用于丁二烯生物合成的微生物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有丁二烯途徑的非天然存在的微生物。本發(fā)明還提供使用這種生物來生產(chǎn)丁二烯的方法。在一些方面，本文中披露的實(shí)施方式涉及用于生產(chǎn)丁二烯的方法，包括（a）在足夠量的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生巴豆醇的非天然存在的微生物；以及（b）將通過培養(yǎng)該非天然存在的微生物所產(chǎn)生的巴豆醇轉(zhuǎn)化為丁二烯。
【專利說明】用于丁二烯生物合成的微生物和方法
[0001]本申請(qǐng)要求2011年2月2日提交的序列號(hào)為61/438，947的美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該美國臨時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0002]發(fā)明背景
[0003]本發(fā)明一般地涉及生物合成過程，更具體地涉及具有丁二烯生物合成能力的生物。
[0004]每年都有超過250億磅的丁二烯(1，3- 丁二烯，BD)生產(chǎn)出來并應(yīng)用于聚合物(例如合成橡膠和ABS樹脂)和化學(xué)品(例如己撐二胺和1，4_ 丁二醇)的制造中。丁二烯通常作為水蒸汽裂解過程的副產(chǎn)物而產(chǎn)生，所述水蒸汽裂解過程用于將石油原料(例如石腦油、液化的石油氣體、乙烷或者天然氣)轉(zhuǎn)化為乙烯及其他烯烴類。在追求更加可持續(xù)的化學(xué)品生產(chǎn)工藝過程中，從替代和/或可再生原料制造丁二烯的能力將是一個(gè)重大的進(jìn)步。
[0005]可再生地生產(chǎn)丁二烯的一種可能方式涉及糖或其它原料的發(fā)酵，以產(chǎn)生二醇，如1，4- 丁二醇或1，3- 丁二醇，所述二醇在涉及基于金屬的催化作用的第二步驟被分離、純化，然后脫水形成丁二烯。從可再生原料直接發(fā)酵生產(chǎn)丁二烯便無須脫水步驟以及丁二烯氣體(沸點(diǎn)-4.4°C)將連續(xù)地從發(fā)酵罐中射出并易于冷凝和收集。開發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)工藝將消除對(duì)基于化石的丁二烯的需要，以及將允許大量節(jié)省成本和能源并減少有害廢物和排放，與石化衍生的丁二烯形成對(duì)照。
[0006]本文描述了用于有效地從衍生自生物質(zhì)(包括農(nóng)業(yè)和木材廢料)的廉價(jià)的可再生原料(如糖蜜、甘蔗汁和糖)以及Cl原料(如合成氣和二氧化碳)生產(chǎn)丁二烯的微生物和方法，所述微生物和方法包括相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明提供包含丁二烯途徑的非天然存在的微生物，其包括編碼丁二烯途徑酶的以足以生產(chǎn)丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸。此外，本發(fā)明提供通過在各種條件下以及在足以生產(chǎn)丁二烯這么長的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)如本文所述的包含丁二烯途徑的非天然存在的微生物，利用這類微生物生產(chǎn)丁二烯的方法。
[0009]在一些方面，本文所披露的實(shí)施方式涉及一種用于生產(chǎn)丁二烯的方法，該方法包括(a)在足夠量的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生巴豆醇的非天然存在的微生物；以及(b)將通過培養(yǎng)該非天然存在的微生物所產(chǎn)生的巴豆醇轉(zhuǎn)化為丁二烯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1顯示出通往異戊間二烯化合物和萜烯的天然途徑。用于將確認(rèn)的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的酶包括:A.乙?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移`酶、B.羥甲基戊二?；?C0A合酶、C.3-羥基-3-甲基戊二?；?CoA還原酶(醇形成)、D.甲羥戊酸激酶、E.磷酸甲羥戊酸激酶、F.二磷酸甲羥戊酸脫羧酶、G.異戊基-二磷酸異構(gòu)酶、H.異戊二烯合酶。
[0011]圖2顯示出經(jīng)由巴豆醇從乙?；?CoA、戊烯二?；?CoA、戊二?；?CoA、3-氨基丁?；?CoA或者4-羥基丁?；?CoA生產(chǎn)丁二烯的示例性途徑。用于將確認(rèn)的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的酶包括:A.乙酰基-CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶；B.乙酰乙?；?Cok還原酶；C.3-羥基丁?；?Cok脫水酶；D.巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)；E.巴豆醛還原酶(醇形成);F.巴豆醇激酶；G.2-丁烯基-4-磷酸激酶；H.丁二烯合酶；1.巴豆?；?CoA水解酶、合成酶、轉(zhuǎn)移酶J.巴豆酸酯還原酶；K.巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)；L.戊烯二酰基-CoA脫羧酶，戊二?；?CoA脫氫酶；N.3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；0.4-羥基丁?；?CoA脫水酶；P.巴豆醇二磷酸激酶。通向丁二烯的化學(xué)途徑利用脫水過程。
[0012]圖3顯示出 從赤蘚糖-4-磷酸生產(chǎn)丁二烯的示例性途徑。用于將確認(rèn)的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的酶包括:A.赤蘚糖-4-磷酸還原酶、B.赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、C.4-(胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇激酶、D.赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、E.1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、F.1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、G.丁烯基4-二磷酸異構(gòu)酶、H.丁二烯合酶、
1.赤蘚糖-4-磷酸激酶、J.赤蘚糖還原酶、K.赤蘚醇激酶。
[0013]圖4顯示出從丙二?；?Cok和乙酰基-Cok生產(chǎn)丁二烯的示例性途徑。用于將確認(rèn)的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的酶包括:A.丙二?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、B.3-氧代戊二?；?CoA還原酶(酮還原)、C.3-羥基戊二酰基-CoA還原酶(醛形成)、D.3-羥基-5-氧代戊酸還原酶、E.3，5- 二羥基戊酸激酶、F.3H5PP激酶、G.3H5PDP脫羧酶、H.丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、1.丁二烯合酶、J.3-羥基戊二?；?Cok還原酶(醇形成)、K.3-氧代戊二?；?Cok還原酶(醛形成)、L.3，5- 二氧代戊酸還原酶(酮還原)、M.3，5- 二氧代戊酸還原酶(醛還原)、N.5-羥基-3-氧代戊酸還原酶、0.3-氧代-戊二?；?CoA還原酶(CoA還原和醇形成)?；衔锟s寫包括:3H5PP=3-羥基-5-磷酰氧基戊酸和3Η5Η)Ρ=3-羥基_5_[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸。
[0014]發(fā)明詳述
[0015]本發(fā)明旨在設(shè)計(jì)和生產(chǎn)具有丁二烯生物合成生產(chǎn)能力的細(xì)胞和生物。本發(fā)明具體地涉及通過引入一種或者多種的編碼丁二烯途徑酶的核酸設(shè)計(jì)能夠生產(chǎn)丁二烯的微生物。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明利用大腸桿菌新陳代謝的硅內(nèi)化學(xué)計(jì)量模型確認(rèn)用于生物合成生產(chǎn)丁二烯的新陳代謝設(shè)計(jì)。本文所述的結(jié)果表明新陳代謝途徑可以進(jìn)行設(shè)計(jì)和重組工程以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌和其他細(xì)胞或者生物中丁二烯的生物合成。丁二烯的，例如針對(duì)硅內(nèi)設(shè)計(jì)的，生物合成生產(chǎn)可以通過構(gòu)建具有設(shè)計(jì)的新陳代謝基因型的菌株來證實(shí)。這些經(jīng)過新陳代謝工程的細(xì)胞或者生物還可以經(jīng)受適應(yīng)性進(jìn)化，以進(jìn)一步增強(qiáng)丁二烯的生物合成，包括在接近理論最大增長量的條件下。
[0017]在某些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)菌株的丁二烯生物合成特征使得他們具有基因穩(wěn)定性以及在連續(xù)的生物工藝中極為有用。經(jīng)確認(rèn)，單獨(dú)的菌株設(shè)計(jì)策略將不同的非原生或者異源性反應(yīng)能力結(jié)合進(jìn)入了大腸桿菌或者其他宿主生物，導(dǎo)致始自乙?；?CoA、戊烯二酰基-CoA、戍二酸基-CoA、3-氨基丁酸基-CoA、4-羥基丁酸基-CoA、赤蘚糖-4-憐酸；或者始自丙二?；?CoA和乙?；?CoA的丁二烯生產(chǎn)新陳代謝途徑。經(jīng)確認(rèn)，硅內(nèi)新陳代謝設(shè)計(jì)導(dǎo)致了微生物中從這些底物或者代謝中間體的每個(gè)到丁二烯的生物合成。
[0018]經(jīng)由平臺(tái)的計(jì)算組件確認(rèn)的菌株可以通過任何預(yù)測(cè)的新陳代謝改變的基因工程來投入實(shí)際生產(chǎn)，所述預(yù)測(cè)的新陳代謝改變導(dǎo)致丁二烯或者其他中間體和/或下游產(chǎn)品的生物合成生產(chǎn)。在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方式中，展示這些化合物的生物合成生產(chǎn)的菌株可以進(jìn)一步經(jīng)受適應(yīng)性進(jìn)化以進(jìn)一步增強(qiáng)產(chǎn)品生物合成。適應(yīng)性進(jìn)化之后產(chǎn)品生物合成收率的水平也可以通過系統(tǒng)的計(jì)算組件來預(yù)測(cè)。[0019]從葡萄糖到丁二烯的最大理論收率是1.09mol/mol (0.33g/g)。
[0020]11C6H1206=12C4H6+18C02+30H20
[0021]圖2和圖4所示的途徑中，每摩爾所用的葡萄糖收獲1.0摩爾的丁二烯。如果細(xì)胞能夠通過途徑(例如還原的(或者逆向的)TCA循環(huán)或者Wood-Ljungdahl途徑)固定CO2,提高產(chǎn)品收率到理論最大值便是可能的。經(jīng)過工程設(shè)計(jì)以具有圖3中所述的途徑的生物也能夠達(dá)到丁二烯收率的理論最大值的近似值。
[0022]如本文所用，術(shù)語“非天然存在的”當(dāng)關(guān)于本發(fā)明的微生物使用時(shí)，意指該微生物具有至少一種通常不會(huì)在相關(guān)物種的天然存在的菌株(包括相關(guān)物種的野生型菌株)中發(fā)現(xiàn)的基因改變(genetic alteration)?；蚋淖儼?，例如，引入編碼代謝多肽的可表達(dá)的核酸的修飾(modification)、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遺傳物質(zhì)的其他功能中斷。這些修飾包括，例如，相關(guān)物種的異源多肽、同源多肽或異源和同源多肽的編碼區(qū)和功能片段。其他修飾包括，例如，其中該修飾改變基因或操縱子的表達(dá)的非編碼調(diào)控區(qū)域。示例性的代謝多肽包括在丁二烯生物合成途徑內(nèi)的酶或蛋白質(zhì)。
[0023]代謝修飾是指從其天然存在的狀態(tài)發(fā)生改變的生化反應(yīng)。因此，非天然存在的微生物可以具有對(duì)編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的基因修飾。本文披露了示例性的代謝修飾。
[0024]如本文所用，術(shù)語“丁二烯”具有分子式C4H6和分子質(zhì)量54.09g/mol (見圖2_4)(IUPAC名稱為丁 -1，3- 二烯)，其在本文中與1，3- 丁二烯、二乙烯、刺桐烯、聯(lián)乙烯、丁二烯可互換使用。丁二烯是一種具有溫和的芳香味或者類汽油味的無色、非腐蝕性的液化氣。由于燃點(diǎn)低，丁二烯具有易爆性和易燃 性。
