用RNAi有效防治農(nóng)業(yè)害螨的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及沉默一個(gè)能量代謝基因防治葉螨的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：選取葉螨致死基因AK為RNAi靶基因；將其連接至質(zhì)粒載體L4440中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HT115，獲得具有表達(dá)AK基因dsRNA的菌株。本發(fā)明是對(duì)以殺蟲劑為主的葉螨防治方法的重要補(bǔ)充。本發(fā)明利用RNAi技術(shù)干擾葉螨體內(nèi)的能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，為防治葉螨提供了技術(shù)支持。
【專利說明】用RNAi有效防治農(nóng)業(yè)害螨的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及基于RNAi技術(shù)防治農(nóng)業(yè)害 螨的靶標(biāo)基因及其dsRNA，描述了將靶標(biāo)基因合成為雙鏈RNA制劑并直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害螨 防治的方法。 技術(shù)背景
[0002] 在我國，目前對(duì)農(nóng)業(yè)害螨還沒有有效防治方法，噴施殺蟲劑仍然是主要防治手段。 高毒高殘留農(nóng)藥的濫施，不僅導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量下降，害螨抗藥性的增加，而且已危及人 們的生命安全和健康。因此，生產(chǎn)上迫切需要發(fā)展安全、有效、新型的策略來控制害螨種群 的危害。
[0003] RNAi現(xiàn)象自從1991年發(fā)現(xiàn)以來迅速發(fā)展，研究表明，通過特異基因的RNAi，可以 達(dá)到定向干涉物種的靶基因，出現(xiàn)某些生理現(xiàn)象，達(dá)到研究基因功能的目的，同時(shí)，這種現(xiàn) 象有著極高的特異性，即同源基因的特定片段對(duì)不同物種所發(fā)揮的干涉效果并不相同，因 此是一種理想的害蟲種類特異的防治體系。
[0004] 迄今為止通過dsRNA誘導(dǎo)的RNAi已被廣泛用來研究昆蟲基因的功能，但是應(yīng)用 于螨類的研究極少（Khila，2007 ;Campbell，2010)，這主要是因?yàn)轵悅€(gè)體微?。ㄉ眢w多 在1毫米以下），使用RNAi分子技術(shù)操作困難。KhiIa等（2007)使用dsRNA注射腹部，成 功沉默了二班葉螨（Tetranychus urticae)的Distal-less基因，導(dǎo)致葉螨須肢截?cái)嗷?和附足融合。將綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記的dsRNA分子注射入雌成螨的腹部，而在其產(chǎn)的卵 中亦可檢測(cè)到，表明螨類中也可能存在RNAi系統(tǒng)性傳播。Campbell等（2011)使用0.9% NaCl溶液浸泡法，成功沉默了西方蜜蜂（Apis mellifera)的寄生性螨-狄氏瓦螨（Varroa destructor)的glutathioneS-transferase基因，其特異性沉默效率在轉(zhuǎn)錄水平上達(dá)到 87%。本專利發(fā)明就是利用實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的dsRNA干擾方法，從農(nóng)業(yè)害螨中篩選出經(jīng)干擾后 能夠?qū)е氯~螨死亡的重要基因，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害螨的新策略提供序列和數(shù) 據(jù)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針農(nóng)業(yè)害螨的危害，提供基于RNAi技術(shù)的抗蟲制劑及抗蟲方法
[0007] 本發(fā)明的第一方面是提供該致死基因片段AK的dsRNA及其合成方法.
