專利名稱：肽聚糖結合蛋白BjApextrin1和BjApextrin2及其基因、生產方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新穎的肽聚糖結合蛋白基因及其編碼的蛋白BjApextrinl和BjApextrin2，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應用。
背景技術：
文昌魚屬于脊索動物門(Chordata),頭索動物亞門(Cephalochordata),是無脊椎動物進化到脊椎動物的過渡類型，是五億年前脊椎動物原始祖先的相似模型，一直以來是研究脊椎動物發(fā)育的好材料。近年來，對文昌魚的免疫的研究引起了廣泛的重視，在其中發(fā)現了不少具有重要意義的免疫基因。肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)是幾乎所有細菌的細胞壁的主要成分之一,尤其富含于革蘭氏陽性菌中，也是宿主感知病原菌入侵、激活免疫反應的一種重要的病源相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。妝聚糖可以被多種模式識別分子識別，如肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs), Toll 樣受體 2 (Tol 1-likereceptor 2，TLR2)等。Haag等運用差顯技術將胚胎發(fā)育模式不同的海膽進行對比，發(fā)現Apextrin在直接發(fā)育模式的紅海膽(Heliocidaris erythrogramma)的胚胎中表達豐度明顯高于間接發(fā)育的結節(jié)海膽，胚胎原位雜交顯示Apextrin特異表達于紫海膽胚胎的外胚層。免疫組化實驗證明Apextrin蛋白以分泌泡的形式儲存在卵細胞里面，在卵細胞完成受精以后逐漸開始分泌，當胚胎在囊胚期極化之后Apextrin蛋白就定位于胚胎頂端胞外基質，故稱其為頂端胞外基質蛋白(Apical extracellular matrix protein, Apextrin)。隨后人們又分別在水螅，珊瑚中發(fā)現Apextrin基因,胚胎原位雜交顯示Apextrin也可能參與了水螅和珊瑚的胚胎發(fā)育過程。文昌魚Apextrin基因的表達量在細菌刺激12h后上調了上千倍；紅海膽在受到弧菌感染20h之后Apextrin蛋白的表達量也顯著增加。我們發(fā)現文昌魚的Apextrin可以能夠識別和凝集革蘭氏陽性菌，并且特異結合細菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作為制備治療感染性疾病的藥物，在養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領域具有廣闊的開發(fā)前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的肽聚糖結合蛋白BjApextrinl和BjApextrin2及編碼該蛋白的基因。本發(fā)明的另一目的在于提供該蛋白的生產方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應用。本發(fā)明根據已有的EST序列通過5'和3' RACE，從中國文昌魚的消化道中分離得到文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2基因，其DNA序列如序列表中序列I和序列2序列所示。
本發(fā)明所述基因編碼的蛋白BjApextrinl和BjApextrin2,其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所不；該蛋白等電點分別為6. 05和5. 03,分子量分別為56，671和52，516道爾頓。BjApextrinl和BjApextrin2克隆到大腸桿菌表達載體pET32a上,得到重組表達載體 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2。該蛋白可以通過表達載體pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2在大腸桿菌以不溶的包涵體形式表達。所述表達載體pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2以硫氧還蛋白為融合表達伴體，該系統使表達的BjApextrinl和BjApextrin2包涵體在硫氧還蛋白的幫助下通過變復性正確折疊成為可溶的蛋白。本發(fā)明所選擇的青島文昌魚(Branchiostoma japonicum)采集于山東省沙子口水域。本發(fā)明根據已有的EST序列通過5'和3' RACE，從中國文昌魚的消化道中分離得到文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2基因(其DNA序列如序列表中序列I和序列2序列所示)。