[0025]如本文所用，術(shù)語“分離”當(dāng)關(guān)于微生物使用時(shí)，意指當(dāng)相關(guān)微生物在自然界中被發(fā)現(xiàn)時(shí)，基本上不含至少一種組分的生物。該術(shù)語包括當(dāng)在其自然環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)時(shí)從部分或全部組分中脫離的微生物。該術(shù)語還包括當(dāng)其在非天然存在的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)時(shí)從部分或全部組分中脫離的微生物。因此，當(dāng)分離的微生物在自然界中被發(fā)現(xiàn)或者當(dāng)其在非天然存在的環(huán)境中培育、儲(chǔ)存或生存時(shí)，它部分或全部地從其他物質(zhì)中分離。分離的微生物的具體例子包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非天然存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。
[0026]如本文所用，術(shù)語“微生物”意在指任何作為包含在古菌域、細(xì)菌域或真核域的顯微細(xì)胞(microscopic cell)存在的生物。因此,該術(shù)語意包括原核或真核細(xì)胞或具有顯微尺寸的生物并包括所有種類的細(xì)菌、古菌和真細(xì)菌以及真核微生物(如酵母和真菌)。該術(shù)語還包括任何種類的可被培養(yǎng)用于生產(chǎn)生物化學(xué)品的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0027]如本文所用，術(shù)語“CoA”或者“輔酶A”意在指有機(jī)輔因子或者輔基(酶的非蛋白質(zhì)部分)，它的存在為許多酶(脫輔基酶蛋白)的活性所需以形成活性酶系統(tǒng)。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙?；蛘咂渌；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙?；衅鹱饔谩?br> [0028]如本文所用，術(shù)語“基本上厭氧”當(dāng)關(guān)于培養(yǎng)或培育條件使用時(shí)意指氧量少于液體培養(yǎng)基內(nèi)溶解的氧的飽和量的約10%。該術(shù)語還意在包括在小于約1%的氧的氣氛中保持的液體或固體培養(yǎng)基的密封室。
[0029]如本文所用，“外源”意指有關(guān)分子或有關(guān)活性被引入宿主微生物。分子可以例如,通過將編碼核酸引入宿主遺傳物質(zhì),如通過整合入宿主染色體或作為非染色體遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒)被引入。因此，當(dāng)關(guān)于編碼核酸的表達(dá)使用時(shí)，該術(shù)語指將編碼核酸以可表達(dá)的形式引入微生物。當(dāng)關(guān)于生物合成活性使用時(shí)，該術(shù)語指被引入宿主有關(guān)生物的活性。來源可以是例如，表達(dá)引入宿主微生物后有關(guān)活性的同源或異源編碼核酸。因此，術(shù)語“內(nèi)源”指在宿主內(nèi)存在的有關(guān)分子或活性。同樣，當(dāng)關(guān)于編碼核酸的表達(dá)使用時(shí)，該術(shù)語指包含在微生物體內(nèi)編碼核酸的表達(dá)。術(shù)語“異源”指來自與有關(guān)物種不同的來源的分子或活性而“同源”指來自宿主微生物的分子或活性。因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源性表達(dá)可以利用異源編碼核酸和同源編碼核酸的其一或兩者。
[0030]理解的是，當(dāng)微生物內(nèi)包含一種以上的外源性核酸時(shí)，所述一種以上的外源性核酸指相關(guān)的編碼核酸或者生物合成活性，如上文所討論。進(jìn)一步理解的是，如本文所披露，這類一種以上的外源性核酸可以被引入在單獨(dú)的核酸分子上、在多順反子核酸分子上或者在其組合上的宿主微生物，并且仍然被看作是一種以上的外源性核酸。例如，如本文所披露，微生物可被設(shè)計(jì)以表達(dá)兩種或者兩種以上的編碼所需的途徑酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸。在兩種編碼所需活性的外源性核酸被引入宿主微生物的情況下，理解的是，該兩種外源性核酸可以作為單一核酸被 引入例如，在單一質(zhì)粒上、在單獨(dú)的質(zhì)粒上，可以被整合入位于單個(gè)位點(diǎn)或者多個(gè)位點(diǎn)的宿主染色體，以及仍然被看作是兩種外源性核酸。同樣，理解的是，兩種以上的外源性核酸可以任何所需的組合形式被引入例如，在單一質(zhì)粒上、在單獨(dú)的質(zhì)粒上的宿主生物，可以被整合入位于單一位點(diǎn)或者多個(gè)位點(diǎn)的宿主染色體，以及仍然被看作是兩種或者兩種以上的外源性核酸，例如三種外源性核酸。因此，相關(guān)的外源性核酸或者生物合成活性的數(shù)量指編碼核酸的數(shù)量或者生物合成活性的數(shù)量，而非被引入宿主生物的單獨(dú)的核酸的數(shù)量。
[0031]本發(fā)明的該非天然存在的微生物可以包含穩(wěn)定的基因改變，這指可以培養(yǎng)超過五代而無改變損失的微生物。一般地，穩(wěn)定的基因改變包括持續(xù)超過10代的修飾，具體地，穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過約25代，以及更具體地，穩(wěn)定的基因修飾將超過50代，包括永久地。
[0032]本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解所述基因改變(包括本文示例性的代謝修飾)是關(guān)于合適的宿主生物(如大腸桿菌)及其相應(yīng)的代謝反應(yīng)或所需的代謝途徑的所需的遺傳物質(zhì)(如基因)的合適的來源生物描述的。然而，如果有各種各樣的生物的完整的基因組測(cè)序和基因組學(xué)領(lǐng)域的高水平技能，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠很容易地將本文提供的教誨和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有的其他生物。例如，本文示例性的大腸桿菌代謝改變可以通過納入來自非相關(guān)物種的物種的相同或類似的編碼核酸很容易地應(yīng)用到其他物種。一般地，這類基因改變包括例如，物種同系物的基因改變，以及具體地，直系同源、旁系同源或非直系同源基因置換。
[0033]直系同源是通過垂直傳遞(vertical descent)相關(guān)且導(dǎo)致不同的生物內(nèi)基本上相同或相似的功能的一種或多種基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人環(huán)氧化物水解酶因環(huán)氧化物水解的生物功能可以被認(rèn)為是直系同源。例如，當(dāng)基因共有足夠量的序列相似性以表明它們是同源的或者通過進(jìn)化自共同的祖先相關(guān)時(shí)，所述基因通過垂直傳遞相關(guān)。如果基因共有足夠量的三維結(jié)構(gòu)但不一定共有序列相似性以表明它們進(jìn)化自共同的祖先達(dá)到基本序列相似性無法識(shí)別的程度，也認(rèn)為它們是直系同源。直系同源的基因可以編碼具有約25%到100%氨基酸序列一致性的序列相似性的蛋白質(zhì)。如果編碼共有的氨基酸相似性小于25%的蛋白質(zhì)的基因其三維結(jié)構(gòu)也顯示出相似性，則所述基因也可以被認(rèn)為通過垂直傳遞產(chǎn)生。酶類的絲氨酸蛋白酶家族的成員(包括組織型纖維蛋白溶酶原激活劑和彈性蛋白酶)被認(rèn)為通過垂直傳遞產(chǎn)生自共同的祖先。
[0034]直系同源包括通過例如，進(jìn)化在結(jié)構(gòu)或整體活性方面趨異的基因或其編碼基因產(chǎn)物。例如，當(dāng)一種物種編碼顯示兩種功能的基因產(chǎn)物以及當(dāng)這類功能在第二個(gè)物種內(nèi)已經(jīng)分為不同的基因時(shí)，這三個(gè)基因及其相應(yīng)的產(chǎn)物被認(rèn)為是直系同源。對(duì)于生化產(chǎn)品的生產(chǎn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解含待引入或破壞的代謝活性的直系同源的基因?qū)⒈贿x擇用于所述非天然存在的微生物的構(gòu)建。顯示各自活性的直系同源的例子是當(dāng)兩個(gè)或兩個(gè)以上物種之間或一個(gè)單一物種內(nèi)部不同的活性已經(jīng)分為不同的基因產(chǎn)物的情況。具體的例子是彈性蛋白酶蛋白質(zhì)水解和纖維蛋白溶酶原蛋白質(zhì)水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)分離為作為纖維蛋白溶酶原激活劑和彈性蛋白酶的不同分子。第二個(gè)例子是支原體5’-3’核酸外切酶和果蠅DNA聚合酶III活性的分離。來自第一物種的DNA聚合酶可以被認(rèn)為是來自第二物種的核酸外切酶和聚合酶其一或兩者的直系同源，反之亦然。
[0035]相反，旁系同源是通過例如，復(fù)制然后進(jìn)化趨異相關(guān)的同系物并具有相似或共同的，但不完全相同的功能。旁系同源可以源自例如，相同物種或源自不同的物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶II)可以被認(rèn)為是旁系同源，因?yàn)樗鼈兇韮煞N不同的酶類，協(xié)同進(jìn)化自共同的祖先，催化不同的反應(yīng)并在相同的物種內(nèi)具有不同的功能。旁系同源是來自彼此具有顯著的序列相似性的相同物種的蛋白質(zhì)，這表明它們是同源的或通過協(xié)同進(jìn)化自共同的祖先而相關(guān)。旁系同源蛋白質(zhì)家族的群體包括HipA同系物、熒光素酶基因、肽酶以及其他。
[0036]非直系同源基因置換是來自一個(gè)物種的非直系同源基因，可以替代一種不同的物種內(nèi)有關(guān)基因功能。替代包 括例如，能夠在起源物種內(nèi)執(zhí)行與所述不同的物種內(nèi)所述有關(guān)功能相比基本上相同或相似的功能。雖然一般地，非直系同源基因置換可看作是與編碼有關(guān)功能的已知基因結(jié)構(gòu)相關(guān)，不過結(jié)構(gòu)相關(guān)性差但功能相似的基因及其相應(yīng)的基因廣物仍然會(huì)如本文所用，落入所述術(shù)語的含義之內(nèi)。功能相似性要求例如，與編碼試圖被替代的功能的基因相比，在非直系同源基因產(chǎn)物的活性位點(diǎn)或結(jié)合區(qū)域具有至少一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，直系同源基因包括例如，旁系同源或不相關(guān)的基因。
[0037]因此，識(shí)別和構(gòu)建本發(fā)明的具有丁二烯生物合成能力的非天然存在的微生物時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)將本文提供的教誨和指導(dǎo)應(yīng)用于特定的物種并會(huì)理解代謝修飾的識(shí)別可以包括直系同源的識(shí)別和包含或滅活。如果編碼催化相似或基本上相似的代謝反應(yīng)的酶的旁系同源和/或非直系同源基因置換存在于參照微生物內(nèi)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以利用這些進(jìn)化上相關(guān)的基因。
[0038]直系同源、旁系同源和非直系同源基因置換可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法確定。例如，對(duì)兩種多肽的核酸或氨基酸序列的檢驗(yàn)將揭示所比較的序列之間的序列一致性和相似性?；谶@種相似性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定相似性是否足夠高以表明蛋白質(zhì)是通過進(jìn)化自共同的祖先而相關(guān)的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的算法(如Align、BLAST、Clustal W以及其他)比較并確定原始序列相似性或一致性，以及還確定序列內(nèi)空隙的存在或大小，其可以被賦予權(quán)數(shù)或得分。這類算法在本領(lǐng)域也已知并同樣適用于確定核苷酸序列的相似性或一致性。足夠的相似性以確定相關(guān)性的參數(shù)的計(jì)算基于熟知的用于計(jì)算統(tǒng)計(jì)相似性的方法或在隨機(jī)多肽中發(fā)現(xiàn)相似匹配的幾率以及確定的所述匹配的程度。如果需要，兩個(gè)或兩個(gè)以上序列的計(jì)算機(jī)對(duì)比還可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行可視優(yōu)化。相關(guān)的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)應(yīng)該具有高度的相似性，例如，25%到100%的序列一致性。不相關(guān)的蛋白質(zhì)可以具有一致性，所述一致性基本上與預(yù)計(jì)將發(fā)生的幾率相同，如果掃描一個(gè)具有相當(dāng)規(guī)模的數(shù)據(jù)庫(約5%)。5%到24%之間的序列可代表或不代表足以得出所比較的序列具有相關(guān)性的結(jié)論的同源性。在給定數(shù)據(jù)集的大小的情況下，可以進(jìn)行額外的確定這種匹配的程度的統(tǒng)計(jì)分析，以確定這些序列的相關(guān)性。
