專利名稱：永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞，具體涉及一種能夠穩(wěn)定表達出人端粒酶催化亞基hTERT的干細胞系。本發(fā)明還涉及該干細胞系的建立方法和應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種含有人端粒酶催化亞基基因htert的重組慢病毒載體的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
人間充質(zhì)干細胞(Human Mesenchymal Stem Cells,以下簡稱為hMSCs)是可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)方面及作為基因治療的靶向細胞，在細胞替代與基因治療方面具有廣泛臨床應(yīng)用前景。但hMSCs許多方面存在有待解決的問題，尤其是自體hMSCs在移植應(yīng)用中數(shù)量不 足，限制了臨床應(yīng)用。解決這一問題的主要途徑應(yīng)包括兩個方面一是增強hMSCs的增殖活力，二是應(yīng)用異體或異種hMSCs。但異體移植有免疫學(xué)問題，因此，永生化的人間充質(zhì)干細胞的建立是非常有意義的工作。端粒是染色體末端串連、重復(fù)的TTAGGG序列，在正常細胞分裂過程中會逐漸變短。當端粒在一個或多個染色體中縮短到某一極限值時，細胞衰老和生長停止就會發(fā)生。端粒的長度是由端粒酶維持的。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶催化亞基，實驗表明，外源性htert基因?qū)爰毎商岣叨肆Ｃ富钚?，延緩細胞的衰老，保持了多向分化潛能并沒有致瘤傾向。這說明用htert基因轉(zhuǎn)染修飾hMSCs可以達到延長hMSCs生命周期、保持多向分化潛能的目的。Simonsen J. L等通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將hTERT轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細胞hMSCs,篩選到的骨髓hMSCs細胞克隆在體外培養(yǎng)到200代，細胞無衰老跡象、并保持了多向分化潛能。本研究通過構(gòu)建重組慢病毒載體plvx-htert，慢病毒載體感染效率高，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在細胞內(nèi)長時間的表達且安全性高。將人端粒酶的催化亞基hTERT導(dǎo)入到臍帶間充質(zhì)干細胞中，使細胞能夠長期傳代，建立起永生化的人臍帶間充質(zhì)干細胞系尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，篩選出永生化的人臍帶間充質(zhì)干細胞，以解決干細胞取材難及細胞分裂有限的問題，為基礎(chǔ)研究及基因治療提供充足的細胞來源。本發(fā)明通過構(gòu)建重組慢病毒載體plvx-htert,將人端粒酶的催化亞基基因htert導(dǎo)入到臍帶間充質(zhì)干細胞中，篩選出了能夠穩(wěn)定表達出hTERT的干細胞系，經(jīng)過細胞培養(yǎng)及各種水平的鑒定，證明已經(jīng)獲得了永生化的臍帶間充質(zhì)干細胞系，該細胞系保持分化能力，沒有致瘤傾向，可以作為表達各種抗原與抗體的基因載體。本發(fā)明具體進行了以下研究I、構(gòu)建了含有人端粒酶催化亞基基因htert的重組慢病毒載體plvx-htert。與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，成功地包裝出含有htert的重組慢病毒，并測定了重組慢病毒的滴度。2、篩選出陽性的hMSC-hTERT細胞系用含有htert重組慢病毒載體感染分離到的第二代人臍帶hMSCs，在嘌呤霉素的篩選下，成功地篩選出陽性的hMSC-hTERT，并繼續(xù)培養(yǎng)，已成功地將hMSC-hTERT細胞培養(yǎng)到105代細胞。將此細胞系進行了生物材料保藏，保藏編號為CGMCC No. 6609。