專利名稱：凹凸棒土負(fù)載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物活性保護(hù)研究領(lǐng)域，具體地，涉及一種凹凸棒土負(fù)載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法。
背景技術(shù)：
微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過(guò)程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。橙色粘球菌是土壤中分離得到的粘細(xì)菌之一，多用于原核生物社會(huì)學(xué)行為研究的模式菌，其保存方法主要有傳代培養(yǎng)保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法、載體保藏法、冷凍保藏法、冷凍干燥保藏法等，各種保藏方法都有其缺點(diǎn)，如耗時(shí)、耗材、設(shè)備費(fèi)用昂貴等。固定化微生物技術(shù)是在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，采用物理或化學(xué)方法將微生物限定在一定的空間內(nèi)，從而保持微生物活性。通常采用的固定化微生物技術(shù)主要有吸附法、載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法等。有多篇文獻(xiàn)及專利報(bào)道采用固定化保藏菌種，例如文獻(xiàn)“光合細(xì)菌G3菌株固定化保存方法的研究，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39 (2):676-678",申請(qǐng)?zhí)枮?00710018010. 8的專利“基于固定化細(xì)胞技術(shù)的菌種保藏方法”等都報(bào)道了采用固定化細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行菌種保藏的方法。尚未檢索到凹凸棒土負(fù)載殼聚糖對(duì)橙色粘球菌細(xì)胞固定化的報(bào)道。載體材料的性能對(duì)固定化微生物功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。通常載體的表面粗糙度與電荷是影響固定化速率的重要因素，載體材料的表面越粗糙，越有利于微生物在其表面附著固定，同時(shí)孔洞和縫隙等的存在對(duì)已吸附的微生物具有保護(hù)的作用，使它們免受水力剪切的影響。

凹凸棒土是一種多孔型鏈層狀含水富鎂鋁硅酸鹽類粘土礦物，晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)部沸石通道的存在賦予了凹凸棒土巨大的內(nèi)表面積，表面豐富的S1-OH基團(tuán)對(duì)有機(jī)質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，可直接或通過(guò)適當(dāng)?shù)母男蕴幚碛糜诠梯d催化劑，改性凹凸棒土作為生物催化劑酶的載體，在固定化酶的技術(shù)中被廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凹凸棒土負(fù)載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法，利用凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定橙色粘球菌，降低橙色粘球菌活菌制劑生產(chǎn)成本，提高活菌存活率，操作方便，可適用于粗放的工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是以凹凸棒土為原料，對(duì)凹凸棒土進(jìn)行改性處理后負(fù)載殼聚糖，再采用包埋、吸附法相結(jié)合對(duì)橙色粘球菌進(jìn)行固定化。其中，凹凸棒土負(fù)載殼聚糖包被橙色粘球菌固定化方法包括以下步驟
(I)凹土純化凹土與去離子水混合，凹土與去離子的比例為1:5 (w/v)，常溫下IOOr/min攪拌24h，靜置沉降24h后倒掉最下層雜質(zhì)和上清液，加入與上清液等量的去離子水，再常溫100r/min攪拌24h，靜置24h倒掉上清液和下層雜質(zhì)，抽濾，105°C烘干，得純化凹土 ；(2)凹土改性取純化凹土，加入體積濃度為60%的硫酸溶液，凹土與60%的硫酸溶液的比例為1:5 (w/v),常溫下以100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌24h,抽濾,水洗濾餅至水為中性,濾餅105°C烘干，得改性凹土 ；
(3)凹凸棒土負(fù)載殼聚糖用3%(v/v)的醋酸水溶液緩慢溶解脫乙酰度為90%的殼聚糖，配置濃度為5% (w/v)的殼聚糖溶液；取改性凹土加入濃度為5% (w/v)的殼聚糖溶液中，改性凹土與殼聚糖的質(zhì)量比為1:0. 3，50°C攪拌6 h，靜置6 h后除去上清液，抽濾，濾餅115°C干燥，冷卻，研細(xì)，過(guò)160目篩，得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖的固體吸附劑；
