專利名稱：一種定量檢測TRECs基因的實時熒光定量PCR試劑盒及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于體外核酸診斷領域，涉及一種定量檢測游離T細胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circles, TRECs)基因的實時突光定量聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
原發(fā)性免疫缺陷病(PrimaryImmunodeficiency Disease, PID)是因免疫系統(tǒng)遺傳缺陷或先天發(fā)育不全造成免疫功能障礙所致的免疫缺陷病，其總發(fā)病率為:美國1/10000，澳大利亞2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我國香港地區(qū)1/8000人。國內(nèi)缺乏全面的統(tǒng)計資料，如果按照1/10000的發(fā)病率，我國每年出生的2500萬個新生兒中有2500個新發(fā)的PID病例，整個兒童期累計患者達到3萬-6萬例。原發(fā)性免疫缺陷病，與遺傳相關，常發(fā)生在嬰幼兒，可出現(xiàn)反復感染，嚴重時可威脅生命。因其中有些可能獲得有效的治療，因此及時診斷仍很重要。2001年11月，美國疾病控制和預防中心(Centers for Disease Controland Prevention,⑶C)在喬治亞洲首府亞特蘭大召開專題研討會，建立針對新生兒篩查(Newborn Screening，NBS)實驗和早期識別PID的方案，以便能早期診斷和治療PID患者。2009年美國⑶C在美國維斯康星州進行重癥聯(lián)合免疫缺陷(Severe CombinedImmunodefieieney Disease, SCID)新生兒篩查。按免疫缺陷性質(zhì)的不同，原發(fā)性免疫缺陷病可分為體液免疫缺陷為主(即抗體缺乏為主的免疫缺陷)、細胞免疫缺陷為主以及兩者兼有的聯(lián)合性免疫缺陷三大類。此外，補體缺陷、吞噬細胞缺陷等非特異性免疫缺陷也屬于本組。重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SevereCombined Immunodeficiency, SCID)是以T淋巴細胞缺乏或功能異常,伴或不伴有B淋巴細胞和NK細胞數(shù)量減少或功能缺陷為特征的一組疾病，新生兒發(fā)病率大約在1/50000至1/100000,該病發(fā)病年齡早，臨床表現(xiàn)重，預后較差，如果沒有得到及時的診斷和治療，多在2歲內(nèi)死亡。SCID是一種嚴重的聯(lián)合免疫缺陷，患兒如果不進行有效的免疫重建，往往在嬰兒期死亡，免疫重建的時間與預后的關系密切，如果在出生3個月內(nèi)進行造血干細胞移植存活率接近95%，而3個月后進行造血干細胞移植存活率降至76%，因此將SCID納入NBS非常必要。目前SCID主要分為ΓΒ+SCID和T—B—SCID兩大類，其中ΓΒ+SCID的致病原因有Y c基因缺陷、JAK3基因缺陷、IL-7Ra基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3 δ /CD3 ε /CD3 ζ基因缺陷；ΓΒ飛CID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLRE1C基因缺陷、ADA基因缺陷、DNA PKcs基因缺陷、網(wǎng)狀組織發(fā)育不全。除此以外，SCID還包括Oemnn綜合征、DNA連接酶VKCemunnos/XLF缺陷、CD40配體缺陷、CD40缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷、CD3 Y缺陷、CD8缺陷、ΖΑΡ-70缺陷、MHC I類分子缺陷、MHC II類分子缺陷、鈣離子通道缺陷等。導致SCID的原因繁多，診斷非常困難，但是所有SCID的共同特征是成熟T細胞的數(shù)量顯著降低。
T細胞在胸腺中分化的過程是發(fā)生在T細胞受體基因的重排，最終是V、D和J基因片段的結(jié)合；在每個V、D和J基因片段重排的過程中，都會有被切除的環(huán)狀DNA產(chǎn)物，被切割下來的DNA形成游離T細胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circles, TRECs),70%表達α β TCRs的T細胞在成熟晚期都產(chǎn)生SRec-cpJa TRECs。TREC在T細胞中非常穩(wěn)定，并不隨著細胞的增殖而增加，而是不斷被稀釋，新生兒TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明顯降低。利用定量PCR檢測SRec-Vja TRECs可以反映外周血最新產(chǎn)生的T淋巴細胞數(shù)量，病人T細胞中TRECs缺乏或不同程度的減少，可以作為SCID的新生兒篩查方法，篩查出T細胞成熟缺陷的新生兒，有利于早診斷早治療，減少新生兒死亡。