3、用多種方法證明了上述所得hMSC-hTERT細胞系的生物活性、功能I)用實時定量PCR及常規(guī)PCR技術(shù)在DNA、RNA及水平檢測了 htert基因的表達 水平明顯增加；2)用端粒酶活性試劑盒(Trapeze telomerase detection kit)和銀染的方法鑒定hMSC-hTERT細胞系具有端粒酶的活性；3)細胞流式分析表明該細胞系表面標記均符合hMSCs特征；4)用成骨試劑誘導(dǎo)hMSC-hTERT細胞系，堿性磷酸酶水平升高，證明能夠誘導(dǎo)出成骨細胞，表明hMSC-hTERT仍然具有多向分化能力；5)核型分析表明hMSC-hTERT具有正常的二倍體特征；6)可作為基因治療的有效的載體將用于治療EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染的包含潛伏膜蛋白2 (LMP2)基因的重組腺病毒感染hMSC-hTERT，免疫酶方法檢測結(jié)果表明，hMSC-hTERT細胞系表達出LMP2蛋白。用含有2G12抗HIV中和抗體的重組慢病毒去感染該細胞系，用ELISA方法鑒定出細胞上清中能夠表達出中和抗體2G12，濃度可以達到5μ g/ml。因此，建立的hMSC-hTERT可以聞效的表達外源基因，可作為基因治療的有效的載體。4、證實了該細胞系的安全性小鼠致瘤實驗表明，建立的hMSC-hTERT細胞系在小鼠體內(nèi)沒有致瘤現(xiàn)象，證實該細胞系沒有致瘤性，比較安全。本發(fā)明解決了細胞取材難及細胞分裂有限的問題，為基礎(chǔ)研究及基因治療提供充足的hMSCs細胞來源。永生化的臍帶hMSCs干細胞可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)方面及作為基因治療的靶向細胞。本發(fā)明的優(yōu)點首先，本發(fā)明使用慢病毒載體將人端粒酶催化亞基導(dǎo)入到人臍帶hMSCs中，慢病毒效率比較高，并且能夠感染非分裂時期的細胞。第二，成功地篩選到了 hTERT陽性的細胞系hMSCs-hTERT，在體外培養(yǎng)已達到105代，遠遠地超過了臍帶間充質(zhì)干細胞的體外增殖能力，證明成功地獲得永生化的人臍帶間充質(zhì)干細胞系。第三，篩選到的細胞系細胞形態(tài)及細胞表面抗原均符合人臍帶間充質(zhì)干細胞特征，核型分析表明該細胞仍然是二倍體細胞，保持分化潛能，并且沒有致瘤傾向。


圖I中，A為構(gòu)建的重組慢病毒載體plvx-htert圖譜；B為重組慢病毒載體plvx-htert瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞后，hTERT表達的免疫熒光結(jié)果圖，圖中白色亮點為hTERT陽性表達細胞，暗色為陰性表達細胞圖2中，A為在RNA水平式上測定htert基因的RealTime-PCR結(jié)果，18s為內(nèi)參；B為DNA水平上PCR結(jié)果圖，所用兩對引物均跨內(nèi)含子，1、2為hMSCs-hTERT細胞系、3為hMSCs、4為陰性對照。圖3為用TRAP-ELISA銀染方法檢測細胞中端粒酶活性圖，圖中PC為陽性對照，C為陰性對照，hMSCs對照，能夠穩(wěn)定表達出綠色熒光蛋白的hMSC-gfp細胞系及hMSC-hTERT圖4是建立的人臍帶間充質(zhì)干細胞系hMSC-hTERT不同代數(shù)可見光圖片，分別是19、39、67 和 89 代 hMSC-hTERT 細胞系圖5為建立的人臍帶間充質(zhì)干細胞系的誘導(dǎo)分化成骨情況圖，A圖為未誘導(dǎo)hMSC-hTERT ；B圖為誘導(dǎo)成骨的hMSC-hTERT，經(jīng)堿性磷酸酶染色結(jié)果，深色部分為堿性磷酸 酶染色圖像。圖6是hMSCs-hTERT小鼠致瘤實驗結(jié)果圖，左邊組為Hela細胞，中間組為磷酸緩沖液PBS，右邊組為hMSC-hTERT P70細胞圖7將治療EBV的Adv-lmp2感染hMSC-hTERT細胞系，用免疫酶檢測LMP2在hMSC-hTERT中的表達情況(左陰性對照；右免疫酶檢測LMP2結(jié)果)生物材料保藏信息培養(yǎng)物名稱永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞系hMSC-hTERT保藏編號CGMCCNo. 6609保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏時間2012年9月28日
具體實施例方式以下實驗中所用到的一些材料的來源如下
試劑或者質(zhì)粒來源
穿梭質(zhì)粒pivxClontech公司
Alpha MEMHyclone 公
胎牛血清FB SHyclone公司
EcoriNEB 公 n'j