(4)菌株活化取一株橙色粘球菌(Myxococcusfulvus) JCH-04,保藏號(hào)為CGMCC No.2893，菌株在CY培養(yǎng)基上34°C培養(yǎng)I天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中34°C、150rpm搖瓶培養(yǎng)2天，接種量為106CFU/ml ;該菌株16S rDNA的GenBank登錄號(hào)為FJ826620 ;所述的CY培養(yǎng)基組成為每IOOOml水中含有酪素水解蛋白胨3g，酵母膏l(xiāng)g，牛血白蛋白O. 5g，泛酸鈣O. 5g，pH7. 5 ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為每IOOOmL水中含有可溶性淀粉Sg，黃豆粉12g，蔗糖10g，葡萄糖 2.5g，酵母膏 0.25g，CaCl2 lg, MgSO4. 7H20 O. 5g, pH 7. 5 ；
(5)菌株擴(kuò)培將菌株活化的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，34°C、150rpm搖瓶培養(yǎng)3天，接種量為106CFU/ml，采用流加量為50mL的變速流加補(bǔ)料，單位菌濃度達(dá)到4. 70 X IO9 CFU/ ml，在無(wú)菌條件下將菌株擴(kuò)培的培養(yǎng)菌液用O. 2Mm微濾膜過(guò)濾濃縮成500億CFU/ml濃縮菌液；
(6)凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌凹凸棒土負(fù)載殼聚糖的固體吸附劑加入步驟(5)的濃縮菌液中，使負(fù)載殼聚糖凹凸棒土與菌液的比例為1:12-1:8 (w/v)，在溫度400C ,150 r/min振蕩60min，抽濾，濾餅_50°C預(yù)凍3h，再迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥18-20h，凍干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌的活菌制劑。本發(fā)明的有益效果是對(duì)凹凸棒土表面負(fù)載殼聚糖，殼聚糖/凹土復(fù)合載體表面有豐富的多糖鏈和功能基團(tuán)，使凹土表面帶有正電荷，能吸附或包裹帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞，加速固定進(jìn)程，更利于微生物的吸附固定化與活性保持，成本低廉，操作方便，活菌存活率高，可適用于粗放的工業(yè)化大生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實(shí)施例不能理解為是對(duì)技術(shù)方案的限制。實(shí)施例1 :依以下步驟制備活菌制劑
(1)凹土純化凹土與去離子水混合，凹土與去離子的比例為1:5(w/v)，常溫下IOOr/min攪拌24h，靜置沉降24h后倒掉最下層雜質(zhì)和上清液，加入與上清液等量的去離子水，再常溫100r/min攪拌24h，靜置24h倒掉上清液和下層雜質(zhì)，抽濾，105°C烘干，得純化凹土 ；
(2)凹土改性取純化凹土，加入體積濃度為60%的硫酸溶液，凹土與60%的硫酸溶液的比例為1:5 (w/v),常溫下以100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌24h,抽濾,水洗濾餅至水為中性,濾餅105°C烘干，得改性凹土 ；
(3)凹凸棒土負(fù)載殼聚糖用3%(v/v)的醋酸水溶液緩慢溶解脫乙酰度為90%的殼聚糖，配置濃度為5% (w/v)的殼聚糖溶液；取改性凹土加入濃度為5% (w/v)的殼聚糖溶液中，改性凹土與殼聚糖的質(zhì)量比為1:0. 3，50°C攪拌6 h，靜置6 h后除去上清液，抽濾，濾餅115°C干燥，冷卻，研細(xì)，過(guò)160目篩，得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖的固體吸附劑；
(4)菌株活化取一株橙色粘球菌(Myxococcusfulvus) JCH-04,保藏號(hào)為CGMCC No.2893，菌株在CY培養(yǎng)基上34°C培養(yǎng)I天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中34°C、150rpm搖瓶培養(yǎng)2天，接種量為106CFU/ml ;該菌株16S rDNA的GenBank登錄號(hào)為FJ826620 ;所述的CY培養(yǎng)基組成為每IOOOml水中含有酪素水解蛋白胨3g，酵母膏l(xiāng)g，牛血白蛋白O. 5g，泛酸鈣O. 5g，pH7. 5 ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為每IOOOmL水中含有可溶性淀粉Sg，黃豆粉12g，蔗糖10g，葡萄糖 2.5g，酵母膏 0.25g，CaCl2 lg, MgSO4. 7H20 O. 5g, pH 7. 5 ；
(5)菌株擴(kuò)培將菌株活化的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，34°C、150rpm搖瓶培養(yǎng)3天，接種量為106CFU/ml，采用流加量為50mL的變速流加補(bǔ)料，單位菌濃度達(dá)到4. 70 X IO9 CFU/ml，在無(wú)菌條件下將菌株擴(kuò)培的培養(yǎng)菌液用O. 2Mm微濾膜過(guò)濾濃縮成500億CFU/ml濃縮菌液；
(6)凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌取8g負(fù)載殼聚糖凹凸棒土加入96ml濃縮菌液中，在溫度40°C、150 r/min振蕩60min，抽濾，濾餅于_50°C預(yù)凍3h，再迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥18h，凍干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌活囷制劑。實(shí)施例2 :步驟(I)-步驟(5)同實(shí)施例1，其步驟(6)凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌是