目前已有的的TRECs試劑盒包括DNA提取及實時定量PCR兩部分，由于TRECs為人類基因組發(fā)育重排過程中切割下來的環(huán)狀基因，相對于基因組DNA，含量極低，要求極高的DNA純度，而一步法實時定量PCR，對于臨界值很難判定，造成假陰性，在篩查新生兒過程中會漏檢，患兒錯過最佳診斷及治療時機。因此，需要一種新的TRECs試劑盒，人為地提高TRECs基因含量，減少假陰性結(jié)果，提高特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種通過定量檢測TRECs基因的拷貝數(shù)，用來篩查新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷的實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，本發(fā)明能夠檢測新生兒T細胞的水平，判斷新生兒免疫系統(tǒng)功能正常與否，在臨床檢驗領域有良好的應用前景。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了篩查新生兒T細胞免疫缺陷中的應用，上述試劑盒所需的樣本獲取、 儲存方便，靈敏度和特異性高，檢測方法簡便、快速，實驗結(jié)果可靠。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供:一種定量檢測TRECs基因的實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒主要包括DNA提取液、巢式PCR反應液、包含TRECs基因插入序列的標準品1、包含β -actin基因插入序列的標準品I1、陰性對照品、空白對照品、包含TRECs基因的實時熒光引物和探針的熒光PCR反應液I和包含β -actin基因的實時熒光引物和探針的熒光PCR反應液II。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，巢式PCR反應液是由TRECs和β-Actin的PCR正向引物、反向引物，2Xtaq PCR MasterMix, ImM MgCl2和無菌的超純水組成。在本發(fā)明的一個具體方案中，TRECs基因的巢式PCR正向引物(SEQ NO:1)為5’ -GAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAAATGG-3，，反向引物(SEQ NO: 2)為 5’-TGATCTTGTCTGACATTTGCTCCGTGGT-3，。β -actin基因的巢式 PCR 正向引物(SEQ NO: 3)為 5’ -CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQNO:4)為 5’ -CCACGTCACACTTCATGATGGA-3’。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光PCR反應液I是由TREC熒光PCR引物和探針、2.5Xreal time Mix、牛血清白蛋白(BSA)、20XPCR Enhancer和無菌水組成。在本發(fā)明的一個具體方案中，TRECs基因的熒光PCR正向引物(SEQ NO: 5)為5’ -TGAGAACGGTGAATGAAGAGC-3’，反向引物(SEQ NO:6)為 5’ -CCATGCTGACACCTCTGG-3’ 和探針(SEQ NO:7)為 FAM-ACGGTGATGCATAGGCACCTGCACC-TRAM A。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光PCR反應液II是由β-actin熒光PCR引物和探針、2.5Xreal time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和無菌水組成。在本發(fā)明的一個具體方案中，β-actin 基因的熒光 PCR 正向引物(SEQ NO:8)為 5’-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQ NO:9)為 5’ -CCACGTCACACTTCATGATGGA-3，和探針(SEQ NO: 10)為VIC-CTGTGGCATCCACGAAACT-TRAMA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光PCR反應液I和熒光PCR反應液II中所述的TRECs和β -actin基因的特異性探針均為Taqman探針，標記探針5’端的為一種熒光報告基團，是FAM、VIC、TET、J0E、R0X、CY3、CY5、HEX中的一種；3’端為熒光淬滅基團，是TAMRA、DABCYL、NFQ的一種。在本發(fā)明的反應體系中，可以使用一個或者多個熒光探針，所標記的熒光報告基團可以為一種或者兩種。在本發(fā)明的一個具體方案中，TRECs標記探針5’端為FAM探針，3’端為TAMRA探針；β -actin標記探針5’端為VIC探針，3’端為TAMRA探針。