分別編碼504和462個氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所示)，等電點分別為6. 05和5. 03，分子量分別為56，671和52，516道爾頓。本發(fā)明通過設計了兩對引物,將基因BjApextrinl和BjApextrin2克隆到大腸桿菌表達載體pET32a (Novagen公司)，構建表達質粒并將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。表達載體pET32a-BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2以硫氧還蛋白為融合表達伴體,該系統使表達的BjApextrinl和BjApextrin2包涵體在硫氧還蛋白的幫助下通過變復性正確折疊成為可溶的蛋白。該重組蛋白分別編碼670和628個氨基酸，等電點分別為5. 80和5. 14，分子量分別為74，374和70，219道爾頓。通過對培養(yǎng)時間，誘導時間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表達量較高,絕大部分以不可溶包涵體形式存在。本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了 BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白的純化條件,菌體進行超聲破碎后，離心取沉淀進行變復性可以得到較純的蛋白。本發(fā)明的表達質粒復制方法參照Sambrook (Sambrook, et al. 1989, Moleculardoing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)方法,用 CaCl2 的方法將質粒轉化E. coli.DH5a或BL21 (DE3)菌株，用含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)轉化菌株,用Omega公司試劑盒提取質粒。本發(fā)明通過細菌結合試驗證明了該重組蛋白具有結合革蘭氏陽性細菌的活性。細菌凝集實驗表明該重組蛋白能夠使糞場球菌和黃色葡萄球菌發(fā)生凝集。酶聯免疫吸附測定(Enzyme-1 inked-immunosorbent assay, ELISA)表明該重組蛋白可以特異性地于肽聚糖結合，融合蛋白和肽聚糖做下拉實驗(Pulldown assay)表明該重組蛋白對肽聚糖的結合活性隨肽聚糖濃度的增加而增強。通過構建缺失突變體我們發(fā)現BjApextrinl的模式識別功能是由C端的一段保守序列決定的。


圖Ia及圖 Ib 分別為 5' RACE和 3' RACE擴增得到的BjApextrinl 和BjApextrin2基因目的片段。1.5' RACE擴增片段；2. 3' RACE擴增片段；3. DNA分子量標準(DL2000)。圖2a及圖2b分別為擴增得到的BjApextrinl和BjApextrin2基因全長片段。圖3 為重組表達質粒 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 構建圖。圖4a及圖4b分別為重組BjApextrinl和BjApextrin2蛋白誘導表達、變復性純化電泳圖。M,蛋白質marker; I,未誘導的超聲上清；2，未誘導的超聲沉淀；3，誘導的超聲上清；4，誘導的超聲沉淀；5,純化后的TRX-Apextrinl和TRX-Apextrin2。圖5為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2的細菌結合試驗結果將約2 X IO7個各種不同的細菌用TBS (ρΗ7·5)洗滌平衡后，與Iyg目的蛋白在Iml TBS (ρΗ7·5)緩沖液中4°C振蕩孵育過夜；41、12000\8離心11^11，沉淀用Iml TBS緩沖液洗5遍；用100 μ ITBS重懸菌體，再加入20 μ I 6 X上樣緩沖液，混勻后沸煮IOmin ;然后進行Western blot分析，用His單克隆抗體來檢測目的蛋白，Sepharose 4Bbead作為陰性對照進行平行實驗。圖6為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2的細菌凝集實驗結果將FITC標記過的糞腸球菌和金黃色葡萄球菌與重組蛋白共孵育，在熒光顯微鏡下面觀測微生物的凝集情況。圖7a及圖7b分別為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2與細菌細胞壁純組分的ELISA實驗結果重組蛋白分別與LPS，LTA, PGN, Mannan和Zymosan進行ELISA實驗。圖8為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2與肽聚糖Pulldown實驗結果將I μ g目的蛋白分別與5，10，20，50 μ g的PGN進行Pul I down實驗。