[0039]用于使用例如，所述BLAST算法確定兩個(gè)或兩個(gè)以上序列的相關(guān)性的示例性參數(shù)可以如下文描述。簡(jiǎn)言之，氨基酸序列比對(duì)可以使用BLASTP版本2.0.8(1999年I月5日)以及以下參數(shù)執(zhí)行:矩陣:0BL0SUM62 ;空位開放:11 ;空位延伸:1 ；x_dropoff:50 ;期望值:
10.0 ;序列長度:3 ;過濾器:開。核酸序列比對(duì)可以使用BLASTN版本2.0.6 (1998年9月16日)以及以下參數(shù)執(zhí)行:匹配:1 ;錯(cuò)配:-2 ;空位開放:5 ;空位延伸:2 ；x_dropoff:50 ;期望值:10.0 ;序列長度:11 ;過濾器:關(guān)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道對(duì)以上參數(shù)作何修改會(huì)例如，增加或減少比較的嚴(yán)格性，以及確定兩個(gè)或兩個(gè)以上序列的相關(guān)性。
[0040]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，該微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?Cok水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶；巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)；戊烯二?；?CoA脫羧酶；戊二?；?CoA脫氫酶；3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；4_羥基丁?；?CoA脫水酶或者巴豆醇二磷酸激酶(圖2)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟A-Η )。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?Cok酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?Cok還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟A-C、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、丁二烯合酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、K、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟A-C、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?Cok還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊烯二酰基-CoA脫羧酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟L、D-H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊烯二酰基-Cok脫羧酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)(圖2，步驟L、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊烯二酰基-CoA脫羧酶、丁二烯合酶、 巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、K、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟L、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-羥基丁酰基-CoA脫水酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯戊烯二?；?CoA脫羧酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、C、D、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟M、D-H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟M、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊二酰基-Cok脫氫酶、丁二烯合酶、巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、K、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊二?；?Cok脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟M、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括戊二?；?Cok脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟11、13、？、!0。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-羥基丁?；?Cok脫水酶、巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶、戊二?；?CoA脫氫酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、C、D、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟N、D-H)0在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)(圖2，步驟N、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶、丁二烯合酶、巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、K、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2- 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟隊(duì)1、144 、6、!0。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶、3-氨基丁?；?Cok脫氨酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、C、D、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?Cok脫水酶、巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、
2-丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟O、D-H)0在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟0、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?Cok脫水酶、丁二烯合酶、巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、K、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟0、1、134、6、!0。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成);丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶、4-羥基丁酰基-CoA脫水酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、C、D、E、P、H)。
[0041 ] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種包括巴豆醇途徑的非天然存在的微生物。該巴豆醇途徑包括編碼巴豆醇途徑酶的以足以產(chǎn)生巴豆醇的量表達(dá)的至少一種外源性核酸。該巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?Cok還原酶；
3-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶；巴豆?；?CoA還原酶(醇形成);戊烯二酰基-CoA脫羧酶；戊二?；?CoA脫氫酶；3_氨基丁?；?CoA脫氨酶；或者4-羥基丁?；?Cok脫水酶。
[0042]在某些實(shí)施方式中，該微生物包括兩種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶；在其他實(shí)施方式中，該微生物包括三種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶；在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該微生物包括四種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
[0043]在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括戊烯二酰基-CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括戊二酰基-CoA脫氫酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?Cok水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，該巴豆醇途徑包括4-羥基丁酰基-CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，具有巴豆醇途徑的非天然存在的微生物具有至少一種外源性核酸，該外源性核酸是異源性核酸。在某些實(shí)施方式中，該具有巴豆醇途徑的非天然存在的微生物在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
[0044]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的微生物，該微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4_(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、赤蘚糖-4-磷酸激酶、赤蘚糖還原酶或者赤蘚醇激酶(圖3)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶和丁二烯合酶(圖3，步驟A-F和H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異 構(gòu)酶和丁二烯合酶(圖3，步驟A-Η)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁二烯合酶、赤蘚糖-4-磷酸激酶、赤蘚糖還原酶和赤蘚醇激酶(圖3，步驟1、J、K、B-F、H)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、赤蘚糖-4-磷酸激酶、赤蘚糖還原酶和赤蘚醇激酶(圖3，步驟1、J、K、B-H)。