XbaINEB 公司
FuGene HDRoche 公 “j
P24定量檢測試劑盒Clontech公司
polybreneAmesco 公
89.6 和 NL4-3 HIV 毒株NIH
Trapeze telomerasedetection kitChemicon 公司
實施例I人臍帶間充質(zhì)干細胞系的建立及鑒定I.細胞分離及培養(yǎng)采用PercolI密度梯度離心法從臍帶中分離到人臍帶間充質(zhì)干細胞；AlphaMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)，細胞生長至80%_90%以1:3傳代。2.重組慢病毒載體plvx-htert的構(gòu)建和鑒定分別提取高純度的pEGFP-htert及plvx，限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切鑒定。用凝膠回收試劑盒從pEGFP-htert質(zhì)粒和plvx質(zhì)粒酶切產(chǎn)物中回收純化htert和線形化Plvx片段。16°CT4連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌接種于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。挑菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，EcoRI和XbaI雙酶切鑒定，并進行測序鑒定。鑒定正確后，將該重組載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞，用免疫熒光的方法，鑒定該質(zhì)粒能否夠表 出達端粒酶催化亞基hTERT蛋白(圖I)。3.重組慢病毒包裝及滴度測定慢病毒載體感染效率非常高，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在細胞內(nèi)長時間的表達且安全性高。包裝出重組慢病毒準確的測定出病毒的滴度，以適當?shù)腗OI (感染復(fù)數(shù))去感染細胞，達到更好的效果。用質(zhì)粒提取試劑盒提取高純度plvx-htert重組質(zhì)粒,并測定濃度。實驗前I天，將293T細胞按照4X IO6的量接種到I個直徑IOcm的培養(yǎng)皿中，細胞使用含有10%FBS (無四環(huán)素)的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。實驗當日，待細胞密度長到85%-90%時，將提取的高質(zhì)量的plvx-htert質(zhì)粒7 μ g與慢病毒包裝質(zhì)粒混合物36 μ I及FuGene HD轉(zhuǎn)染試劑75 μ I混勻，孵育30min后共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后72h收獲細胞上清，300g離心后，用O. 45 μ m濾器過濾上清液。使用Clontech公司P24定量檢測試劑盒對獲得的重組病毒滴度進行檢測。結(jié)論成功地包裝出了含有htert基因的重組慢病毒，病毒滴度可以達到IX IO74.重組慢病毒感染臍帶hMSCs使用含有10%FBS的a -MEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，實驗前I天，將hMSCs接種到六孔板中，次日，細胞達到70-90%滿，將獲得的重組慢病毒按照MOI 10-20:1的量感染細胞，感染時加入8 μ g/mL的polybrene，感染后6h細胞換液，感染后24_48h加入嘌呤霉素篩選，繼續(xù)培養(yǎng)5-7天至對照細胞全部死亡時得到hMSC-hTERT細胞株。繼續(xù)培養(yǎng)篩選到的細胞。5. PCR 及 RT-PCR 方法鑒定 hMSC-hTERT 細胞株。為了檢測出導(dǎo)入到hMSCs細胞中的htert基因是否能夠穩(wěn)定的表達，分別提取hMSCs、hMSC-hTERT細胞的DNA及RNA，設(shè)計兩對跨內(nèi)含子的兩對引物，以基因組DNA為模板，進行PCR，鑒定建立的hMSC-hTERT細胞系中htert基因的整合情況。以RNA為模板，進行RT-PCR鑒定端粒酶在建立的人臍帶hMSC-hTERT及普通的人臍帶hMSCs的表達水平的差異(見圖2)。在DNA水平上PCR，凝膠電泳結(jié)果顯示，在hMSC-hTERT細胞系中，能夠擴增出大約360bp和540bp的htert基因的片段，而在未轉(zhuǎn)入htert基因的hMSCs中不能夠擴增出相應(yīng)的片段，表明hMSC-hTERT中外源的htert基因已經(jīng)成功的整合到了細胞染色體中。mRNA水平上熒光定量PCR結(jié)果顯示，hMSC-hTERT中htert的檢測Ct值明顯低于常規(guī)的hMSCs細胞的Ct值，表明hMSC-hTERT細胞系中htert基因在mRNA上水平上的表達量遠遠大于未經(jīng)重組慢病毒感染的hMSCs。
