專利名稱：一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurr1基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，具體地說是一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元成熟所必須的Nurrl基因的方法。
背景技術(shù)：
Nurrl 基因(Nuclear related factor I)又稱之為 N0T/TINUR/RNR-1/HZF-3,作為即早基因產(chǎn)物，屬于孤兒核受體超家族。Nurrl蛋白幾乎完全集中表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，與神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化及多巴胺能神經(jīng)元生存和發(fā)展關(guān)系密切。研究表明,Nurrl蛋白能夠通過多種途徑激活酪氨酸輕化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)啟動(dòng)子， 促進(jìn)TH的表達(dá)。此外，還影響多巴胺能神經(jīng)元代謝，促進(jìn)中腦多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化，并在分化的維持及晚期分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起決定性作用。帕金森(PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病。其基本的病理改變是特異性的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性變性壞死，致使紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)減少，引起錐體外系的功能失調(diào)，從而產(chǎn)生靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直等一系列運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。目前，臨床上尚無有效的治療H)的方法。理論上講,細(xì)胞移植替代治療是最為理想的治療途徑。目前，體外獲得的多巴胺能神經(jīng)元多由胚胎干細(xì)胞(ESCs)或神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)誘導(dǎo)分化而成。但是倫理學(xué)、安全性問題以及細(xì)胞來源和數(shù)量的有限，在一定程度上都限制了其未來的的臨床移植應(yīng)用。有研究表明，在多因子誘導(dǎo)條件下可將來源更為豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，但陽性率較低。為了進(jìn)一步提高陽性率，目前，國內(nèi)主要采用Nurrl基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法來提高Nurrl基因的表達(dá)，使其更易向多巴胺能神經(jīng)元分化。但對(duì)于未來的臨床應(yīng)用，基因修飾方法也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。如何通過非基因修飾的方法使得間充質(zhì)干細(xì)胞自身高表達(dá)Nurrl基因，是目前急需解決的重要課題。此外，國內(nèi)目前研究向多巴胺能神經(jīng)元分化的間充質(zhì)干細(xì)胞多來自骨髓、臍血等。 與之相比，臍帶源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UC_MSCs)取材更為方便、體外擴(kuò)增能力更強(qiáng)且免疫原性低。在短時(shí)間內(nèi)即可獲得數(shù)量充足、安全而且適于移植應(yīng)用的細(xì)胞，是未來臨床應(yīng)用更為理想的種子細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá) Nurrl基因的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因的方法，在添加了維甲酸(RA)、環(huán)化腺核苷一磷酸(CAMP)和Sonic Hedgehog(SHH)的DMEM/F-12培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因。所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于DMEM/F_12培養(yǎng)體系添加的RA為10_6 M 10_4 M、CAMP 為 O. 5 mM 2 mM 和 SHH 為 200 ng/mL 750 ng/mL。所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于上述的培養(yǎng)體系添加的RA的優(yōu)選量為1(T5M，CAMP 的優(yōu)選量為I HiM和SHH的優(yōu)選量為500 ng/mL。具體包括以下步驟
1)取2 8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80% 90%融合時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取5 10 mL O. OlM磷酸緩沖液PBS輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；
2)加入(質(zhì)量/體積比)0.25%胰蛋白酶-O. 01%乙二胺四乙酸EDTA消化液I. O mL, 浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0 mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
3)加入20mL O. 01 M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種5X IO5個(gè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
4)培養(yǎng)體系為含體積比濃度為5%胎牛血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的 DMEM/F-12 完全培養(yǎng)液，添加了 1(T5 M RAU mM CAMP和 500 ng/mL SHH，總體積為 5 mL/瓶， 置37 C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4天。本發(fā)明的有益效果是通過體外誘導(dǎo)，而非基因修飾的方法使間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因，更利于移植應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本誘導(dǎo)方法可以使間充質(zhì)干細(xì)胞Nurrl 基因的表達(dá)明顯增高(約為誘導(dǎo)前的23倍)，使其更易向多巴胺能神經(jīng)元分化，且避免了由基因修飾所帶來的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床提供更為理想的種子細(xì)胞。誘導(dǎo)使用的間充質(zhì)干細(xì)胞可以來源于骨髓、臍血、脂肪等組織，但最好是取自臍帶來源。與胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便、易于體外擴(kuò)增、免疫源性低且合乎倫理學(xué)要求，可在短時(shí)間內(nèi)為臨床提供適用于移植應(yīng)用的細(xì)胞。


圖I是PCR檢測(cè)UC-MSCs誘導(dǎo)前后的Nurrl表達(dá)情況 I: UC-MSCs誘導(dǎo)前β-actin的表達(dá)情況；
2: UC-MSCs誘導(dǎo)前Nurrl的表達(dá)情況；
3: UC-MSCs誘導(dǎo)后12h Nurrl的表達(dá)情況;
4: UC-MSCs誘導(dǎo)后24h Nurrl的表達(dá)情況;
5: UC-MSCs誘導(dǎo)后48h Nurrl的表達(dá)情況;
6: UC-MSCs誘導(dǎo)后72h Nurrl的表達(dá)情況。圖2是Real-time檢測(cè)UC-MSCs誘導(dǎo)前后的Nurrl表達(dá)情況
1=Nurrl在未誘導(dǎo)的MSC中的表達(dá)情況；
2:誘導(dǎo)72h后，Nurrl的表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。
本發(fā)明體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因的方法，在添加了 RA、 CAMP和SHH的DMEM/F-12培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因。所述DMEM/F-12培養(yǎng)體系添加的RA為1(Γ6Μ 1(Γ4Μ ,CAMP為O. 5 mM 2 mM和 SHH 為 200 ng/mL 750 ng/mL。下面通過具體實(shí)施例敘述
實(shí)施例一
I.誘導(dǎo)
(1)取P4代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取10 mL O. OlM憐酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates， EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL 0.01 M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種5X IO5個(gè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