[0009] 本發(fā)明的第一方面可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 農(nóng)業(yè)害螨致死基因片段AK，序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 所述的葉螨致死基因片段AK的克隆方法，包括如下步驟：
[0012] (1)取葉螨，提取總RNA，以提取的葉螨總RNA合成cDNA第一條鏈；
[0013] (2)以步驟⑴合成的葉螨cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID NO. 2的上游 引物P1、序列為SEQ ID NO. 3的下游引物P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；
[0014] (3) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段；
[0015] (4)將回收的目標(biāo)DNA片段在T3連接酶作用下插入至PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌Τορ-10,涂于含有Amp的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜；
[0016] (5)菌液PCR鑒定，篩選陽性重組子圖1 ;
[0017] (6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒；
[0018] (7)全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID NO. 1所示的AK基因片段。
[0019] 其中，所述的 RT-PCR 擴(kuò)增體系為：10XEx PCR Buffer2. 5 μ L，2. 5mM dNTP Mixture2. 0 μ L，10 μ M 上游引物 PlL 0 μ L，10 μ M 下游引物 P2L 0 μ L，cDNA 模板 3 μ L， 5U/ μ L Ex TaqO. 25 μ L，ddH20,15. 25 μ L，共 25 μ L ;PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 °C 變性 5min， 94°C lmin，56°C lmin，72°C lmin，32 個(gè)循環(huán)，72°C延伸。
[0020] 葉螨致死基因片段AK的dsRNA。
[0021] 基于分析克隆獲得的靶標(biāo)基因功能區(qū)域，設(shè)計(jì)特異引物分別擴(kuò)增獲得正向雙鏈 DNA片段及反向雙鏈DNA片段；使用體外高效轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScribe RNAi Transcription Kit)對(duì)獲得的兩條雙鏈DNA靶標(biāo)片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、退火合成dsRNA，構(gòu)建出特異dsRNA.
[0022] 本發(fā)明的另一方面是提供重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其dsRNA的表達(dá)
[0023] 所述的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建由以下方法實(shí)現(xiàn)：
[0024] (1)提取本發(fā)明第一方面中克隆的重組質(zhì)粒PMD18-T-AK，用HindIII和Sac II進(jìn) 行雙酶切，獲得兩個(gè)黏性末端。
[0025] (2)酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段。
[0026] (3)同樣用HindIII和Sac II對(duì)L4440質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，獲得與（1)相同的黏型 末端。
[0027] (4)酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段，作為載體。
[0028] (5)將（2)所得的目的片段與（4)所得的L4440質(zhì)粒載體片段用T4DNA連接酶連 接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115中，涂于含有（Amp+Tet)的雙抗LB平板，37°C培養(yǎng)，過夜；
[0029] (6)挑取單菌落，接種于2ml LB培養(yǎng)基（Amp+Tet)，37°C過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并進(jìn) 行酶切鑒定。
[0030] 選擇鑒定正確菌液0· 75ml并加入0· 25ml 80%甘油，-80°C保存
[0031] 本發(fā)明的另一方面是誘導(dǎo)大腸桿菌HT115進(jìn)行dsRNA的表達(dá)。
[0032] 將上述保存的含有L4440-AK質(zhì)粒的HTl 15菌液以1 : 100的體積接種于 (Amp+Tet)雙抗的 2XYT 培養(yǎng)基中，37°C、250rpm 培養(yǎng)至 OD595 ?0· 4.