[0045]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的微生物，該微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙酰基-Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代戊二?；?Cok還原酶(酮還原)、3-羥基戊二?；?Cok還原酶(醛形成)、3-羥基-5-氧代戊酸還原酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、3-羥基戊二?；?CoA還原酶(醇形成)、3_氧代戊二酰基-CoA還原酶(醛形成)、3，5-二氧代戊酸還原酶(酮還原)、3，5- 二氧代戊酸還原酶(醛還原)、5-羥基-3-氧代戊酸還原酶或者3-氧代-戊二?；?CoA還原酶(CoA還原和醇形成)(圖4)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(酮還原)、3-羥基戊二?；?CoA還原酶(醛形成)、3-羥基-5-氧代戊酸還原酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4-二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶(圖4，步驟A-Ι)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷酰基]氧基戊 酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(醛形成)、3，5- 二氧代戊酸還原酶(醛還原)和5-羥基-3-氧代戊酸還原酶。(圖4，步驟A、K、M、N、E、F、G、H、I)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?Cok酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥基-5-氧代戊酸還原酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷酰基]氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4-二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、3-氧代戊二酰基-CoA還原酶(醛形成)和3，5- 二氧代戊酸還原酶(酮還原)。(圖4，步驟A、K、L、D、E、F、G、H、I)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、5-羥基-3-氧代戊酸還原酶和3-氧代-戊二?；?Cok還原酶(CoA還原和醇形成)。(圖4，步驟A、O、N、E、F、G、H、I)。在一個(gè)方面，該非天然存在的微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，其具有編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(酮還原)、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶和3-羥基戊二?；?CoA還原酶(醇形成)。(圖4，步驟A、B、J、E、F、G、H、I)。
[0046]在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種具有丁二烯途徑的非天然存在的微生物，其中該非天然存在的微生物包括編碼酶或者蛋白質(zhì)的至少一種外源性核酸，所述酶或者蛋白質(zhì)進(jìn)行選自如下的從底物到產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化:乙?；?CoA到乙酰乙?；?CoA、乙酰乙?；?CoA到3-羥基丁?；?CoA、3-羥基丁?；?CoA到巴豆酰基-CoA、巴豆?；?CoA到巴豆醛、巴豆醛到巴豆醇、巴豆醇到2- 丁烯基-磷酸、2- 丁烯基-磷酸到2- 丁烯基-4- 二磷酸、2- 丁烯基-4- 二磷酸到丁二烯、赤蘚糖-4-磷酸到赤蘚醇-4-磷酸、赤蘚醇-4-磷酸至|J4_(胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇、4-(胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇到2-磷酸-4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇、2-磷酸-4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇到赤蘚醇_2，4-環(huán)二磷酸、赤蘚醇_2，4-環(huán)二磷酸到1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸到丁烯基4- 二磷酸、丁烯基4- 二磷酸到2- 丁烯基4- 二磷酸、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸到2- 丁烯基4- 二磷酸、2- 丁烯基4- 二磷酸到丁二烯、丙二?；?CoA和乙酰基-CoA到3-氧代戊二?；?CoA、3-氧代戊二?；?CoA到3-羥基戊二?；?CoA到3-羥基-5-氧代戊酸、3-羥基-5-氧代戊酸到3，5- 二羥基戊酸、3，5- 二羥基戊酸到3-羥基-5-磷酰氧基戊酸、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸到3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸、3-羥基_5-[羥基(膦酰氧基)磷酰基]氧基戊酸到丁烯基4- 二磷酸、戊烯二?；?CoA到巴豆?；?CoA、戊二酰基-CoA到巴豆?；?CoA、3-氨基丁?；?CoA到巴豆酰基-CoA、4-羥基丁?；?CoA到巴豆?；?CoA、巴豆?；?CoA到巴豆酸、巴豆酸到巴豆醛、巴豆酰基-CoA到巴豆醇、巴豆醇到2- 丁烯基-4- 二磷酸、赤蘚糖-4-磷酸到赤蘚糖、赤蘚糖到赤蘚醇、赤蘚醇到赤蘚醇-4-磷酸、3-氧代戊二?；?CoA到3，5- 二氧代戊酸、3，5- 二氧代戊酸到5-羥基-3-氧代戊酸、5-羥基-3-氧代戊酸到3，5- 二羥基戊酸、3-氧代戊二酰基-CoA到5-羥基-3-氧代戊酸、3，5- 二氧代戊酸到3-羥基-5-氧代戊酸以及3-羥基戊二?；?CoA到3，5- 二羥基戊酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解這些僅僅是示例性以及基于本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定本文披露的任何適于生產(chǎn)所需產(chǎn)品以及具有從底物到產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化所需的適當(dāng)活性的底物-產(chǎn)品對(duì)。因此，本發(fā)明提供了一種包含編碼酶或者蛋白質(zhì)的至少一種外源性核酸的非天然存在的微生物，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化丁二烯途徑的底物以及產(chǎn)品，如圖2-圖4中所示。
[0047]雖然本文中一般地描述了一種包含丁二烯途徑的微生物，但是可以理解的是，本發(fā)明另外提供了一種非天然存在的微生物，該微生物包括編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯途徑的中間體的量表達(dá)的至少一種外源性核酸。例如，如本文所披露，丁二烯途徑的示例見圖2-圖4。因此，除了包含生產(chǎn)丁二烯的丁二烯途徑的微生物，本發(fā)明還提供一種包括編碼丁二烯途徑酶的至少一 種外源性核酸的非天然存在的微生物，其中該微生物生產(chǎn)丁二烯途徑中間體，例如，乙酰乙酰基-CoA、3-羥基丁酰基-CoA、巴豆?；?CoA、巴豆醛、巴豆醇、2- 丁烯基-磷酸、2- 丁烯基-4- 二磷酸、赤蘚醇-4-磷酸、4-(胞啶5’- 二磷酸)-赤蘚醇、2-磷酸-4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇、赤蘚醇_2，4-環(huán)二磷酸、1-羥基-2- 丁烯基
4-二磷酸、丁烯基4- 二磷酸、2- 丁烯基4- 二磷酸、3-氧代戊二?；?CoA、3-羥基戊二?；?CoA、3-羥基-5-氧代戊酸、3，5- 二羥基戊酸、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸、巴豆酸、赤蘚糖、赤蘚醇、3，5-二氧代戊酸或者5-羥基_3_氧代戍酸。
[0048]理解的是，本文披露的任何途徑，如實(shí)施例中所述的以及附圖中示范的途徑(包括圖2-圖4的途徑)，可用以生成一種根據(jù)需要生產(chǎn)任何途徑中間體或者產(chǎn)品的非天然存在的微生物。如本文所披露，這類生產(chǎn)中間體的微生物可以與另一種表達(dá)下游途徑酶的微生物組合使用，以生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。然而，理解的是，生產(chǎn)丁二烯途徑中間體的非天然存在的微生物可用以將該中間體作為所需的產(chǎn)品來生產(chǎn)。[0049]在某些實(shí)施方式中，能夠通過生物合成生產(chǎn)巴豆醇以及隨后經(jīng)化學(xué)脫水為丁二烯來獲得丁二烯。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)丁二烯的方法，該方法包括
(a)在足夠量的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生巴豆醇的非天然存在的微生物；以及(b)將通過培養(yǎng)該非天然存在的微生物所產(chǎn)生的巴豆醇轉(zhuǎn)化為丁二烯。
[0050]醇的脫水已為本領(lǐng)域所知并且可以包括各種催化的和非催化的熱過程。在某些實(shí)施方式中，催化的熱脫水采用金屬氧化物催化劑或二氧化硅。在某些實(shí)施方式中，該方法的步驟(b)在催化劑的存在下通過化學(xué)脫水執(zhí)行。例如，已經(jīng)指出，巴豆醇可以經(jīng)鑰酸鉍脫水(Adams, C.R.J.Catal.10:355-361，1968)，以提供 1，3-丁二烯。
[0051]脫水可以通過活化醇基以及后續(xù)通過標(biāo)準(zhǔn)消除機(jī)制(如El或E2消除)消除而實(shí)現(xiàn)?；罨梢酝ㄟ^將醇基轉(zhuǎn)換為鹵素(如碘、氯或溴)的方式實(shí)現(xiàn)。活化也可以通過磺?；?、磷酸鹽或?qū)⒋嫁D(zhuǎn)化為良好的離去基團(tuán)的其他活化功能來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，活化基團(tuán)是選自甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、間硝基苯磺酸酯、對(duì)溴苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯的硫酸鹽或硫酸酯。在某些實(shí)施方式中，該離去基團(tuán)是磷酸鹽或磷酸酯。在某些這類實(shí)施方式中，脫水劑是五氧化二磷。
[0052]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用包括巴豆醇途徑的非天然存在的微生物，該巴豆醇途徑具有編碼巴豆醇途徑酶的以足以產(chǎn)生巴豆醇的量表達(dá)的至少一種外源性核酸。該巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆?；?CoA還原酶(醛形成);巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶；巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)；戊烯二?；?CoA脫羧酶；戊二?；?CoA脫氫酶；3_氨基丁?；?CoA脫氨酶；或者4-羥基丁?；?CoA脫水酶。
[0053]在某些實(shí)施方式中 ，本發(fā)明依賴于巴S.醇的生物生產(chǎn)的方法利用微生物，該微生物包括兩種外源核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用微生物，該微生物包括三種外源核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用微生物，該微生物包括四種外源核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
[0054]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁酰基-Cok脫水酶、巴豆酰基-Cok還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括乙酰基-CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰基-CoA還原酶、3-羥基丁?；?Cok脫水酶和巴豆酰基-Cok還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁酰基-CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
[0055]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括戊烯二酰基-Cok脫羧酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括戊烯二?；?Cok脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括3-羥基丁酰基-CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)和戊烯二?；?CoA脫羧酶。