(4)培養(yǎng)體系為含5%胎牛血清，10011/1^青霉素，10(^8/1^鏈霉素的01^1/^-12完全培養(yǎng)液，添加了 KT6M RA,O. 5 mM CAMP 和 200 ng/mL SHH，總體積為 5 mL/瓶。置 37 C， 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4天。2. Nurrl基因的鑒定
采用RT-PCR和real time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)試劑并參照試劑盒說明書提取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12、24、48和72小時(shí)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，然后以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。50 uL反轉(zhuǎn)錄體系為5XMLV反轉(zhuǎn)錄緩沖液10 uL， dNTPs(10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制劑 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水補(bǔ)足至50 uLo然后以合成的cDNA為模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 uL的PCR反應(yīng)體系為10 XPCR緩沖液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，雙蒸水14 uLo同時(shí)以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,其引物序列為Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明， 與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平明顯增高。同時(shí),用real time PCR進(jìn)一步確定誘導(dǎo)前后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為采用Roche LightCycIer 2.0系統(tǒng)。使用前,將LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 試劑盒內(nèi)的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并將實(shí)驗(yàn)所需毛細(xì)管(Roche)放入毛細(xì)管冰盒內(nèi)(Roche)。在每個(gè)毛細(xì)管內(nèi)加入如下反應(yīng)體系水(PCR級(jí))9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I μ L，Master Mix4 μ L , cDNA 5 μ L。根據(jù)擴(kuò)增顯示的Cp (crossing point)值,計(jì)算基因表達(dá)量的變化。 反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次，以消除系統(tǒng)誤差。結(jié)果從RNA水平上看，誘導(dǎo)后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi) Nurrl基因的表達(dá)水平約為誘導(dǎo)前的8倍。實(shí)施例二 I.誘導(dǎo)
(1)取P4代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取10 mL O. OlM憐酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL 0.01 M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種5X IO5個(gè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
(4)培養(yǎng)體系為含5%胎牛血清，10011/1^青霉素，10(^8/1^鏈霉素的01^1/^-12完全培養(yǎng)液，添加了 KT5M RA、I. O mM CAMP 和 500 ng/mL SHH，總體積為 5 mL/瓶。置 37 C， 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4天。3. Nurrl基因的鑒定
采用RT-PCR和real time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)試劑并參照試劑盒說明書提取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12、24、48和72小時(shí)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，然后以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。50 uL反轉(zhuǎn)錄體系為5XMLV反轉(zhuǎn)錄緩沖液10 uL， dNTPs (10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制劑 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水補(bǔ)足至50 uLo然后以合成的cDNA為模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 uL的PCR反應(yīng)體系為10 XPCR緩沖液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，雙蒸水14 uLo同時(shí)以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,其引物序列為Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明， 與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平明顯增高。同時(shí),用real time PCR進(jìn)一步確定誘導(dǎo)前后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為采用Roche LightCycler 2.0系統(tǒng)。使用前,將LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 試劑盒內(nèi)的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并將實(shí)驗(yàn)所需毛細(xì)管(Roche)放入毛細(xì)管冰盒內(nèi)(Roche)。在每個(gè)毛細(xì)管內(nèi)加入如下反應(yīng)體系水(PCR級(jí))9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I μ L，Master Mix 4 μ L , cDNA 5 μ L。根據(jù)擴(kuò)增顯示的Cp (crossing point)值,計(jì)算基因表達(dá)量的變化。 反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次，以消除系統(tǒng)誤差。結(jié)果從RNA水平上看，誘導(dǎo)后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平約為誘導(dǎo)前的20倍。實(shí)施例三 I.誘導(dǎo)
(1)取P4代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取10 mL O. OlM憐酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL O. 01 M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種5X IO5個(gè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
(4)培養(yǎng)體系為含5%胎牛血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，添加了 KT4M RA,2. O mM CAMP 和 750 ng/mL SHH，總體積為 5 mL/瓶。置 37 C， 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4天。2. Nurrl基因的鑒定