取25g負(fù)載殼聚糖凹凸棒土加入200ml濃縮菌液中，在溫度40°C、150 r/min振蕩60min,抽濾，濾餅于-50°C預(yù)凍3h，再迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥19h，凍干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌活菌制劑。實(shí)施例3 :步驟(I)-步驟(5)同實(shí)施例1，其步驟(6)凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌是
取50g負(fù)載殼聚糖凹凸棒土加入500ml濃縮菌液中，在溫度40°C、150 r/min振蕩60min,抽濾，濾餅于-50°C預(yù)凍3h，再迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥20h，凍干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌活菌制劑。實(shí)施例1-3所得凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定化橙色粘球菌的活菌制劑，在常溫下，I年細(xì)胞存活率彡90%，活菌數(shù)彡IO10CFU/克。
權(quán)利要求
1.凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉固定β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征是它是以凹凸棒土為原料，對(duì)凹凸棒土進(jìn)行改性處理后負(fù)載海藻酸鈉制備微球，然后微球采用吸附法對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行固定化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉固定β_葡萄糖苷酶的制備方法，其特征是該制備方法包括以下步驟 1)凹土純化凹凸棒土與去離子水混合，凹凸棒土與去離子水的比例為1:5(w/v)，常溫下lOOr/min攪拌24h，靜置沉降24h后，倒掉最下層雜質(zhì)和上清液，再加入與上清液等量的去離子水，常溫lOOr/min攪拌24h，靜置24h，倒掉上清液和下層雜質(zhì)，抽濾，105°C烘干，得純化凹土； 2)酸改性凹土取純化凹土，加入質(zhì)量濃度為60%的硫酸溶液，純化凹土與硫酸溶液的比例為1:5 (w/v),在常溫下，以100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌24h,抽濾,水洗濾餅至水為中性,濾餅在105°C烘干； 3)改性凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉的微球于40°C水浴，配制2%(w/v)海藻酸鈉水溶液，攪拌使之呈均勻體系；稱取酸改性凹土按1:10 (w/v)加入去離子水，置于回旋式振蕩器上以100r/min轉(zhuǎn)速震蕩，分散24h，將分散的酸改性凹土加入2%(w/v)海藻酸鈉水溶液中置于攪拌器內(nèi)攪拌，酸改性凹土與2%(w/v)海藻酸鈉水溶液比例為1:10( 八)，在40-601下復(fù)合2h ;將復(fù)合液體通過(guò)內(nèi)徑為O. 8mm的娃膠管由恒流泵以10 ml/min的速度滴到2% (w/v)CaCl2溶液中，復(fù)合液體與2%(w/v) CaCl2溶液的體積比為1: 1，持續(xù)攪拌交聯(lián)固化12h，抽濾，并用去離子水沖洗，85°C干燥，冷卻，研細(xì)過(guò)100目篩，得凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉微球； 4)β_葡萄糖苷酶的固定將凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉微球加入到裝有濃度為10mg/ml的β -葡萄糖苷酶ΡΗ6. O檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液的容器中，凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉微球與葡萄糖苷酶的質(zhì)量比例為30:1 40:1，溫度40°C，150 r/min振蕩60min，抽濾，濾餅-40°C預(yù)凍3h，再迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥18-20h，凍干后水分控制在4-5%，真空包裝，得凹凸棒土負(fù)載海藻酸鈉固定化葡萄糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凹凸棒土負(fù)載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法，以凹凸棒土為原料，對(duì)凹凸棒土進(jìn)行改性處理后負(fù)載殼聚糖，再采用包埋、吸附法相結(jié)合對(duì)橙色粘球菌進(jìn)行固定化。本發(fā)明利用凹凸棒土負(fù)載殼聚糖固定橙色粘球菌，降低橙色粘球菌活菌制劑生產(chǎn)成本，提高活菌存活率，操作方便，可適用于粗放的工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/10GK103045581SQ201210561348
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者賈建波 申請(qǐng)人:淮陰工學(xué)院