[0056]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括3-羥基丁?；?Cok脫水酶、巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)和戊二酰基-Cok脫氫酶。
[0057]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括3-羥基丁?；?CoA脫水酶 、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)和3-氨基丁?；?CoA脫氨酶。
[0058]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括4-羥基丁酰基-CoA脫水酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括4-羥基丁酰基-CoA脫水酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成);巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有巴豆醇途徑的微生物，該巴豆醇途徑包括
3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)和4-羥基丁酰基-CoA脫水酶。
[0059]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴S.醇的生物生產(chǎn)的方法利用具有至少一種外源性核酸的微生物，該外源性核酸是異源性核酸。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于巴豆醇的生物生產(chǎn)的方法利用非天然存在的微生物，該非天然存在的微生物在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
[0060]根據(jù)本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，在通向1，3- 丁二烯的進(jìn)一步的化學(xué)酶催化路徑中可以靶向丁二烯途徑中的其他生物合成中間體。例如，已經(jīng)指出，巴豆醛可以在乙醇的存在下，在二氧化硅催化劑之上被轉(zhuǎn)化為1，3- 丁二烯(Toussaint等人，Ind.Eng.Chem.，39(2): 120 - 125，(1947))。在某些實(shí)施方式中，用于生產(chǎn) I, 3- 丁二烯的方法包括:a)在足夠量的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生巴豆醛的非天然存在的微生物；以及(b)將通過培養(yǎng)該非天然存在的微生物所產(chǎn)生的巴豆醛轉(zhuǎn)化為丁二烯。在本發(fā)明的某些這類化學(xué)酶催化過程中，巴豆醛和乙醇均可以作為來自單一的非天然存在的生物體或來自兩種獨(dú)立的生物體的發(fā)酵產(chǎn)物被提供。如上所述，可以用二氧化硅催化劑將這兩種發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為1，3- 丁二烯。
[0061]本文一般地參照代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或其產(chǎn)物，或者具體地參照一種或多種編碼酶(所述酶與所參照的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物有關(guān)或者催化所參照的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物)的核酸或基因?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行描述。除非本文另有明確規(guī)定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解對(duì)反應(yīng)的參照也構(gòu)成了對(duì)所述反應(yīng)的反應(yīng)物以及產(chǎn)物的參照。同樣，除非本文另有明確規(guī)定,對(duì)反應(yīng)物或產(chǎn)物的參照也是對(duì)反應(yīng)的參照，以及對(duì)任何這些代謝組分的參照也是參照一種或者多種的編碼酶或蛋白質(zhì)的基因，所述酶催化所參照的反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物以及所述蛋白質(zhì)包含在所參照的反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物中。同樣地，考慮到熟知的代謝生物化學(xué)、酶學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域，本文對(duì)基因或編碼核酸的參照也構(gòu)成對(duì)相應(yīng)的被編碼的酶和其催化的反應(yīng)；或者與所述反應(yīng)以及所述反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物相關(guān)的蛋白質(zhì)的參照。
[0062]如本文所披露，中間體巴豆酸酯；3，5- 二氧代戊酸、5-羥基-3-氧代戊酸、3_羥基-5-氧代戊酸、3-氧代戊二?；?CoA和3-羥基戊二?；?CoA，以及其他中間體是可以以不同的離子化形式(包括完全質(zhì)子化的、部分質(zhì)子化的和完全去質(zhì)子化的形式)發(fā)生的羧酸。因此，后綴“酯”或酸形式可以互換使用，以描述游離酸形式以及任何去質(zhì)子化的形式，特別是因?yàn)?，已知離子化形式依賴于化合物被發(fā)現(xiàn)時(shí)的pH。理解的是，羧化物產(chǎn)品或者中間體包括羧化物產(chǎn)品或者途徑中間體的酯形式，例如O-羧酸酯和S-羧酸酯。O-羧化物和S-羧化物可以包括較低級(jí)的烷基，即Cl到C6的支鏈或者直鏈羧化物。一些這類O-羧化物或S-羧化物包括但不僅限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、i_丙基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基O-羧化物或S-羧化物，其中任何一種可以進(jìn)一步具有不飽和，提供例如丙烯基、丁烯基、戊基和己烯基O-羧化物或S-羧化物。O-羧化物可以是生物合成途徑的產(chǎn)物。經(jīng)由生物合成途徑獲得的示例性的O-羧化物可以包括但不僅限于巴豆酸甲酯；甲基-3，5-二氧代戊酸；甲基-5-羥基-3-氧代戊酸；甲基-3-羥基-5-氧代戊酸；3_氧代戊二酰基-CoA，甲酯；3_羥基戊二?；?CoA，甲酯；巴豆酸乙酯；乙基_3，5-二氧代戊酸；乙基-5-羥基-3-氧代戊酸；乙基-3-羥基-5-氧代戊酸；3_氧代戊二酰基-CoA，乙酯；3_羥基戊二酰基-CoA，乙酯；巴豆酸正丙酯；n-丙基-3，5- 二氧代戊酸；n-丙基-5-羥基-3-氧代戊酸；n_丙基-3-羥基-5-氧代戊酸；3_氧代戊二酰基-CoA，正丙酯；以及3-羥基戊二?；?CoA，正丙酯。其他可通過生物合成獲得的O-羧化物可以包括中鏈到長鏈基團(tuán)，即衍生自脂肪族醇(例如庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、棕櫚醇、十七醇、十八醇、十九醇、花生醇、二十一醇和二十二醇)的C7-C220-羧酸酯，其中任何一種可以可選地是支鏈的和/或包含不飽和。O-羧酸酯還可以經(jīng)由生化或者化學(xué)過程(例如游離羧酸產(chǎn)品的酯化作用或者O-羧化物或S-羧化物的轉(zhuǎn)酯作用)獲得。S-羧化物的例子是CoA S-酯類、半胱氨酰S-酯類、烷基硫酯類以及各種芳基和雜芳基硫酯類。
[0063]本發(fā)明所述的非天然存在的微生物可以通過引入可表達(dá)的核酸來生產(chǎn)，該核酸編碼一種或者多種的參與一種或者多種的丁二烯生物合成途徑的酶。根據(jù)選定用于生物合成的宿主微生物，可以表達(dá)用于部分或者全部的具體丁二烯生物合成途徑的核酸。例如，如果在所需的生物合成途徑中，選定的宿主存在一種或者多種的酶的缺陷，則將用于缺陷的一種或者多種的酶或蛋白質(zhì)的可表達(dá)的核酸引入該宿主用于后續(xù)的外源性表達(dá)。替代性地，如果該選定的宿主顯示出一些途徑酶的內(nèi)源性表達(dá)，但是在其他方面存在缺陷，則需要用于缺陷的一種或者多種的酶或蛋白質(zhì)的編碼核酸，以實(shí)現(xiàn)丁二烯的生物合成。因此，可以通過引入外源酶或者蛋白質(zhì)活性以獲得所需的生物合成途徑來生產(chǎn)本發(fā)明的非天然存在的微生物或者可以通過引入與一種或者多種內(nèi)源性的酶或者蛋白質(zhì)一起生產(chǎn)所需的產(chǎn)品(如丁二烯)的一種或者多種外源酶或者蛋白質(zhì)活性以獲得所需的生物合成途徑。
[0064]宿主微生物可以選自以及所述非天然存在的微生物可以生成于，例如細(xì)菌、酵母、真菌或各種其他適用于發(fā)酵過程的微生物的任意一種。示例性的細(xì)菌包括選自如下的物種:大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、琥珀酸放線桿菌、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、氧化葡糖桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌、丙酮丁醇梭菌、螢光假單胞菌以及惡臭假單胞菌。示例性的酵母或真菌包括選自如下的物種:釀酒酵母、人體酵母菌探針、乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、土曲霉、黑曲霉、畢赤酵母、無根根霉菌、稻根霉菌(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母等等。大腸桿菌是一種特別有用的宿主生物，因?yàn)槠涫且环N適于基因工程的具有良好表征的微生物。其他特別有用的宿主生物包括酵母，如釀酒酵母。理解的是，任何適合的宿主微生物可用以引入代謝和/或基因修飾，以生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。
[0065]依據(jù)選定的宿主微生物的丁二烯的生物合成途徑構(gòu)成，本發(fā)明所述的非天然存在的微生物將包括至少一種外源性表達(dá)的丁二烯途徑的編碼核酸乃至用于一種或者多種丁二烯生物合成途徑的所有的編碼核酸。例如，通過外源性表達(dá)相應(yīng)的編碼核酸在存在途徑酶或者蛋白質(zhì)缺陷的宿主內(nèi)建立丁二烯生物合成。在存在丁二烯途徑的所有的酶或者蛋白質(zhì)缺陷的宿主內(nèi)，可以 包含該途徑中所有的酶或者蛋白質(zhì)的外源性表達(dá)，雖然理解的是，即使該宿主包含至少一種途徑酶或者蛋白質(zhì)，也可以表達(dá)該途徑的所有的酶或者蛋白質(zhì)。例如，可以包含用于生產(chǎn)丁二烯的途徑中所有的酶或者蛋白質(zhì)的外源性表達(dá)，例如乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰基-CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟A-H)。
[0066]考慮到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解以可表達(dá)的形式引入的編碼核酸的數(shù)量將，至少，等于所選定的宿主微生物的丁二烯途徑缺陷量。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物可以具有一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種，乃至所有的編碼本文披露的構(gòu)成丁二烯生物合成途徑的酶的核酸。在一些實(shí)施方式中，該非天然存在的微生物還可以包括其他促進(jìn)或者優(yōu)化丁二烯的生物合成或者賦予該宿主微生物其他有用的功能的基因修飾。一種這類的其他功能性可以包括例如，對(duì)一種或者多種丁二稀途徑前體(如乙酸基-CoA、戍稀二酸基-CoA、戍二酸基-CoA、3_氛基丁酸基-CoA、4-羥基丁酰基-CoA、赤蘚糖-4-磷酸或丙二?；?CoA)的合成的增強(qiáng)。
[0067]一般地，宿主微生物應(yīng)該這樣選擇以便其生產(chǎn)丁二烯途徑的前體，作為自然生產(chǎn)的分子或作為工程產(chǎn)物，其提供所需前體的從新生產(chǎn)或由該宿主微生物自然生產(chǎn)的前體的增加生廣。例如，乙酸基-CoA、戍稀二酸基-CoA、戍二酸基-CoA、3_氛基丁酸基-CoA、4-輕基丁?；?CoA、赤蘚糖-4-磷酸或丙二?；?CoA自然產(chǎn)生于宿主生物，如大腸桿菌。宿主生物可以設(shè)計(jì)以增加前體的生產(chǎn)，正如本文所披露。此外，已被設(shè)計(jì)以生產(chǎn)所需前體的微生物可用作宿主生物并進(jìn)一步被設(shè)計(jì)，以表達(dá)丁二烯途徑的酶或蛋白質(zhì)。