采用RT-PCR和real time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)試劑并參照試劑盒說明書提取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12、24、48和72小時(shí)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，然后以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。50 uL反轉(zhuǎn)錄體系為5XMLV反轉(zhuǎn)錄緩沖液10 uL， dNTPs (10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制劑 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水補(bǔ)足至50 uLo然后以合成的cDNA為模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 uL的PCR反應(yīng)體系為10 XPCR緩沖液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，雙蒸水14 uLo同時(shí)以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,其引物序列為Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明， 與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平明顯增高。同時(shí),用real time PCR進(jìn)一步確定誘導(dǎo)前后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為采用Roche LightCycler 2.0系統(tǒng)。使用前,將LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 試劑盒內(nèi)的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并將實(shí)驗(yàn)所需毛細(xì)管(Roche)放入毛細(xì)管冰盒內(nèi)(Roche)。在每個(gè)毛細(xì)管內(nèi)加入如下反應(yīng)體系水(PCR級(jí))9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I μ L，Master Mix 4 μ L , cDNA 5 μ L。根據(jù)擴(kuò)增顯示的Cp (crossing point)值,計(jì)算基因表達(dá)量的變化。 反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次，以消除系統(tǒng)誤差。結(jié)果從RNA水平上看，誘導(dǎo)后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi) Nurrl基因的表達(dá)水平約為誘導(dǎo)前的13倍。實(shí)施例四I.誘導(dǎo)
Cl)分別取P2、P3、P4、P5、P6和P7代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%_90% 融合時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取10 mL O. OlM磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL O. 01 M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種5 X IO5個(gè)各代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
(4)培養(yǎng)體系為含5%胎牛血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，添加了 KT5M RA、I mM CAMP和SHH為500 ng/mL，總體積為5 mL/瓶。置37 C， 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4天。2. Nurrl基因的鑒定
采用RT-PCR和real time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)試劑并參照試劑盒說明書提取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12、24、48和72小時(shí)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，然后以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。50 uL反轉(zhuǎn)錄體系為5XMLV反轉(zhuǎn)錄緩沖液10 uL， dNTPs (10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制劑 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水補(bǔ)足至50 uLo然后以合成的cDNA為模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 uL的PCR反應(yīng)體系為10 XPCR緩沖液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，雙蒸水14 uLo同時(shí)以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,其引物序列為Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明， 與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平明顯增高(如圖I所示)。同時(shí),用real time PCR進(jìn)一步確定誘導(dǎo)前后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nurrl基因的表達(dá)水平。具體方法為采用Roche LightCycler 2.0系統(tǒng)。使用前,將LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 試劑盒內(nèi)的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并將實(shí)驗(yàn)所需毛細(xì)管(Roche)放入毛細(xì)管冰盒內(nèi)(Roche)。在每個(gè)毛細(xì)管內(nèi)加入如下反應(yīng)體系水(PCR級(jí))9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I yL，Master Mix 4 μ L , cDNA 5 μ L。根據(jù)擴(kuò)增顯示的Cp (crossing point)值,計(jì)算基因表達(dá)量的變化。反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次，以消除系統(tǒng)誤差。結(jié)果從RNA水平上看，P2、P3和P7人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后Nurrl基因的表達(dá)水平約為誘導(dǎo)前的10倍，相比較而言，P4-6間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后的表達(dá)水平約為誘導(dǎo)前的23倍(如圖2所示)，明顯高于前者。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因的方法，其特征是在添加了維甲酸 (RA)、環(huán)化腺核苷一磷酸(CAMP)和Sonic Hedgehog (SHH)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurrl基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F-12。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的RA為10_6M 10_4 M、 CAMP 為 O. 5 mM 2 mM 和 SHH 為 200 ng/mL 750 ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，所述RA為ΙΟΙ，CAMP為ImM和SHH為500 ng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其包含以下步驟(1)取2 8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80% 90%融合時(shí)，吸除T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取5 10 mL O. OlM PBS輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；(2)加入O.25%(w/v)胰蛋白酶-O. 01%(w/v) EDTA消化液I. O mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0 mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入20mL 0.01 M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種5X IO5個(gè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；(4)培養(yǎng)體系為含5%胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液，添加了 1(T5 M RAU mM CAMP和500 ng/mL SHH，總體積為5 mL/瓶，置37 C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurr1基因的方法，在添加了RA、CAMP和SHH的DMEM/F-12培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)Nurr1基因。本發(fā)明通過體外誘導(dǎo)方法，而非基因修飾的方法可以使間充質(zhì)干細(xì)胞Nurr1基因的表達(dá)明顯增高(約為誘導(dǎo)前的23倍)使其更易向多巴胺能神經(jīng)元分化，且避免了由基因修飾所帶來的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床提供了更為理想的種子細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便、易于體外擴(kuò)增、免疫源性低且合乎倫理學(xué)要求。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102586183SQ201210008088
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者劉擁軍, 朱德琳, 謝姜, 趙雅寧 申請(qǐng)人:天津和澤干細(xì)胞科技有限公司