專利名稱：磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法
磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法發(fā)明領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
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本發(fā)明是在申請?zhí)枮?01110451901.9的在先專利的基礎(chǔ)上進行的。
超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, S0D),別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡稱:S0D，是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到的。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標；現(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復(fù)受損 細胞，復(fù)原自由基造成的對細胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要。
SOD具有非均化分解作為富于反應(yīng)性的游離活性氧的超氧化物陰離子自由基的活性。期待可以將SOD用于抗風濕藥物、自身免疫性疾病治療劑、心肌梗塞治療劑和臟器移植，以及用于除去腦梗塞后的抗血栓劑使用時在生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，還可期待將其用于各種炎癥等(參照日本專利第3070980號公報)。
SOD體內(nèi)半衰期短(6-10min)、穩(wěn)定性差、難以進入細胞內(nèi)、與細胞膜親和力小、具有抗原性，直接藥用存在療效差和有一定的副作用等缺點，有必要進行結(jié)構(gòu)修飾和改造。對SOD的分子修飾包括化學修飾和酶切修飾。目前國內(nèi)外大多采用一些不具有免疫原性的水溶性高分子化合物對SOD的非活性部位的氨基酸殘基進行修飾。修飾劑主要有聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚蔗糖、藥用淀粉、粘多糖等。經(jīng)過不同手段修飾后的SOD保留了天然酶活性，而且顯示出體內(nèi)半衰期延長、穩(wěn)定性增加、抗原性降低、毒副作用降低等優(yōu)點(Shimizu T, Iwanaga Μ, YasunagaA.Protective role of glutathione synthesis onradiation-1nduceDNA damage in rabbit brain[J].CeI1-Mo1-Neurobiol, 1998, 18(3):299-310)。
磷脂是膜的主要組成成分，對膜的結(jié)構(gòu)完整、膜的離子傳輸和分子識別等功能的正常發(fā)揮以及依賴于磷脂的蛋白質(zhì)系統(tǒng)的活性等都起著決定作用。人體所有細胞中都含有磷脂，它是維持生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì)。磷脂對活化細胞，維持新陳代謝，基礎(chǔ)代謝及荷爾蒙的均衡分泌，增強人體的免疫力和再生力，都能發(fā)揮重大的作用。概括的講磷脂的基本功用是:增強腦力，安定神經(jīng)，平衡內(nèi)分泌，提高免疫力和再生力，解毒利尿，清潔血液，健美肌膚，保持年輕，延緩衰老。
磷脂酰乙醇胺(PE, phosphatidyl ethanolamine),又名腦磷脂,是磷脂的一種，由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺組成的一種磷脂。存在于腦、神經(jīng)、大豆等中。新鮮制品是無色固體，空氣中易變?yōu)榧t棕色。有吸濕性。不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和乙醚。由于其含有極性部分和非極性部分，極適宜在體內(nèi)降解，無毒性，無免疫原性。作為載體有降低藥物毒性、提高療效、減少副作用和藥物劑量的作用。也可用作抗氧劑。
本發(fā)明使用磷脂酰乙醇胺對銅/鋅配位的，111位半胱氨酸巰基被羥乙基取代的來自于人的SOD進行結(jié)構(gòu)修飾，以提高穩(wěn)定性和活性，增強細胞親和力，降低抗原性和毒副作用，為其臨床應(yīng)用提供支持。
本發(fā)明中，未特別指明的，所述SOD均指銅/鋅配位的，111位半胱氨酸巰基被羥乙基取代的來自于人的S0D，為了描述方便，以下均用SOD來表示。發(fā)明內(nèi)容:
本發(fā)明的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶(PE - S0D)組合物的結(jié)構(gòu)如下式(I)所示，
權(quán)利要求
1.一種磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，如下式(I)所示，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特征在于，SOD為銅/鋅配位的，111位半胱氨酸巰基被羥乙基取代的來自于人的超氧化物歧化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特征在于，η為廣4的整數(shù)，η的平均值為1.5^2.4，該組合物由25 40摩爾％的η=1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35 50摩爾％的n=2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10^20摩爾％的n=3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5 15摩爾％的n=4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特征在于，R選自Cn，C13，C15，C17的烷基。
5.一種權(quán)利要求f 4任一所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，包括以下反應(yīng)步驟: (1)乙二醇在二氯甲烷中與對硝基苯基氯甲酸酯以及吡啶反應(yīng)，生成化合物(II)，乙二醇:對硝基苯基氯甲酸酯:吡啶的摩爾比為1:2 4:4 8，反應(yīng)溫度為O 30° C，反應(yīng)時間3 5小時； (2)惰性氣體保護條件下，化合物(III)與化合物(II)以氯仿為溶劑在三乙胺的作用下生成化合物(IV)，化合物(III):三乙胺:化合物(II)的摩爾比為1:20 30:8 12，反應(yīng)溫度為20 40° C，反應(yīng)時間12 24h ； (3)將SOD溶于適當?shù)娜軇┇@得的SOD溶液，攪拌的同時向該溶液中添加磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)，生成組合物(I)； (4)精制方法，將步驟(3)所得磷脂酰乙醇胺化超氧化物歧化酶組合物吸附于離子交換樹脂后，用溶液A洗脫除去未反應(yīng)的S0D，再用溶液B洗脫磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，濃縮洗脫液既得精制組合物(I);
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所用溶劑選自水或水和有機溶劑的混合溶劑，優(yōu)選水和有機溶劑的混合溶齊U，作為水，選自精制水、離子交換水、蒸餾水或注射用水，有機溶劑，選自異丙醇、N，N —二甲基甲酰胺、N—甲基吡咯烷酮、N，N—二甲基乙酰胺、環(huán)丁砜、二甲亞砜、丙酮、1，4 一二噁烷、甲醇，優(yōu)選異丙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)與SOD的摩爾比為1:0.05、.4，優(yōu)選1:0.1 0.25。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)的反應(yīng)溫度為(T30°C，反應(yīng)時間為0.5 72小時，優(yōu)選2 24小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)的攪拌速度為50 500rpm，優(yōu)選100 300rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟⑷所用溶液A由無機鹽濃度為5 IOOmmol，pH6 9的緩沖液和有機溶劑組成，緩沖液為20 90體積％，有機溶劑為10 80體積％ ;溶液B由無機鹽濃度為150 400mmol, pH6 9的緩沖液和有機溶劑組成，緩沖液為20 90體積％，有機溶劑為10 80體積％。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，溶液A、B所用有機溶劑選自異丙醇、N, N 一二甲基甲酰胺、N —甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、環(huán)丁砜、二甲亞砜、丙酮、1，4 一二噁烷、甲醇，優(yōu)選甲醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及如式(I)所示的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法，銅/鋅配位的，111位半胱氨酸巰基被羥乙基取代的來自于人的超氧化物歧化酶(SOD)的一個以上的氨基被磷脂酰乙醇胺殘基取代，式中n為取代基個數(shù)，n為1~4的整數(shù)，n的平均值為1.5~2.4，式中的R為C11，C13，C15，C17的烷基。如式(I)所示的組合物由25~40摩爾%的n=1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35~50摩爾%的n=2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10~20摩爾%的n=3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5~15摩爾%的n=4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組成。經(jīng)過磷脂酰乙醇胺修飾后的SOD顯示出穩(wěn)定性增加、活性提高等優(yōu)點。
文檔編號C12N9/02GK103184196SQ20121057495
公開日2013年7月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者徐慶春, 秦玉霞, 黃海 申請人:遼寧中海康生物藥業(yè)有限公司