圖9為重組蛋白BjApextrinl缺失突變體誘導表達、變復性純化電泳圖。M,蛋白質marker ;第I泳道，未誘導的TRX- Δ C超聲上清；第2泳道，未誘導的TRX- Δ C超聲沉淀；第3泳道，誘導的TRX- Δ C超聲上清；第4泳道，誘導的TRX- Δ C超聲沉淀；第5泳道，純化后的TRX- Λ C ;第6泳道，未誘導的TRX- Δ N超聲上清 ’第7泳道，未誘導的TRX- Δ N超聲沉淀；第8泳道，誘導的TRX- Δ N超聲上清；第9泳道，誘導的TRX- Δ N超聲沉淀；第10泳道，純化后的TRX- Δ N。圖IOa和IOb分別為重組蛋白BjApextrinl缺失突變體與金黃色葡萄球菌來源地的肽聚糖PGN (S.a)和枯草芽孢桿菌來源的肽聚糖PGN (B. s)的ELISA實驗結果。
具體實施例方式以下實施將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例I :中國文昌魚消化道總RNA的提取和cDNA的合成總RNA的提取和RACE cDNA合成收集中國文昌魚消化道，采用Trizol試劑法提取消化道總RNA。取I μ g總RNA，按照Τ0Υ0Β0公司的cDNA —鏈合成試劑盒(ReverTraAce- a - , code No. FSK-100)說明合成 cDNA — 鏈。米用 Invitrogen 的GeneRacer Kit 按照說明合成 RACE cDNA—鏈。實施例2 RACE 擴增 BjApextrinl 和 BjApextrin2 基因 5'和 3'末端。根據已知的EST序列設計BjApextrinl的5' RACE擴增的基因特異性引物為5' -GSP:5/ -CGTCATCTTCATCGTCCCA ACGGAA-3' ;BjApextrinl 的 3' RACE 擴增的基因特異性引物為 3 ' -GSP: 5 ' -TTCCGCTTGGGACGATGAAGATG-3 '。B jApextrin2 的 5 ' RACE擴增的基因特異性引物為 5' -GSP:5/ -CGTCTTCATCGTCCCACCGGAA-3 ' ;BjApextrin2 的
3' RACE 擴增的基因特異性引物為 3 ' -GSP: 5 ' -TTCCGGTGGGACGATGAAGAC-3 '。采用Takara公司的LA Taq聚合酶按照GeneRacer Kit的反應體系進行PCR擴增。擴增得到的目前片段如圖I。將目的片段連接到pGEX Teasy vector(promega)后轉化大腸桿菌DH5 α，挑選重組克隆測序。將5' RACE和3' RACE的測序結果進行拼接后得到了 BjApextrinl和BjApextrin2基因的全長序列。BjApextrinl的全長序列含有一個長度為1515bp的開放閱讀框(open reading frame, 0RF),編碼504個氨基酸的蛋白；BjApextrin2的全長序列含有一個長度為1389bp的開放閱讀框(open reading frame, 0RF),編碼462個氨基酸的蛋白。實施例3 BjApextrinl和BjApextrin2基因全長序列的擴增及分析。根據上面拼接得到的序列設計BjApextrinl基因全長序列的PCR引物 5 ' -AACGGCGGTTCTTCTCTGA-3 '和 5 ' -TGTAGTCGCATCAAGCTCTTTATT-3 '；BjApextrin2 基因全長序列的 PCR 引物 5 ' -CAAAGGAACGTCAGAACATTC-3 '和5' -TTTAGAGTGAGCCAGTTTGT-3'，采用 Takara 的 LA Taq 聚合酶擴增 BjApextrinl 的全基因，分別擴增得到的1578bp和1433bp片段的，電泳圖譜如圖2。將擴增得到的目的片段連接到pGEX Teasy vector后轉化大腸桿菌DH5 α，挑選重組克隆測序。對測序結果進行分析表明，獲得了 BjApextrinl和BjApextrin2基因全長序列。實施例4 :重組 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 表達質粒的構建根據BjApextrinl基因的序列合成一對引物，上游引物含BamH I切割位點，下游引物含Xho I切割位點。上游引物(FL-Fl):5’-CGCGGATCCGCACCGACCGAAGTCGTACA-3’BamH I下游引物(FL-Rl):5’-CCGCTCGAGCGAATAGTAACAGTAGTG GAGTCT-3’Xho I根據BjApextrin2基因的序列合成一對引物,上游引物含BamHI切割位點，下游引物含Xho I切割位點。上游引物(FL-F2):5’-GGAAGATCTATGAAATTCGCGCTGCTCG-3’Bgl II下游引物(FL-R2):5’-CCGCTCGAGAGAGTAGTAGCAGTAGTGAATCCG-3，Xho I分別以含有BjApextrinl和BjApextrin2基因的pGEX Teasy質粒為模板，FL-F1/FL-R1和FL-F2/FL-R2為引物PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產物大小在1500左右。將PCR擴增產物克隆到原核融合表達載體pET32a上，得到重組表達載體pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2 (其構建過程如圖3所示)。表達載體中的外源基因序列經測序鑒定正確。
