專利名稱：一種基于位點特異性重組的抗生素生物合成基因簇的克隆方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種基于ΦΒΤ1整合酶系統(tǒng)及同源重組技術實現(xiàn)大片段生物合成基因簇克隆的方法。
背景技術：
天然產(chǎn)物一直在藥物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在過去幾十年里一直是人類治療疾病的主要藥物。然而，隨著抗生素的廣泛使用，細菌逐漸產(chǎn)生了耐藥性，與此同時用傳統(tǒng)的方法從自然界中篩選新型天然產(chǎn)物變得越來越困難，因而很難滿足疾病治療的需求。因此，發(fā)現(xiàn)新的具有生物活性的天然產(chǎn)物及其結構類似物，已經(jīng)成為生物、化學和醫(yī)藥界的研究熱點。化學合成作為增加天然產(chǎn)物結構多樣性的傳統(tǒng)方法，工藝繁雜，成本較高。隨著分子生物學的發(fā)展，組合生物合成的理念被提出，并且正逐漸成為藥物研發(fā)的重點。組合生物合成通過對天然產(chǎn)物代謝途徑的遺傳控制來生物合成新型的復雜化合物一方面，特異性地遺傳修飾天然產(chǎn)物的生物合成途徑，以此獲得基因重組菌株，生產(chǎn)所需要的天然產(chǎn)物及其結構類似物；另一方面，將不同來源的天然產(chǎn)物生物合成基因進行重組，在微生物體內建立組合的新型代謝途徑，由此重組微生物庫所產(chǎn)生的新型天然產(chǎn)物構成了類似物庫，有利于發(fā)現(xiàn)和發(fā)展更具有應用價值的藥物。與化學合成相比，其目標產(chǎn)物可以由重組菌株發(fā)酵大量生產(chǎn)，因而降低了生產(chǎn)成本和環(huán)境污染?？股厣锖铣赏緩郊吧锖铣苫虼氐难芯恳呀?jīng)有近三十年歷史，在這期間，許多較為重要的抗生素合成基因簇均已被注釋。發(fā)現(xiàn)其中較多抗生素生物合成基因簇都有類似的結構基因和排列特征，特別是PKS，NRPS類抗生素，都以模塊式的順序進行排列。這一特征為基因簇的克隆奠定了基礎。然而，抗生素合成基因簇較大，能夠達到幾十甚至幾百kb, Fosmid等載體不能完整的克隆這樣大的基因族，因而在對抗生素合成基因族的改造過程中，只涉及到個別基因的缺失和替換。此外，有相當多的微生物遺傳操作背景并不被人們所熟知，即便是研究相對較多 的鏈霉菌，也只有少數(shù)菌可以方便的進行遺傳操作。而眾多的產(chǎn)生一些重要的次生代謝物的稀有放線菌都缺乏有效的轉化手段，在原宿主中進行遺傳改造十分繁瑣且不易成功。本發(fā)明利用噬菌體ΦΒΤ1整合酶的作用，使插在抗生素合成基因簇兩端的位點特異性重組位點aiii 和ai#發(fā)生位點特異性重組反應，基因簇自身環(huán)化，進而完成靶標基因簇的克隆。由于在位點attB和ai#之間包含有BAC載體和抗性篩選標記，可以很方便的實現(xiàn)大片段基因簇的克隆操作。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是要克服大片段的生物合成基因簇難以用傳統(tǒng)方法克隆的問題，提供一種基于鏈霉菌噬菌體ΦΒΤ1整合酶系統(tǒng)的克隆抗生素合成基因簇的方法。提供的克隆抗生素合成基因簇的方法，首先構建靶標基因簇上下游的兩個同源重組載體，將ΦΒΤ1整合酶所識別的位點aiii 和ai#分別插在靶標基因簇的兩側；再通過ΦΒΤ1整合酶介導的位點特異性重組反應，就可以使基因簇自身環(huán)化，從而完成基因簇的克隆。本發(fā)明以erythromycin基因簇的克隆為例,具體步驟如下
(I)erythromycin基因簇上游同源重組載體pEry-up的構建
以紅色糖多孢菌e/yiAraea的基因組為模板,用引物SEQ ID No.2和引物SEQ ID No. 3擴增大小為1993bp的erythromycin基因簇上游同源臂片段，與PMD19-T載體(TAKARA公司)做T-A克隆，得到質粒T-ery-up，選取MunI位點和T載體上的XbaI位點鄰近的方向。質粒pTARBAC2.1 [I]和質粒pDZYlOl [2]分別用Nhe1、EcoRI和XbaKEcoRI進行雙酶切，產(chǎn)生大小為7478bp和4178bp的兩條片段，連接目的片段，得到質粒pBAC-DZYlOl。質粒pBAC-DZYlOl再用NheI和EcoRI進行消化，產(chǎn)生大小為9500bp的目的片段；質粒T-ery-up用MunI和XbaI進行消化，產(chǎn)生大小為4683的目的片段，連接兩條目的片段，得到質粒pEry-up,序列如SEQ ID No. 4所示。(2)載體pEry-up的同源插入