[0068]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的非天然存在的微生物生成自包含合成丁二烯的酶催能力的宿主。在該特定的實(shí)施方式中，其可用以增加丁二烯途徑產(chǎn)物的合成或堆積以，例如促使發(fā)生丁二烯途徑反應(yīng)，以便生產(chǎn)丁二烯。合成或堆積的增加可以通過，例如編碼上述的一種或多種丁二烯途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸的過表達(dá)來完成。該一種或多種丁二烯途徑酶和/或蛋白質(zhì)的過表達(dá)的發(fā)生可以，例如通過一種或多種內(nèi)源性基因的外源性表達(dá)或通過一種或多種異源性基因的外源性表達(dá)。因此，通過一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種，即乃至所有的編碼丁二烯生物合成途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸的過表達(dá)，天然存在的生物可以很容易地生成為本發(fā)明的非天然存在的微生物。此外，非天然存在的生物可以通過造成丁二烯生物合 成途徑中酶活性的增加的內(nèi)源性基因的誘變來生成。
[0069]在特別有用的實(shí)施方式中，采用編碼核酸的外源性表達(dá)。外源性表達(dá)賦予對(duì)宿主定制表達(dá)和/或調(diào)節(jié)元件的能力以及獲得使用人控制的所需的表達(dá)水平的應(yīng)用。然而，其他實(shí)施方式中還可以利用內(nèi)源性表達(dá)，例如當(dāng)連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件時(shí)，通過去除負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)子或基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)利用內(nèi)源性表達(dá)。因此，具有天然存在的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的內(nèi)源性基因可以通過提供適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑上調(diào)；或者內(nèi)源性基因的調(diào)節(jié)區(qū)域可設(shè)計(jì)以納入誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件，從而允許在需要的時(shí)候調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的上調(diào)表達(dá)。同樣，可以包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，作為針對(duì)引入非天然存在的微生物的外源性基因的調(diào)節(jié)元件。
[0070]理解的是，在本發(fā)明的方法中，任何所述一種或者多種外源性核酸可被引入微生物以生產(chǎn)本發(fā)明的一種非天然存在的微生物。該核酸可被引入以便賦予該微生物，例如丁二烯生物合成途徑。替代性地，可以引入編碼核酸，以生產(chǎn)具有生物合成能力的中間體微生物，以催化所需的反應(yīng)的一些，從而賦予丁二烯生物合成能力。例如，具有丁二烯生物合成途徑的非天然存在的微生物可以包括至少兩種編碼所需的酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，所述酶的例子有如下組合:巴豆醇激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶和丁二烯合酶；或者替代性地，3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，巴豆?；?CoA水解酶和巴豆醇二磷酸激酶；或者替代性地，赤蘚糖還原酶和丁二烯合酶；或者替代性地，3-氧代-戊二酰基-CoA還原酶(CoA還原和醇形成)和3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶等等。因此，應(yīng)理解的是，生物合成途徑的兩種或兩種以上酶的任意組合可以包含在本發(fā)明的非天然存在的微生物中。同樣，應(yīng)理解的是，按照要求，生物合成途徑的三種(例如，巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶和丁二烯合酶；或者替代性地，3-氧代戊二?；?CoA還原酶、3-羥基-5-氧代戊酸還原酶和丁二烯合酶；或者替代性地，乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、巴豆醇激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，戊烯二?；?CoA脫羧酶、巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶；或者替代性地，赤蘚糖-4-磷酸激酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇激酶和1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶；或者替代性地，3，5- 二氧代戊酸還原酶(醛還原)、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶等等)或三種以上酶或蛋白質(zhì)的任意組合可以包含在本發(fā)明的非天然存在的微生物中，只要所需的生物合成途徑的酶或蛋白質(zhì)的組合導(dǎo)致相應(yīng)的所需產(chǎn)品的產(chǎn)生。同樣，按照要求，本文披露的生物合成途徑的四種(例如巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶；或者替代性地，3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸激酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶；或者替代性地，赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，3-氨基丁?；?Cok脫氨酶、巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)、巴豆醇二磷酸激酶和丁二烯合酶；或者替代性地，赤蘚糖還原酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶和1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶；或者替代性地，丙二?；?CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基戊二?；?Cok還原酶(醇形成)、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶)或四種以上酶或蛋白質(zhì)的任意組合可以包含在本發(fā)明的非天然存在的微生物中，只要所需的生物合成途徑的酶或蛋白質(zhì)的組合導(dǎo)致相應(yīng)的所需產(chǎn)品的產(chǎn)生。[0071]除本文所述的丁二烯的生物合成之外，本發(fā)明所述的非天然存在的微生物和方法也可以通過彼此間以及與本領(lǐng)域熟知的其他微生物和方法進(jìn)行各種組合來應(yīng)用，以通過其他路徑實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品生物合成。例如，除了使用丁二烯生產(chǎn)者之外，一種生產(chǎn)丁二烯的替代性方法是通過加入另一種能夠?qū)⒍《┩緩街虚g體轉(zhuǎn)化為丁二烯的微生物。
[0072]一種這樣的程序包括例如，生產(chǎn)丁二烯途徑中間體的微生物的發(fā)酵。該丁二烯途徑中間體然后可以用作將丁二烯途徑中間體轉(zhuǎn)化為丁二烯的第二微生物的底物。該丁二烯途徑中間體可以被直接加入該第二生物的另一培養(yǎng)物或該丁二烯途徑中間體生產(chǎn)者的原始培養(yǎng)物可以通過，例如細(xì)胞分離耗盡這些微生物，然后可以利用將第二生物隨后加入發(fā)酵肉湯，以生產(chǎn)最終產(chǎn)品而無中間體純化的步驟。
[0073]在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述非天然存在的微生物和方法可以在各種各樣的子途徑中進(jìn)行組合，以實(shí)現(xiàn)，例如丁二烯的生物合成。在這些實(shí)施方式中，可以將用于本發(fā)明的所需產(chǎn)品的生物合成途徑分離到不同的微生物中，以及可以共同培養(yǎng)該不同的微生物，以生產(chǎn)最終產(chǎn)品。在這種生物合成方案中，一種微生物的產(chǎn)物是用于第二微生物的底物，直至合成最終產(chǎn)品。例如，可以通過構(gòu)建如下微生物完成丁二烯的生物合成:該微生物包含用于將一個(gè)途徑中間體轉(zhuǎn)化為另一途徑中間體或產(chǎn)物的生物合成途徑。替代性地，也可以通過利用相同器皿內(nèi)的兩種生物的共同培養(yǎng)或共同發(fā)酵從微生物生物合成生產(chǎn)丁二烯，其中第一種微生物生產(chǎn)丁二烯中間體以及第二種微生物將該中間體轉(zhuǎn)化為丁二烯。
[0074]考慮到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解存在針對(duì)本發(fā)明的所述非天然存在的微生物和方法，連同其他微生物、具有子途徑的其他非天然存在的微生物的共同培養(yǎng)物以及本領(lǐng)域熟知的生產(chǎn)丁二烯的其他化學(xué)和/或生化程序的組合的各種各樣的組合和排列。
[0075]用于丁二烯途徑酶或蛋白質(zhì)的編碼核酸的源可以包括，例如其中被編碼的基因產(chǎn)物能夠催化參照反應(yīng)的任何物種。這類物種既包括原核生物又包括真核生物，包括但不僅限于細(xì)菌(包括古生細(xì)菌和真細(xì)菌)以及真核生物(包括酵母)、植物、昆蟲、動(dòng)物以及哺乳動(dòng)物(包括人)。針對(duì)這種源的示例性物種包括，例如大腸桿菌、發(fā)酵氨基酸球菌、貝氏不動(dòng)桿菌、乙酸鈣不動(dòng)桿菌、不動(dòng)桿菌屬種ADPl、不動(dòng)桿菌屬種菌株M-1、超嗜熱菌、擬南芥、Col生態(tài)型擬南芥、Col生態(tài)型擬南芥、閃爍古生球菌DSM4304、固氮弧菌屬種CIB、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、牛、馬爾他布魯氏菌、伯克霍爾德氏菌ambifaria AMMD、瘤狀伯克霍爾德氏菌、空腸彎曲桿菌、白色念珠菌、木蘭假絲酵母、橙色綠屈撓菌、楊氏檸檬酸桿菌ATCC29220、丙酮丁醇梭菌、氨基丁酸梭菌、拜氏梭菌、拜氏梭菌NCIMB8052、拜氏梭菌NRRLB593、肉毒桿菌C菌株Eklund、克魯佛氏梭菌、克魯佛氏梭菌DSM555、諾氏梭菌NT、丙酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、臺(tái)灣貪銅菌、藍(lán)菌屬PCC7001、盤基網(wǎng)柄菌AX4、糞腸球菌、赤細(xì)菌屬種NAP1、大腸桿菌K12、大腸桿菌菌株K-12次代菌株MG1655、直腸真桿菌ATCC33656、具核梭桿菌、具核梭桿菌亞種具核ATCC25586、熱葡糖苷酶地芽孢桿菌、雨生紅球藻、流感嗜血桿菌、死海鹽盒菌ATCC43049、幽門螺旋桿菌、智人、肺炎克雷伯氏菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、海洋Y -蛋白質(zhì)菌HTCC2080、勤奮生金球菌、詹氏甲烷球菌、小家鼠、鳥型分枝桿菌亞種類結(jié)核K-10、牛結(jié)核分支桿菌BCG、海分枝桿菌M、包皮垢分支桿菌MC2155、結(jié)核分枝桿菌、肺炎支原體M129、皮疽諾卡氏菌IFM10152、艾瓦諾卡氏菌(sp.NRRL5646)、穴兔、脫氮副球菌、產(chǎn)黃青霉、銀白楊、歐洲山楊X銀白楊、牙齦紅棕色單胞菌、牙齦紅棕色單胞菌W83、綠膿假單胞菌、綠膿假單胞菌PA01、熒光假單胞菌、熒光假單胞菌Pf-5、帚形假單胞菌(B13)、惡臭假單胞菌、惡臭假單胞菌E23、惡臭假單胞菌KT2440、假單胞菌屬種、山葛、耐超高溫?zé)岚艟觏?