實施例4 :中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表達和純化將pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 質粒轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)。基因工程菌超聲裂解上清液和沉淀經SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經誘導后在超聲裂解沉淀中有明顯的特異表達產物帶，分子量與預測的理論值相符(圖4)。對培養(yǎng)時間、誘導濃度、溫度等條件的摸索得出。基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨芐抗性2XYT液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物5ml接種于500ml的氨芐抗性2 X YT培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)至0D600=0. 6 (擴大培養(yǎng)約4h)，加入IOOmM IPTG至終濃度分別為O. ImM, 18°C，250rpm誘導培養(yǎng)24h后離心收集菌體。經SDS-PAGE電泳分析表明，在此條件下BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的20%以上，處于不溶的包涵體狀態(tài)。將收集的超聲裂解沉淀用TBS緩沖液(50mM Tris · Cl，150mM NaCl，pH 7. 5，)重懸后，用超聲波細胞粉碎機以200W的功率，冰上超聲30min (超聲4s,間歇4s), 4°C、12，OOOrpm離心30min。重復兩次。將得到沉淀按照Ig 50ml比例用8M尿素-TBS溶解，通過加入磁力攪拌器加速其溶解，室溫12，OOOrpm離心溶解液lOmin。將溶解的包涵體上清液裝入已處理的透析袋，把透析袋轉移至bufferA (50mM Tris · Cl, pH6. 0,150mM NaCl，2mM 還原型谷胱苷肽(GSH)，0. 2mM 氧化型谷胱苷肽(6556)，10%甘油，411尿素)，41透析1211，然后將透析袋轉移至1311打6『B (50mM Tris Cl,pH6. 0,150mM NaCl，2mM GSH，0. 2mMGSSG, 10% 甘油，2M 尿素)，4°C透析 12h，再將透析袋轉移至 buffer C (50mM 的 Tris · Cl，ρΗ6· O, 150mM NaCl，2mM GSH,0. 2mM GSSG，10% 甘油，IM 尿素)，4°C透析 12h，最后將透析袋轉移至 buffer D (50mM Tris *Cl,pH6. 0,150mM NaCl, 10%甘油),4°C透析12h,更換新鮮透析buffer D,重復上一步。復性蛋白在4°C, 12，OOOrpm離心15min，取上清進行SDS-PAGE電泳檢測(圖4)。實施例5 :中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的細菌結合活性分析使用的細菌包括革蘭氏陰性細菌大腸桿菌K12 (Escherichia coli K12)、獲弧菌(VibroanguiIIarum)、副溶血弧菌(Vibro paraheamoIyticus)和醋酸|丐不動桿菌(Acinetobactercaloacetius);革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)> 溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、糞場球菌(Enterococcusfaecium)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)和黃色微球菌(Micrococcus luteus)。將約2X IO7個各種不同的細菌用TBS (pH7. 5)洗滌平衡后，與1μ g的BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白在Iml TBS (ρΗ7· 5)緩沖液中4°C振蕩孵育過夜;4°C、12000 X g離心lmin，沉淀用Iml TBS緩沖液洗5遍；用100 μ ITBS重懸菌體，再加入20 μ I 6 X上樣緩沖液，混勻后沸煮IOmin ;然后進行Western blot分析,用His單克隆抗體來檢測目的蛋白，Sepharose 4B bead作為陰性對照進行平行實驗。