將構建好的載體pEry-up轉化至大腸桿菌ET12567，挑取陽性轉化子與紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea進行接合轉移，30 °C培養(yǎng)16 20h后,在平板表面覆蓋Iml含萘啶酮酸(終濃度為50 mg/ml)和卡那霉素(終濃度為30 mg/ml)的無菌水，30°C培養(yǎng)5天以上挑取接合子。(3) erythromycin基因簇下游同源重組載體pEry-down的構建
以質粒PSET152為模板，用引物`SEQ ID No. 5和引物SEQ No. 6擴增大小為2283bp的片段，與PMD19-T載體做T-A克隆得到質粒pT-SET152。以質粒pCY104[3]為模板，用引物SEQ ID No. 7和引物SEQ ID No. 8擴增大小為847bp的片段，與pMD19_T載體做T-A克隆，得到質粒pT-CY104，挑選PCR產(chǎn)物片段上NheI位點離T載體上HindIII位點較遠的方向。再用限制性內切酶HindIII, XbaI和HindIII, NheI分別對質粒pT_SET152和質粒PT-CY104進行雙酶切，產(chǎn)生大小為2315bp和870bp的兩條目的片段，連接后得到質粒pCY104_SET152。以紅色糖多孢菌erythraea的基因組為模板，用引物SEQ ID No. 9和引物SEQ ID No. 10擴增大小為2194bp的erythromycin基因簇下游同源臂片段，與pMD19-T載體做T-A克隆,得到質粒pT-ery-down。質粒pT-ery-down和PCY104-SET152再進一步用限制性內切酶Xba1、MunI和Xba1、EcoRI分別進行雙酶切，產(chǎn)生大小為2200bp和3129bp的兩條目的片段,連接后得到質粒pEry-down,序列如SEQ ID No.11所示。(4)載體pEry-down的同源插入
將構建好的載體pEry-down轉化至大腸桿菌ET12567,挑取陽性轉化子與插入了上游同源載體pEry-up的紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea進行接合轉移,30°C培養(yǎng)16 20h后，在平板表面覆蓋Iml含萘啶酮酸(終濃度為50 mg/ml)和阿泊拉霉素(終濃度為30 mg/ml)的無菌水，30°C培養(yǎng)5天以上挑取接合子。(5)紅色糖多孢菌染色體基因組的抽提及體外ΦΒΤ1整合酶所介導的erythromycin合成基因簇的克隆
抽提插入了同源載體pEry-up和pEry-down的紅色糖多孢菌基因組，確?；蚪M片段包含全部的erythromycin基因簇序列。將基因組片段與ΦΒΤ1整合酶在特定的buffer中30° C溫育過夜。在ΦΒΤ1整合酶的作用下,erythromycin基因簇兩側的aiii 和aii/M立點發(fā)生位點特異性重組反應，進而得到包含erythromycin合成基因簇的全序列，記為質粒PZB201，其序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明方法簡單并且高效，可廣泛的應用于鏈霉菌中抗生素合成基因簇的克隆操作。另外，針對其它的能夠產(chǎn)生重要次生代謝物的生產(chǎn)菌，例如粘細菌、霉菌等，只要在骨架載體上進行相應的修改，加入相應實驗對象所需的元件，獲得相應的同源重組載體，即可實現(xiàn)相應基因簇的克隆操作，并不受宿主種類的限制。


圖1 :質粒pZB201的結構圖。圖2 Erythromycin基因簇上游同源重組載體pEry-up的結構圖。
權利要求
1.質粒PZB201，其序列如SEQID No.1所示。
2.一種抗生素合成基因簇的克隆方法，其特征在于具體步驟為首先構建靶標基因簇上下游的兩個同源重組載體，將ΦΒΤ1整合酶所識別的位點aiii 和ai#分別插在靶標基因簇的兩側；再通過ΦΒΤ1整合酶介導的位點特異性重組反應，使基因簇自身環(huán)化，從而完成基因族的克隆。
3.根據(jù)權利要求2所述的抗生素合成基因簇的克隆方法，其特征在于，抗生素合成基因簇為erythromycin,具體步驟如下 (1)erythromycin基因簇上游同源重組載體pEry-up的構建 以紅色糖多孢菌e/yiAraea的基因組為模板,用引物SEQ ID No.2和引物SEQ ID No. 3擴增大小為1993bp的erythromycin基因簇上游同源臂片段，與PMD19-T載體做T-A克隆，得到質粒T-ery-up，選取MunI位點和T載體上的XbaI位點鄰近的方向，質粒PTARBAC2.1和質粒pDZYlOl分別用Nhe1、EcoRI和Xba1、EcoRI進行雙酶切，產(chǎn)生大小為7478bp和4178bp的兩條片段，連接目的片段，得到質粒pBAC_DZY101 ;質粒pBAC-DZYlOl再用NheI和EcoRI進行消化，產(chǎn)生大小為9500bp的目的片段；質粒T-ery-up用MunI和XbaI進行消化，產(chǎn)生大小為4683的目的片段，連接兩條目的片段，得到質粒pEry-up，序列如 SEQ ID No. 4 所示； (2)載體pEry-up的同源插入 將構建好的載體pEry-up轉化至大腸桿菌ET12567，挑取陽性轉化子與紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea.進行接合轉移，30 °C培養(yǎng)16 20h后,在平板表面覆蓋Iml含萘啶酮酸和卡那霉素的無菌水，30°C培養(yǎng)5天以上挑取接合子； (3)erythromycin基因簇下游同源重組載體pEry-down的構建 以質粒PSET152為模板，用引物SEQ ID No. 5和引物SEQ No. 6擴增大小為2283bp的片段，與PMD19-T載體做T-A克隆得到質粒pT-SET152 ;以質粒pCY104為模板，用引物SEQID No. 7和引物SEQ ID No. 8擴增大小為847bp的片段，與pMD19_T載體做T-A克隆，得到質粒pT-CY104，挑選PCR產(chǎn)物片段上NheI位點離T載體上HindIII位點較遠的方向；再用限制性內切酶HindII1、XbaI和HindII1、NheI分別對質粒pT_SET152和質粒pT_CY104進行雙酶切，產(chǎn)生大小為2315bp和870bp的兩條目的片段，連接后得到質粒pCY104_SET152 ；以紅色糖多孢菌e/yiAraea的基因組為模板,用引物SEQ ID No. 9和引物SEQ ID No. 10擴增大小為2194bp的erythromycin基因簇下游同源臂片段，與pMD19_T 載體做 T-A 克隆，得到質粒 pT-ery-down ;質粒 pT-ery-down 和 pCY104_SET152 再進一步用限制性內切酶Xba1、MunI和Xba1、EcoRI分別進行雙酶切，產(chǎn)生大小為2200bp和3129bp的兩條目的片段,連接后得到質粒pEry-down,序列如SEQ ID No. 11所示； (4)載體pEry-down的同源插入 將構建好的載體pEry-down轉化至大腸桿菌ET12567,挑取陽性轉化子與插入了上游同源載體pEry-up的紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea進行接合轉移,30°C培養(yǎng)16 20h后，在平板表面覆蓋Iml含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的無菌水，30°C培養(yǎng)5天以上挑取接合子； (5)紅色糖多孢菌染色體基因組的抽提及體外ΦΒΤ1整合酶所介導的erythromycin合成基因族的克隆抽提插入了同源載體pEry-up和pEry-down的紅色糖多孢菌基因組，確?；蚪M片段包含全部的erythromycin基因簇序列；將基因組片段與ΦΒΤ1整合酶在特定的buffer中·30° C溫育過夜；在ΦΒΤ1整合酶的作用下，erythromycin基因簇兩側的aiii 和<3(#位點發(fā)生位點特異性重組反應，進而得到包含erythromycin合成基因簇的全序列，記為質粒PZB201，其序列如SEQ ID No.1所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術和基因工程領域，具體為一種基于位點特異性重組系統(tǒng)實現(xiàn)抗生素生物合成基因簇克隆的方法。本發(fā)明是基于鏈霉菌噬菌體φBT1自身編碼的整合酶所介導的位點特異性重組反應，先通過同源重組的方式對抗生素產(chǎn)生菌株進行遺傳改造，在靶標基因簇的兩端分別插入BAC載體、抗性基因和φBT1整合酶所識別的位點特異性重組位點attB和attP，抽提染色體基因組片段，在φBT1整合酶的作用下于體外使attB和attP位點之間發(fā)生位點特異性重組反應，靶標基因簇自身環(huán)化，從而實現(xiàn)幾十甚至幾百kb的大片段抗生素生物合成基因簇的克隆，為生物合成基因簇進一步進行遺傳修飾奠定了基礎，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/66GK103060362SQ201210508069
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權日2012年12月3日
發(fā)明者張渤, 丁曉明, 趙國屏 申請人:復旦大學