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，標準品I是含有插入TRECs基因131個核苷酸片段連接入PUC57載體質(zhì)粒。所述的TRECs基因的插入序列(SEQ NO: 11)為5’-TCGTGAGAACGGTGAATGAAGAGCAGACAGGGCCCGTGCCAGCTGCAGGGTTTAGGCACGGGGTGCAGGTGCCTATGCATCACCGTGCACAGGAGTGGGCACCTTTACAAAAACCAGAGGTGTCAGCATGG-3’。標準品 I 用分光光度計測 A26tl 定量，存放濃度為 1.0X IO8 拷貝 /ul、1.0X107 拷貝 /ul、1.0X106 拷貝 /ul、1.0X105 拷貝 /ul、1.0X IO4拷貝/ul、1.0X103拷貝/ul 6個濃度梯度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，標準品II是含有插入β-actin基因70個核苷酸片段連接入PUC57載體質(zhì)粒。所述的β-actin基因的插入序列(SEQ NO: 12)為:5’_ATTTCCCTCTCAGGCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’。標準品 II 用分光光度計測A26tl定量，存放濃度為1.0X IO8拷貝/ul、1.0X107拷貝/ul、1.0X IO6拷貝/ul、1.0X105 拷貝 /ul、1.0X104 拷貝 /ul、1.0X103 拷貝 /ul 6 個濃度梯度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，陰性對照品為TRECs和β -actin重組質(zhì)粒，其濃度為 5.0X IO5 拷貝 /ul。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，空白對照品為無菌的超純水。在本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種通過定量檢測TRECs基因的拷貝數(shù)，在篩查新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷病中的應用，實時熒光PCR試劑盒對新生兒T細胞免疫缺陷的檢測方法，該方法包括下列步驟: I)用DNA提取液對干血濾紙片DNA進行提取:2)將標準品和待測樣品加入巢式PCR反應液，用PCR檢測儀對TRECs和β -actin基因進行擴增；3)將擴增后的PCR產(chǎn)物加入實時熒光定量PCR反應體系，用熒光定量檢測儀檢測進行PCR檢測；4)通過比較待測樣品和標準品的循環(huán)域值，根據(jù)標準曲線計算待測樣品的起始TRECs和β-actin基因拷貝數(shù)。本發(fā)明的有益效果:I)樣本獲取、儲存方便。本發(fā)明對新生兒干血濾紙片僅取3mm直徑的紙片提取DNA即可完成該項目的檢測，干血濾紙片為新生兒常規(guī)獲得，并且用血量很少，減少新生兒抽取的血量，同時干血濾紙片有 利于長期保存，大大降低了樣本的獲得、儲存及運輸?shù)葐栴}的出現(xiàn)。2)靈敏度和特異性高。采取特異性引物、探針及巢式PCR，并對樣本提取的DNA進行普通PCR擴增18個循環(huán)，有效的提高了檢測基因的拷貝數(shù)，提高了對樣本檢測的靈敏性，而陽性樣本中的TRECs幾乎沒有，使得樣本檢測結(jié)果的陰性與陽性很容易進行判定。3)檢測方法簡單，檢測速度快，結(jié)果以拷貝數(shù)表示，定量結(jié)果準確可靠。有利于在醫(yī)院及實驗室推廣應用。4)通過選擇樣本自身的管家基因β-actin作為內(nèi)參，若擴增的內(nèi)參的拷貝數(shù)在正常范圍內(nèi)，TRECs的拷貝數(shù)非常低，則陽性結(jié)果可靠，否則需重新測定，因此能更有效地減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，從而保證數(shù)據(jù)的可靠性。總之本發(fā)明靈敏度高，特異性好，檢測方法簡單快速，實驗結(jié)果可靠。本發(fā)明填補了原發(fā)性免疫缺陷病的普查及新生兒篩查的空白，不僅可以篩查SCID免疫缺陷病，而且能夠為其他與T細胞發(fā)育相關的原發(fā)性免疫缺陷病或其他系統(tǒng)疾病提供臨床相關指征，有利于早起診斷及治療。