如圖5所不BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白可以結合革蘭氏陽性細菌，而不結合革蘭氏陰性細菌。實施例6 :中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白的細菌凝集活性分析將糞腸球菌和金黃色葡萄球菌振蕩培養(yǎng)過夜后，6，OOOrpm離心收集2 X IO9的各種細菌后，用TBS (ρΗ7·5)清洗2次。加入50μ1 FITC溶液(溶于DMS0，終濃度為10mg/ml)后,用TBS補平至總體積Iml,避光搖晃lh。用TBS清洗7_8遍至溶液無色,最后懸浮在Iml含有IOmM的CaCl2的TBS溶液中備用。在96孔平板上進行，每孔加入10 μ I的各種微生物懸浮液(終濃度大約lX107CFU/ml的細菌或者lX106CFU/ml酵母)，10 μ g的目的蛋白，用TBS補平至100 μ 1，混勻后避光靜置f 2h后在熒光顯微鏡下檢測凝集活性。如圖6所示BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白可以結合糞腸球菌和金黃色葡萄球菌發(fā)生凝集。實施例7 :中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白的細菌細胞壁純組分結合活性分析通過ELISA試驗來檢測重組蛋白對細菌細胞壁純組分的結合活性。使用的六種細菌細胞壁純組分分別為來源于金黃色葡萄球菌的肽聚糖(PGN(S. a))、來源于枯草芽胞桿菌的肽聚糖(PGN(B. s))、酵母聚糖(Zymosan)、磷壁酸(Lipoteichoic acid, LTA)、脂多糖(LipopoIysaccharides, LPS)和甘露聚糖(Mannan)。由于 PGN、Mannan 和 Zymosan 均為為不溶物，實驗前將這3種組分重懸在碳酸緩沖液中后用超聲波助溶，離心取上清進行下面的實驗。I)包被:用碳酸緩沖液(O. IM NaHC03，2. 5mM Na2C03, pH 9. 6)溶解各種不同的細胞壁多糖組分。然后在每一個聚苯乙烯微量滴定板的反應孔中加入20 yg各組分，補充包被緩沖液至ΙΟΟμ 1，37°C孵育3h (空白對照孔不加入糖組分)。2)洗滌棄去孔內溶液，用 200μ I TBST (TBS, O. 05% Tween-20)洗 3 次，每次3min。3)封閉加入200 μ I封閉緩沖液(TBST，5% BSA) 4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌。4)加樣在反應孔中加入不同濃度的重組蛋白，置于濕盒中于37°C孵育此。然后用TBST洗漆,用硫氧還蛋白(thioredoxin, TRX)做陰性對照。5)加酶標一抗于各反應孔中，加入ΙΟΟμ I新鮮的用封閉緩沖液稀釋的小鼠His單克隆抗體(I :5，000)，置于濕盒中于37°C下孵育lh，洗滌。6)加酶標二抗于各反應孔中，加入ΙΟΟμ I用封閉緩沖液稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG 二抗(I :20，000)，置于濕盒中于37°C孵育lh，洗滌。7)加底物緩沖液(100 μ g/ml 四甲基聯苯胺，O. 24% H2O2, O. 2 M Na2HPO4, O. I M 檸檬酸，PH5. 5)顯色于各反應孔中，加入50 μ I TMB顯色液，從加入第一個孔開始記時。全部加完后避光37°C孵育lOmin。8)終止反應從第一孔開始計時后lOmin，每孔按照加入底物緩沖液的順序加入50 μ I 終止液(2Μ H2SO4) O9)結果判定在酶標儀上于450nm處，用空白對照孔調零后測各孔的吸光值。如圖7所示，重組蛋白TRX-BjApextrinl和TRX_BjApextrin2對兩種來源的PGN都有顯著的結合活性，但是不結合其他細胞壁組分。實施例8 :中國文昌魚BjApextrinl和TRX_BjApextrin2融合蛋白的細菌不溶肽聚糖結合活性分析通過Pulldown試驗來檢測重組蛋白對不溶肽聚糖(PGN)的結合活性。將I μ g目的蛋白分別與5，10，20，50 μ g的兩種細菌來源的PGN在Iml TBS(pH7. 5)緩沖液中4°C振蕩孵育過夜；4°C、12000Xg離心lmin，沉淀用Iml TBS緩沖液洗5遍；用100 μ I TBS重懸沉淀，再加入20 μ I 6Χ上樣緩沖液,混勻后沸煮IOmin ;然后進行Western blot分析,用His單克隆抗體來檢測目的蛋白。如圖8所示,重組蛋白TRX-BjApextrinl和RX_BjApextrin2對兩種PGN都有顯著的結合活性，并且結合活性隨肽聚糖濃度的增加而增強。