，可在3小時內(nèi)準確檢測出樣品中的SVCV，能檢測SVCV感染的病魚組織，也能檢測SVCV感染的細胞，非常適用于SVCV的快速檢測。
文檔編號C12Q1/70GK102876810SQ20121040295
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者張輝, 曾令兵, 周勇, 范玉頂, 徐進 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所