6. hMSC-hTERT細胞端粒酶活性檢測按照端粒酶活性檢測試劑盒(TRAPEZE Telomerase Detection Kit)說明書檢測hMSC-hTERT細胞端粒酶活性，以hMSCs為對照。結(jié)果見圖3在hMSC-hTERT細胞系經(jīng)試劑盒檢測并銀染后，可以看到相差6bp的DNA ladder，而對照組中并未出現(xiàn)DNA ladder。表明在hMSC-hTERT細胞系能夠表達出端粒酶，并且該酶具有端粒酶的活性。7.細胞表面標記鑒定用流式細胞儀對hMSC-hTERT細胞系進行表面抗原分析。分別對P50代的hMSC-hTERT 細胞表面抗原 CD105、CD29、CD44、CD106、CD45、CD14 進行分析。結(jié)果表明，CD105+88. 77%, CD29+ 93. 63%, CD44+ 90. 29% 不表達 cdl06, cd45, cdl4, 93. 63%細胞表型似hMSCs，建立的細胞系仍然具有hMSCs的細胞表型。核型分析和誘導(dǎo)分化按照常規(guī)的染色體制片技術(shù)，對hMSC-hTERT細胞系51代細胞進行染色體分析。細胞核型為二倍體。并對該細胞系制作細胞爬片，用誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，細胞進行堿性磷酸酶染色，確定細胞是否能夠誘導(dǎo)成為成骨細胞。經(jīng)過誘導(dǎo)后的細胞染色，顏色為深紫色(見圖5)，表明有大量的堿性磷酸酶表達，是成骨細胞的一個重要特征。SCID小鼠致瘤實驗為了檢測建立的臍帶間充質(zhì)干細胞系hMSC-hTERT是否具有致瘤的傾向及細胞應(yīng)用的安全性，進行了 SCID小鼠的致瘤實驗。接種到小鼠體內(nèi)后能否形成惡性腫瘤是檢驗細胞是癌細胞惡性程度的重要指標。SCID小鼠因為細胞和體液免疫缺陷而有利于腫瘤細胞的增殖。實驗方法將傳代第70代的hMSC-hTERT細胞消化制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2X 107/ml。SCID雄性5周齡小鼠。各組小鼠分別于前肢皮下注射O. 25ml細胞懸液。陽性對照為Hela細胞，接種量為IXlO6 ;陰性對照為磷酸鹽緩沖液PBS ;定期觀察小鼠生長和腫瘤生長情況。結(jié)果小鼠接種細胞25天后，Hela細胞組(左側(cè)三只小鼠)腋下就已經(jīng)開始呈現(xiàn)出腫瘤，而hMSC-hTERT (中間三只)及PBS組(右側(cè)三只)并沒有產(chǎn)生。后經(jīng)過兩個月的觀察，Hela組腫瘤繼續(xù)增大，而hMSC-hTERT及PBS組仍然沒有出現(xiàn)腫瘤的跡象。圖6為接種細胞后45天小鼠經(jīng)過苯巴比妥鈉麻醉后拍攝照片。結(jié)論接種hMSC-hTERT細胞系兩個月后，SCID小鼠仍然沒有出現(xiàn)腫瘤的傾向，表明hMSC-hTERT沒有致瘤的傾向，是安全的。hMSC-hTERT 細胞培養(yǎng)對hMSC-hTERT細胞系繼續(xù)使用含有10%FBS的a -MEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，現(xiàn)在已經(jīng)培養(yǎng)到了第105代細胞，細胞形態(tài)沒有發(fā)生改變(見圖4)，已經(jīng)遠遠的超過了普通的人臍帶hMSCs的細胞傳代次數(shù)，表明我們已經(jīng)獲得永生化的人臍帶間充質(zhì)干細胞系。實施例2EBV腺病毒疫苗Adv_lmp2在hMSC-hTERT中的表達應(yīng)用LMP2是EBV病毒中的潛伏蛋白，LMP2已經(jīng)被證實可以誘發(fā)較強的特異性CTL反應(yīng)，可以用于對鼻咽癌的預(yù)防和治療。用Adv-lmp2感染hMSC-hTERT細胞，使其能夠不斷地表達出LMP2，能夠不斷誘導(dǎo)出特異性的CTL (細胞毒性T淋巴細胞)反應(yīng)。