[0033] 加入無菌的IPTG至終濃度為0. 4mM于上述菌液，在37°C、250rpm誘導(dǎo)4h。
[0034] 鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的dsRNA。
[0035] 本發(fā)明的另一方面是提供幾種葉螨的dsRNA干擾方法，
[0036] 本發(fā)明另一方面葉螨dsRNA干擾第一種方法是玻片點(diǎn)滴法，具體步驟包括：
[0037] (1)將雙面膠帶剪成2cm長(zhǎng)，貼在載玻片一端
[0038] (2)選擇健康的雌成螨，用小號(hào)毛筆輕輕挑起，將其背部粘在膠帶上，注意不要粘 住足、須肢及口器。
[0039] (3)每片粘30頭，排成三排，然后把玻片放在干凈無毒且濕潤(rùn)的托盤中，置于 28±1°C下培養(yǎng)箱
[0040] (4)0. 5h后在雙目解剖鏡下挑去不活潑和死亡個(gè)體并補(bǔ)足30頭備用
[0041] (5)用規(guī)格2. 5 μ L移液槍在體視顯微鏡下往每頭蟲體背面滴加適量dsRNA。
[0042] 死亡標(biāo)準(zhǔn)：以小號(hào)毛筆輕輕觸動(dòng)螨體，附肢不動(dòng)者為死亡。
[0043] 本發(fā)明另一方面葉螨dsRNA干擾第二種方法是dsRNA雙通管法，具體步驟包括：
[0044] (1)在玻璃雙通管一端先加一塊Parafilm封口膜，然后將人工飼料加在其上，再往 其上蓋住另一塊新的Parafilm封口膜。
[0045] (2)然后往雙通管中放入所要試驗(yàn)的葉螨。
[0046] (3)最后再往玻璃雙通管另一端再按第（1)步所述的方法進(jìn)行操作。
[0047] (4)添加完畢，用針尖向兩端的雙層Parafilm封口膜上各刺20(視具體情況）個(gè)微 孔，以便空氣和水分流動(dòng)；
[0048] (5)將葉螨放在人工氣候箱飼養(yǎng)，往玻璃管中央蓋一塊黑布，以使葉螨能去兩端吸 食人工飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。
[0049] 其中，所述的dsRNA為所述的葉螨致死基因片段AK的dsRNA。
[0050] 有益效果：
[0051] 利用RNAi技術(shù)沉默AK基因，對(duì)葉螨具有明顯的致死效果，說明該基因可作為利用 RNA干擾技術(shù)控制害蟲的有效靶點(diǎn)。
[0052] 本發(fā)明合成的AK基因 dsRNA能有效沉默AK基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同時(shí) 合成成本較低，便于大量實(shí)驗(yàn)使用。
[0053] 本發(fā)明采用玻片點(diǎn)滴法與雙通管進(jìn)行RNAi干擾實(shí)驗(yàn)，相對(duì)注射法，減少了蟲體的 機(jī)械損傷，也大大減少dsRNA的用量，另外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 dsRNA大腸桿菌的體外表達(dá)載體， 從而減少實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，解決了實(shí)驗(yàn)dsRNA量不足的關(guān)鍵。最終通過點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證了 AK基因的RNAi對(duì)葉螨具有致死效果，建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提 供新的實(shí)驗(yàn)手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0054] 圖I dsRNA合成電泳圖，泳道I :Marker，泳道2、3 :AK的dsRNA ;圖2不同濃度的 dsRNA干擾后蟲體的校正死亡率。
[0055] 圖3,土耳其斯坦葉螨在不同處理不同時(shí)間的存活率 具體的實(shí)施方式
[0056] 實(shí)施例1
[0057] I. AK基因片段的克隆方法：
[0058] (1)取葉螨100-150頭，用TRIzol法提取總RNA ;
[0059] (2)合成cDNA第一條鏈；
[0060] (3)從葉螨轉(zhuǎn)錄組中獲取基因片段序列，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/進(jìn)行 同源性比對(duì)之后，預(yù)測(cè)為AK基因，利用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)Pl和P2,以RT-PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增；
[0061] 上游引物（Pl) :5' GCGACTTGTGAACCTG 3' （SEQ ID NO. 2)，
[0062] 下游引物（P2) :5，TCTGCTGACGCTGAAA 3' （SEQ ID NO. 3);
[0063] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C變性 5min，94°C lmin，56°C lmin，72°C lmin，32 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸。
[0064] PCR 反應(yīng)體系（25 μ L):
[0065] IOXEx PCR Buffer 2. 5 μ L 2. 5mM dNTP Mixture 2. 0 μ L cDNA 模板 3 μ L