、激烈熱球菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16、羅爾斯通氏貪銅菌、褐鼠、類球紅細(xì)菌、赤紅球菌、沼澤紅假單胞菌、腸羅斯氏菌(Roseburia intestinalis) L1-82、羅斯氏菌inulinivoransDSM16841、羅斯氏菌屬種A2-183、Roseiflexus castenholzi1、釀酒酵母、紅色糖多抱菌NRRL2338、腸沙門氏菌亞種arizonae serovar、鼠傷寒沙門氏菌、人體酵母菌探針、加州希蒙得木、苜蓿中華根瘤菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌亞種灰色NBRC13350、鏈霉菌屬種A CT-1、嗜酸熱硫化葉菌、希氏硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、硫化葉菌tokodai1、集胞藍(lán)細(xì)菌屬種菌株P(guān)CC6803、Syntrophus aciditrophicus、布氏熱厭氧桿菌HTD4、騰沖熱厭氧桿菌MB4、細(xì)長嗜熱聚球藻、海棲熱袍菌MSB8、嗜熱棲熱菌、嗜熱棲熱菌HB8、陰道滴蟲G3、類絲孢酵母(Trichosporonoides megachiliensis)、布氏錐蟲、微代謝冢村氏菌DSM20162、中間耶爾森氏菌ATCC29909、生枝動(dòng)膠菌、魯氏接合酵母、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌以及本文披露的其他示例性物種可作為相應(yīng)基因的源生物(原文語法錯(cuò)誤)。然而，今天超過550個(gè)物種的完整的基因組序列是可得的(這些物種中超過一半的基因組序列在公用數(shù)據(jù)庫，如NCBI中可以得到)，包括395種微生物基因組和各種酵母、真菌、植物以及哺乳動(dòng)物基因組，在這種情況下，編碼針對(duì)近緣或遠(yuǎn)緣物種中一種或多種基因的必要的丁二烯生物合成活性的基因的識(shí)別(包括，例如已知基因的同系、直系同源、旁系同源和非直系同源基因置換)以及生物之間基因改變的互換在本領(lǐng)域是常規(guī)且熟知的。因此，實(shí)現(xiàn)本文所述的關(guān)于特定生物(如大腸桿菌)的丁二烯的生物合成的代謝改變可以以同樣的方式很容易地應(yīng)用到其他微生物，包括原核和真核生物?？紤]到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)得知在一種生物中示范的代謝改變可以同樣地應(yīng)用于其他生物。[0076]在某些情況下，例如當(dāng)替代性的丁二烯生物合成途徑存在于不相關(guān)的物種中時(shí)，可以通過，例如來自催化相似的、但非完全相同的代謝反應(yīng)以取代參照反應(yīng)的不相關(guān)物種的一種旁系同源物或多種旁系同源物的外源性表達(dá)，賦予該宿主物種丁二烯的生物合成。由于不同的生物之間存在代謝網(wǎng)絡(luò)間的某些差異，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解不同生物之間的實(shí)際的基因用法可以存在差異。然而，考慮到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還會(huì)理解，本發(fā)明的教誨和方法可以通過利用對(duì)本文那些示例性的微生物所作的同源代謝改變應(yīng)用于所有的微生物，以在有關(guān)的物種中構(gòu)建會(huì)合成丁二烯的微生物。
[0077]可以例如，通過本領(lǐng)域熟知的重組和檢測(cè)方法操作用于構(gòu)建和測(cè)試生產(chǎn)非天然存在的丁二烯的宿主的表達(dá)水平的方法。這類方法的描述可以見于，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring HarborLaboratory, New York (2001) ；Ausubel 等人,Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)
[0078]可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(包括但不限于接合、電穿孔術(shù)、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和超聲轉(zhuǎn)化)將用于生產(chǎn)丁二烯的途徑中涉及的外源性核酸序列穩(wěn)定或瞬時(shí)地引入宿主細(xì)胞。對(duì)于大腸桿 菌或其他原核細(xì)胞中的外源性表達(dá)，真核細(xì)胞核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以編碼導(dǎo)向信號(hào)(targeting signal),如N-末端線粒體導(dǎo)向信號(hào)或其他導(dǎo)向信號(hào)，如果需要，其可以在轉(zhuǎn)換進(jìn)入原核宿主細(xì)胞之前被去除。例如，線粒體前導(dǎo)序列的去除導(dǎo)致了大腸桿菌中表達(dá)的上調(diào)(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。對(duì)于酵母或其他真核細(xì)胞中的外源性表達(dá)，可以在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)基因，而不添加前導(dǎo)序列；或者可以通過添加適于宿主細(xì)胞的合適的導(dǎo)向序列(如線粒體導(dǎo)向或分泌信號(hào))將基因?qū)蚓€粒體或其他細(xì)胞器或者導(dǎo)向分泌。因此，理解的是，對(duì)核酸序列的適當(dāng)?shù)囊匀コ虬瑢?dǎo)向序列的修改可被納入外源性核酸序列中，以提供所需的特性。此外，以本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可以使基因經(jīng)受密碼子優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的優(yōu)化表達(dá)。
[0079]表達(dá)載體可以被構(gòu)建以包括如本文所示范的可操作地連接于宿主生物中功能性的表達(dá)調(diào)控序列的一種或多種丁二烯生物合成途徑編碼核酸。適用于本發(fā)明的宿主微生物的表達(dá)載體包括，例如質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體和人工染色體(包括可操作地用以穩(wěn)定地整合到宿主染色體的載體和選擇序列或標(biāo)記)。此外，該表達(dá)載體可以包括一種或多種選擇標(biāo)記基因和適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列。還可以包括，例如提供抗生素或毒素抗性、補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷或者提供培養(yǎng)基中沒有的關(guān)鍵營養(yǎng)物的選擇標(biāo)記基因。表達(dá)調(diào)控序列可以包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子以及本領(lǐng)域熟知的諸如此類的表達(dá)調(diào)控序列。當(dāng)兩個(gè)或兩個(gè)以上外源性編碼核酸被共同表達(dá)時(shí)，兩個(gè)核酸都可以被插入，例如單一表達(dá)載體或獨(dú)立表達(dá)載體。對(duì)于單一載體表達(dá)，編碼核酸可被可操作地連接到一個(gè)共同的表達(dá)調(diào)控序列或連接到不同的表達(dá)調(diào)控序列，如一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和一個(gè)組成型啟動(dòng)子。可以利用本領(lǐng)域熟知的方法確定代謝或合成途徑中涉及的外源性核酸序列的轉(zhuǎn)化。這類方法包括，例如核酸分析法，如Northern印跡法或mRNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增；或基因產(chǎn)物表達(dá)免疫印跡法；或其他合適的測(cè)試被引入的核酸序列或其相應(yīng)的基因產(chǎn)物的表達(dá)的分析方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的是，以足以生產(chǎn)所需產(chǎn)品的量來表達(dá)外源性核酸以及進(jìn)一步理解的是，可以利用本領(lǐng)域熟知的和本文披露的方法優(yōu)化表達(dá)水平以獲得足夠的表達(dá)。[0080]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)丁二烯的方法，該方法包括培養(yǎng)非天然存在的微生物，該微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶；巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)；戊烯二?；?CoA脫羧酶；戊二?；?CoA脫氫酶；3_氨基丁?；?CoA脫氨酶；4_羥基丁?；?CoA脫水酶或者巴豆醇二磷酸激酶(圖2)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟A-H)0在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?Cok還原酶、3-羥基丁?；?Cok脫水酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆酰基-Cok還原酶(醇形成)(圖2，步驟A-C、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁酰基-CoA脫水酶、丁二烯合酶、巴豆酰基-Cok還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、K、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶、巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟A-C、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-Cok?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆酰基-Cok還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-E、P、H )。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊烯二酰基-CoA脫羧酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟L、D-H)0在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟L、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊烯二?；?Cok脫羧酶、丁二烯合酶、巴豆酰基-Cok還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、K、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟L、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-羥基丁酰基-CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯戊烯二?；?CoA脫羧酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、C、D、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟M、D-H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟M、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊二?；?Cok脫氫酶、丁二烯合酶、巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、K、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟M、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括戊二酰基-CoA脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶、戊二?；?CoA脫氫酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、C、D、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟N、D-H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟N、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶、丁二烯合酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、K、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟N、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-氨基丁酰基-Cok脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶、