圖1.TRECs標準品的擴增曲線及標準曲線。圖2.β -actin標準品的擴增曲線及標準曲線。圖3.正常兒童DNA樣本TRECs基因的擴增曲線。圖4.SCID陽性兒童DNA樣本TRECs基因的擴增曲線。圖5.空白對照品的擴增曲線。圖6.正常兒童DNA樣本β-a`ctin基因的擴增曲線。圖7.SCID陽性兒童DNA樣本β -actin基因的擴增曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:精編分子生物學指南，F(xiàn).M.奧斯柏等主編，科學出版社，1995，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實施例1:試劑盒的制備1.引物與探針的設計與合成根據(jù)UCSC 網(wǎng)站上 UCSC Human Gene Sorter 查詢 TRECs 和 β-actin 基因序列(http://genome, ucsc.edu/cg1-bin/hgNear),利用 Primer3.0 在 TRECs 的基因上設計巢式PCR的上下游引物和熒光定量PCR上下游引物和探針，其中TRECs的巢式PCR上游引物與該基因的結(jié)合位置在其實時熒光定量PCR上游引物與該基因結(jié)合位置的上游，TRECs的巢式PCR下游引物與該基因的結(jié)合位置在其實時熒光定量PCR下游引物與該基因結(jié)合位置的下游。所選引物對于基因的結(jié)合有很好的特異性，有較高的PCR擴增效率。引物與探針均委托Life Technologies公司進行合成，其中引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。TRECs的探針5’端標記為FAM熒光基團，3’端標記為TAMRA熒光基團；β -actin的探針5’端標記為VIC熒光基團，3’端標記為TAMRA熒光基團。引物序列如表I。表I插入基因、特異性引物以及探針序列
權(quán)利要求
1.一種定量檢測TRECs基因的實時熒光定量PCR試劑盒，其中包括DNA提取液、巢式PCR反應液、包含TRECs基因插入序列的標準品1、包含β _actin基因插入序列的標準品I1、包含TRECs基因的實時熒光引物和探針的熒光PCR反應液I和包含β -actin基因的實時熒光引物和探針的熒光PCR反應液II。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的巢式PCR反應液包括: 1)巢式PCR擴增TRECs基因的正向引物，其堿基序列如SEQNO:1所示； 2)巢式PCR擴增TRECs基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO: 2所示； 3)巢式PCR擴增β-actin基因的正向引物，其堿基序列如SEQNO: 3所示; 4)巢式PCR擴增β-actin基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO: 4所示。
3.權(quán)利要求 1所述的試劑盒，其中所述的熒光PCR反應液I包括: O實時熒光PCR檢測TRECs基因的正向引物，其堿基序列如SEQ NO: 5所示； 2)實時熒光PCR檢測TRECs基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO:6所示； 3)用于檢測TRECs基因的探針，其堿基序列如SEQNO:7所示； 其中所述的熒光PCR反應液II包括: 1)實時熒光PCR檢測β-actin基因的正向引物，其堿基序列如SEQNO: 8所示； 2)實時熒光PCR檢測β-actin基因的反向引物，其堿基序列如SEQN0:9所示； 3)用于檢測β-actin基因的探針，其堿基序列如SEQNO: 10所示。
4.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的標準品I，其堿基序列如SEQNO: 11所示；其中所述的標準品II,其堿基序列如SEQ NO: 12所示。
5.權(quán)利要求1至4所述的試劑盒，所述的特異性熒光探針為Taqman探針，標記探針5’端的為一種熒光發(fā)光基團，是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一種；標記探針3’端的為一種熒光淬滅基團，是TAMRA、DABCYL, NFQ中的一種。
6.權(quán)利要求1至4所述的試劑盒,所述的Taqman探針5’端標記FAM,3’端標記TAMRA。
7.權(quán)利要求1至6所述的試劑盒在新生兒T細胞免疫缺陷檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于定量檢測TRECs基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒及其應用。本發(fā)明包括一個以巢式PCR技術(shù)為基礎的PCR反應體系和以實時熒光PCR技術(shù)為基礎的實時熒光定量(Real time)PCR反應體系。其中巢式PCR反應體系包括針對TRECs和β-actin基因的正、反向引物；熒光PCR反應體系包括針對TRECs和β-actin基因的正、反向引物和特異性熒光探針。該試劑盒可以快速地篩查新生兒免疫系統(tǒng)T細胞水平，具有高靈敏度和穩(wěn)定性，以及非常好的重現(xiàn)性。此方法適用于TRECs定量檢測，能應用于新生兒免疫系統(tǒng)功能篩查，具有實際的臨床應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103173534SQ201210471999
公開日2013年6月26日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者王曉川, 劉丹如, 王牧, 房聰 申請人:無錫聯(lián)合利康臨床檢驗所有限公司