[0066] 10 μ M 上游引物 Pl LOuL 10 μ M下游引物Ρ2 LOuL 5U/μ L Ex Taq 0.25 μ L ddH20 15.25 μ L 總體積 25 μ L
[0067] (4) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段；
[0068] (5)將回收的目標(biāo)片段在Τ3連接酶作用下插入至pMDIS-T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌HD115(DE)，涂于含氨芐青霉素 lOOyg/ml的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜；
[0069] (6)通過菌液PCR，篩選陽性重組子；
[0070] (7)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒；
[0071] (8)全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成），即可 得到SEQ IDNO. 1所示的核苷酸序列的AK基因片段。
[0072] 實(shí)施例2.重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其dsRNA的表達(dá)
[0073] (1)提取本發(fā)明第一方面中克隆的重組質(zhì)粒PMD18-T-AK，用HindIII和SacII進(jìn) 行雙酶切，獲得兩個(gè)黏性末端。
[0074] (2)酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段圖X。
[0075] (3)同樣用HindIII和SacII對(duì)L4440質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，獲得與（1)相同的黏型末 端。
[0076] (4)酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段，作為載體圖X。
[0077] (5)將（2)所得的目的片段與（4)所得的L4440質(zhì)粒載體片段用T4DNA連接酶連 接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115中，涂于含有（Amp+Tet)的雙抗LB平板，37°C培養(yǎng)，過夜；
[0078] (6)挑取單菌落，接種于2ml LB培養(yǎng)基（Amp+Tet)，37°C過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并進(jìn) 行酶切鑒定。
[0079] 選擇鑒定正確菌液0· 75ml并加入0· 25ml 80%甘油，-80°C保存
[0080] 將上述保存的含有L4440-AK質(zhì)粒的HTl 15菌液以I : 100的體積接種于 (Amp+Tet)雙抗的 2XYT 培養(yǎng)基中，37°C、250rpm 培養(yǎng)至 OD595 ?0· 4.
[0081] 加入無菌的IPTG至終濃度為0. 4mM于上述菌液，在37°C、250rpm誘導(dǎo)4h。
[0082] 鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的dsRNA。
[0083] 實(shí)施例3. dsRNA點(diǎn)滴法
[0084] (1)將雙面膠帶剪成2cm長(zhǎng)，貼在載玻片一端
[0085] (2)選擇健康的雌成螨，用小號(hào)毛筆輕輕挑起，將其背部粘在膠帶上，注意不要粘 住足、須肢及口器。
[0086] 每片粘30頭，排成三排，然后把玻片放在干凈無毒且濕潤(rùn)的托盤中，置于28±1°C 下培養(yǎng)箱
[0087] (3)0. 5h后在雙目解剖鏡下挑去不活潑和死亡個(gè)體并補(bǔ)足30頭備用；
[0088] (4)用規(guī)格2. 5 μ L移液槍在體視顯微鏡下往每頭蟲體背面滴加適量dsRNA
[0089] (5)死亡標(biāo)準(zhǔn)：以小號(hào)毛筆輕輕觸動(dòng)螨體，附肢不動(dòng)者為死亡
[0090] (6)連續(xù)喂食48h，每24h統(tǒng)計(jì)一次死亡率，結(jié)果見表1和圖2,由表1和圖2可見 喂食致死基因 Tubulin的dsRNA能夠達(dá)到較好的致死效果
[0091] 表 1
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 葉螨致死基因片段AK，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的葉螨致死基因片段AK的克隆方法，其特征在于包括如下步驟： ⑴取葉螨，提取總RNA，以提取的葉螨總RNA合成cDNA第一條鏈； (2) 以步驟（1)合成的葉螨cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID NO. 2的上游引物 P1、序列為SEQ ID NO. 3的下游引物P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增； (3) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段； (4) 