實施例9 :中國文昌魚BjApextrinl缺失突變體融合蛋白的表達和純化根據BjApextrinl基因的序列和同源比對的結果設計構建缺失突變體的引物，如下Δ C-R:5’-CCGCTCGAGCTGTTTGGT AAACCGTTGGAGG-3’BamHIΔ N-F 5，-CGCGGATCCCAAGGTGAAGT TGCGGCTGT-3，Xho I以含有BjApextrinl基因的pGEX Teasy質粒為模板，用FL-F和Λ C-R為引物PCR擴增得到C端缺失的片斷Λ C;用Λ N-F和FL-R為引物PCR擴增得到端N缺失的片斷Λ N。將PCR擴增產物克隆到原核融合表達載體pET32a上，得到重組表達載體pET32a_ Λ C和pET32a- Δ N (其構建過程如圖4所示相同)，重組表達載體經測序鑒定正確。將pET32a_ Λ C和pET32a_ Λ N質粒轉化大腸桿菌BL2 I (DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡汉统恋斫汼DS-PAGE電泳分析表明，菌株經誘導后在超聲裂解沉淀中有明顯的特異表達產物帶。重組蛋白的純化條件及過程與實施例4相同，如圖9所示不溶的包涵體經變復性可得到較純的重組蛋白。實施例10 :中國文昌魚BjApextrinl缺失突變體融合蛋白的細菌肽聚糖結合活性分析用ELISA法檢測重組蛋白TRX- Λ C和TRX- Δ N對細菌肽聚糖結合活性，方法與實施例7相同。如圖10所示，TRX- Δ N對肽聚糖有顯著的結合活性，而TRX- Δ C沒有。
權利要求
1.BjApextrinl基因，其DNA序列如序列表中序列I所不。
2.由權利要求I所述BjApextrinl基因編碼的BjApextrinl蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列3所示。
3.權利要求2所述BjApextrinl蛋白的生產方法,按以下步驟進行 (1)將權利要求I所述的BjApextrinl基因克隆到大腸桿菌表達載體pET32a，得到重組表達載體 pET32a_BjApextrinl ； (2)將pET32a-BjApextrinl 轉化大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)； (3)對轉化的大腸桿菌BL21(DE3)在液體培養(yǎng)基2XYT，37°C培養(yǎng)4小時后加入終濃度為O. 2mM的IPTG在18°C誘導過夜； (4)重組中國文昌魚BjApextrinl融合蛋白的純化，具體是將菌液離心收集菌體，進行超聲破碎，離心取沉淀進行變復性，得到蛋白。
4.權利要求2所述的BjApextrinl蛋白在作為制備治療感染性疾病藥物中的應用。
5.BjApextrin2基因，其DNA序列如序列表中序列2所示。
6.由權利要求5所述BjApextrin2基因編碼的BjApextrin2蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
7.權利要求6所述BjApextrin2蛋白的生產方法,按以下步驟進行 (1)將權利要求5所述的BjApeXtrin2基因克隆到大腸桿菌表達載體pET32a，得到重組表達載體 pET32a_BjApextrin2 ； (2)將pET32a-BjApextrin2 轉化大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)； (3)對轉化的大腸桿菌BL21(DE3)在液體培養(yǎng)基2X YT，37°C培養(yǎng)4小時后加入終濃度為O. 2mM的IPTG在18°C誘導過夜； (4)重組中國文昌魚BjApextrin2融合蛋白的純化，具體是將菌液離心收集菌體，進行超聲破碎，離心取沉淀進行變復性，得到蛋白。
8.權利要求6所述的BjApextrin2蛋白在作為制備治療感染性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩個肽聚糖結合蛋白及其編碼基因BjApextrin1和BjApextrin2，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應用。本發(fā)明根據已有的EST序列通過5′RACE和3′RACE,從中國文昌魚的消化道中分離得到文昌魚BjApextrin1和BjApextrin2基因,其DNA序列如序列表中序列1和序列2所示。該基因編碼的蛋白(BjApextrin1和BjApextrin2)，其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。本發(fā)明的基因BjApextrin1和BjApextrin2編碼的蛋白能夠識別和凝集革蘭氏陽性菌，并且特異結合細菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作為制備治療感染性疾病的藥物。
文檔編號C12N15/12GK102925447SQ201210439488
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權日2012年11月6日
發(fā)明者徐安龍, 黃光瑞, 黃盛豐, 嚴信宇, 章玲玲, 楊平 申請人:中山大學