hMSC-hTERT細胞系使用含有10%FBS的a -MEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，提前實驗前I天，將細胞接種到六孔板中，次日，細胞達到70-90%，將構(gòu)建的重組腺病毒載體Adv-lmp2按照MOI 10:1感染細胞。4h后換液。感染后第三天，用胰酶消化收集細胞，做成細胞滴片。用免疫酶方法檢測LMP2蛋白在hMSC-hTERT細胞系中的表達情況，結(jié)果表明LMP2蛋白可以有效地在hMSC-hTERT細胞系中進行表達(圖7)。結(jié)論hMSC_hTERT細胞能夠穩(wěn)定的表達出LMP2蛋白，在體內(nèi)長期表達出LMP2，可以不斷得誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異性的CTL反應(yīng)。實施例3 2G12廣譜抗HIV中和抗體在hMSC-hTERT中的表達研究實驗?zāi)康?G12是一種能夠有效地中和HIV毒株的抗體。將表達2G12全基因的慢病毒載體去感染hMSC-hTERT，使該細胞能夠持續(xù)不斷地分泌出對HIV有中和活性的抗體2G12，人間充質(zhì)干細胞的免疫原性低，因此hMSC-hTERT可以作為有效地表達中和抗體的載 體，在體內(nèi)可以持續(xù)不斷的分泌出2G12，從而達到清除HIV的目的，為艾滋病的治療提供一個新的途徑。hMSC-hTERT細胞系使用含有10%FBS的a -MEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，提前實驗前I天，將細胞接種到六孔板中，次日，細胞達到70-90%，將含有2G12全基因的重組慢病毒plvx-2G12按照MOI 10:1的量感染hMSC-hTERT細胞后，6h后換液。第三天用ELISA方法檢測細胞上清液中2G12中和抗體的表達情況。結(jié)果在感染后第三天2G12中和抗體在hMSC-hTERT細胞系中表達量可以達到
5μ g/mlο結(jié)論建立的hMSC-hTERT可以有效地表達出廣譜中和抗體2G12，可以作為中和抗體有效的載體，為HIV病毒的治療提供一個新的途徑。
權(quán)利要求
1.保藏編號為CGMCCNo. 6609的人臍帶間充質(zhì)干細胞系hMSC-hTERT。
2.一種可穩(wěn)定表達出人端粒酶的催化亞基hTERT的細胞系，其特征是人臍帶間充質(zhì)干細胞中導(dǎo)入了人端粒酶的催化亞基hTERT。
3.含有人端粒酶催化亞基基因htert的重組慢病毒載體。
4.權(quán)利要求3所述載體的構(gòu)建方法，其特征是將人端粒酶催化亞基基因htert構(gòu)建到表達載體plvx，然后與包裝質(zhì)粒包裝出重組慢病毒。
5.權(quán)利要求I或2所述的干細胞系在制備防治EB病毒感染藥物方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I或2所述的干細胞系在制備提高端粒酶活性的制劑方面的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I或2所述的干細胞系在制備促進細胞再生制劑方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明獲得了永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞系。通過構(gòu)建重組慢病毒plvx-htert載體，將人端粒酶的催化亞基hTERT導(dǎo)入到臍帶間充質(zhì)干細胞中，篩選出了能夠穩(wěn)定表達出hTERT的干細胞系。經(jīng)過細胞培養(yǎng)及各種水平的鑒定，證明所獲得的是一種永生化的臍帶間充質(zhì)干細胞系，該細胞系保持分化能力。本發(fā)明還用多種方法證實了該細胞系的生物活性、功能，證明其可作為基因治療的有效的載體。本發(fā)明還通過小鼠致瘤實驗表明該細胞系的安全性，沒有致瘤傾向。
文檔編號C12N5/10GK102965341SQ20121043091
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者曾毅, 郝彥哲, 滕智平, 馬晶, 張曉梅, 李東升 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 北京工業(yè)大學(xué), 曾毅, 郝彥哲, 滕智平