將回收的目標(biāo)DNA片段在T3連接酶作用下插入至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌HT115,涂于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜； (5) 通過菌液PCR，篩選陽性重組子； (6) 用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒； (7) 全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID NO. 1所示的AK基因片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的葉螨致死基因片段AK的克隆方法，其特征在于所述的 RT-PCR擴(kuò)增體系為：反應(yīng)緩沖液5 ii L，Mg2+4 ii L，dNTP 4 ii L，cDNA模板2 ii L，上游引物 luL，下游引物 liiL，R-Tag 酶 0.5iiL，ddH20 32.5iiL，共 50iiL;PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C變 性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸。
4. 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其dsRNA的表達(dá)，其特征包含以下步驟： (1) 將權(quán)利要求2中克隆的重組質(zhì)粒PMD18-T-AK，用Hindlll和SacII進(jìn)行雙酶切，獲 得兩個(gè)黏性末端。 (2) 酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段。 (3) 同樣用Hindlll和Sac II對(duì)L4440質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，獲得與（1)相同的黏型末端。 (4) 酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段，作為載體。 (5) 將（2)所得的目的片段與（4)所得的L4440質(zhì)粒載體片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌HT115中，涂于含有（Amp+Tet)的雙抗LB平板，37°C培養(yǎng)，過夜； (6) 挑取單菌落，接種于2ml LB培養(yǎng)基（Amp+Tet)，37°C過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶 切鑒定。選擇鑒定正確菌液〇. 75ml并加入0. 25ml 80%甘油，-80°C保存 (7) 將（6)保存的含有L4440-AK質(zhì)粒的HT115菌液以1 : 100的體積接種于（Amp+Tet) 雙抗的2XYT培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)至0D595 ~ 0? 4. (8) 加入無菌的IPTG至終濃度為0. 4mM于上述菌液，在37°C、250rpm誘導(dǎo)4h。 (9) 鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的dsRNA。
5. -種葉螨的dsRNA玻片點(diǎn)滴干擾方法，其特征在于包含如下步驟： (1) 將雙面膠帶剪成2cm長(zhǎng)，貼在載玻片一端 (2) 選擇健康的雌成螨，用小號(hào)毛筆輕輕挑起，將其背部粘在膠帶上，注意不要粘住足、 須肢及口器。 (3) 每片粘30頭，排成三排，然后把玻片放在干凈無毒且濕潤(rùn)的托盤中，置于28土 1°C 下培養(yǎng)箱 (4) 0. 5h后在雙目解剖鏡下挑去不活潑和死亡個(gè)體并補(bǔ)足30頭備用 (5) 用規(guī)格2. 5 ii L移液槍在體視顯微鏡下往每頭蟲體背面滴加適量dsRNA。 死亡標(biāo)準(zhǔn)：以小號(hào)毛筆輕輕觸動(dòng)螨體，附肢不動(dòng)者為死亡。
6. 葉螨dsRNA干擾第二種方法是dsRNA雙通管法，主要特征包括： (1) 在玻璃雙通管一端先加一塊Parafilm封口膜，然后將人工飼料加在其上，再往其上 蓋住另一塊新的Parafi lm封口膜。 (2) 然后往雙通管中放入所要試驗(yàn)的葉螨。 (3) 最后再往玻璃雙通管另一端再按第（1)步所述的方法進(jìn)行操作。 (4) 添加完畢，用針尖向兩端的雙層Parafilm封口膜上各刺20(視具體情況）個(gè)微孔， 以便空氣和水分流動(dòng)； (5) 將葉螨放在人工氣候箱飼養(yǎng)，往玻璃管中央蓋一塊黑布，以使葉螨能去兩端吸食人 工飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。
7.根據(jù)權(quán)利要求5,或權(quán)力要求6所述的dsRNA干擾方法，其特征在于所述的dsRNA為 權(quán)利要求4所述的葉螨致死基因片段AK的dsRNA。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104404048SQ201210501540
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月28日
【發(fā)明者】趙伊英, 劉峰, 汪小東 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)