3-氨基丁?；?CoA脫氨酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N,C,D,E,P,H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶和丁二烯合酶(圖2，步驟0、D-H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?Cok脫水酶、巴豆醇激酶、2- 丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)(圖2，步驟0、K、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶、丁二烯合酶、巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、K、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆醇激酶；2_ 丁烯基-4-磷酸激酶；丁二烯合酶；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶和巴豆酸酯還原酶(圖2，步驟O、1、J、E、F、G、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括4-羥基丁酰基-CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；丁二烯合酶；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟0、1、J、E、P、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括3-羥基丁酰基-Cok脫水酶、巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合酶、4-羥基丁酰基-CoA脫水酶和巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟0、C、D、E、P、H)。
[0081]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)丁二烯的方法,該方法包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物，該微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、赤蘚糖-4-磷酸激酶、赤蘚糖還原酶或者赤蘚醇激酶(圖3)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基
4-二磷酸還原酶和丁二烯合酶(圖3，步驟A-F和H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括赤蘚糖-4-磷酸還原酶、赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4_(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶(圖3，步驟A-Η)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4-( 胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、
1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁二烯合酶、赤蘚糖-4-磷酸激酶、赤蘚糖還原酶和赤蘚醇激酶(圖3，步驟1、J、K、B-F、H)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶、4_(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇激酶、赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸合酶、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、赤蘚糖-4-磷酸激酶、赤蘚糖還原酶和赤蘚醇激酶(圖3，步驟1、J、K、B-H)。
[0082]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)丁二烯的方法,該方法包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物，該微生物包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括編碼丁二烯途徑酶的以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，該丁二烯途徑包括丙二酰基-CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(酮還原)、3_羥基戊二?；?Cok還原酶(醛形成)、3_羥基-5-氧代戊酸還原酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、3-羥基戊二?；?CoA還原酶(醇形成)、3_氧代戊二?；?CoA還原酶(醛形成)、3，5- 二氧代戊酸還原酶(酮還原)、3，5- 二氧代戊酸還原酶(醛還原)、5_羥基-3-氧代戊酸還原酶或者3-氧代-戊二?；?Cok還原酶(CoA還原和醇形成)(圖4)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(酮還原)、3_羥基戊二?；?Cok還原酶(醛形成)、3-羥基-5-氧代戊酸還原酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基_5-[羥基(膦酰氧基)磷酰基]氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶和丁二烯合酶(圖4，步驟A-Ι)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(醛形成)、3，5- 二氧代戊酸還原酶(醛還原)和5-羥基-3-氧代戊酸還原酶。(圖4，步驟八、1(4、？、6、!1、1)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基-5-氧代戊酸還原酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4-二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(醛形成)和3，5- 二氧代戊酸還原酶(酮還原)。(圖4，步驟A、K、L、D、E、F、G、H、I)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶、5-羥基-3-氧代戊酸還原酶和3-氧代-戊二酰基-CoA還原酶(CoA還原和醇形成)。(圖4，步驟A、O、N、E、F、G、H、I)。在一個(gè)方面，該方法包括具有丁二烯途徑的微生物，該丁二烯途徑包括丙二?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代戊二?；?CoA還原酶(酮還原)、3，5- 二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸激酶、3-羥基_5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸脫羧酶、丁烯基4- 二磷酸異構(gòu)酶、丁二烯合酶和3-羥基戊二酰基-CoA還原酶(醇形成)。(圖4，步驟A、B、J、E、F、G、H、I)。
[0083]可以利用熟知的方法進(jìn)行適用于丁二烯生產(chǎn)測(cè)試的純化和/或測(cè)定。可以為每個(gè)設(shè)計(jì)的待測(cè)菌株培育合適的復(fù)制品，如一式三份的培養(yǎng)物。例如，可以監(jiān)測(cè)所設(shè)計(jì)的生產(chǎn)宿主中產(chǎn)物和副產(chǎn)物的形成?？梢酝ㄟ^各種方法，例如HPLC (高效液相色譜)、GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜法)和LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜法)或者其他利用本領(lǐng)域熟知的例行程序的合適的分析方法來分析最終產(chǎn)品和中間體以及其他有機(jī)化合物。也可以利用培養(yǎng)上清液對(duì)產(chǎn)物在發(fā)酵肉湯中的釋放進(jìn)行測(cè)試?？梢岳?，例如針對(duì)葡萄糖和醇的折光率檢測(cè)器以及針對(duì)有機(jī)酸的紫外檢測(cè)器(Lin等人，Biotechnol.Bioeng.90:775-779 (2005))通過HPLC或本領(lǐng)域熟知的其他合適的測(cè)定和檢測(cè)方法對(duì)副產(chǎn)物和殘余葡萄糖進(jìn)行定量。也可以利用本領(lǐng)域熟知的方法對(duì)來自外源性DNA序列的個(gè)別酶或蛋白質(zhì)活性進(jìn)行測(cè)定。典型的測(cè)定方法見于 Manual on Hydrocarbon Analysis (ASTM Manula Series, A.ff.Drews, ed.,第 6版，1998，American Society for Testing and Materials, Baltimore, Maryland)。
[0084]可以利用本領(lǐng)域熟知的各種方法從培養(yǎng)物中的其他組分中分離丁二烯。這類分離方法包括，例如萃取程序以及包括如下的方法:連續(xù)液液萃取法、全蒸發(fā)法、膜濾法、膜分離法、反滲透法、電滲析法、蒸餾法、結(jié)晶法、離心法、萃取過濾法、離子交換色譜法、體積排阻色譜法、吸附色譜法以及超濾法。所有上述方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0085]本文所述的任何所述非天然存在的微生物可以培養(yǎng)以生產(chǎn)和/或分泌本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。例如，丁二烯生產(chǎn)者可以培養(yǎng)用于丁二烯的生物合成生產(chǎn)。
[0086]為了生產(chǎn)丁二烯，在具有碳源和其他必需營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株。在發(fā)酵罐中保持厭氧條件以降低整個(gè)過程的消耗，這在有時(shí)候是需要的并且肯定是非?？扇〉?。這種條件的獲取可以通過，例如首先用氮噴射該培養(yǎng)基，然后用墊片和鉗口蓋密封燒瓶。對(duì)于培育不遵循厭氧的菌株，可以通過在該墊片上打一小孔進(jìn)行有限通氣來采用微氧或者基本上厭氧的條件。示例性的厭氧條件已有先前描述并為本領(lǐng)域所熟知。示例性的有氧和厭氧條件的描述見于，例如2007年8月10日提交的美國公布號(hào)2009/0047719。如本文所披露，可以以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)的方式進(jìn)行發(fā)酵。
[0087]如果需要，可以將培養(yǎng)基的pH值保持為所需的pH值，特別是按需要通過添加堿(如NaOH或其他堿)或酸保持為中性pH值(如約7的pH值)，以將培養(yǎng)基保持在所需的pH值?？梢酝ㄟ^利用分光光度計(jì)(600nm)測(cè)量光密度確定生長速率，以及可以通過監(jiān)測(cè)隨著時(shí)間的推移碳源的消耗確定葡萄糖攝取速率。
[0088]生長培養(yǎng)基可以包括，例如任何可以向該非天然存在的微生物提供碳源的碳水化合物源。這類源包括，例如糖類(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉)。其他碳水化合物源包括，例如可再生的原料和生物質(zhì)?？稍诒景l(fā)明所述的方法中用作原料的示例性類型的生物質(zhì)包括纖維素生物質(zhì)、半纖維素生物質(zhì)和木素原料或原料的木素部分。這類生物質(zhì)原料包含，例如用作碳源的碳水化合物底物(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉)?？紤]到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解除上文那些示例性的原料和生物質(zhì)，可再生的原料和生物質(zhì)也可用以培養(yǎng)用于生產(chǎn)丁二烯的本發(fā)明的所述微生物。
[0089]除了如上文的那些示例性的可再生的原料，本發(fā)明所述的丁二烯微生物也可以修改為將合成氣作為其碳源進(jìn)行培育。在這個(gè)特定的實(shí)施方式中，在生產(chǎn)丁二烯的生物中表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)或酶，以提供用于利用合成氣或其他氣態(tài)碳源的代謝途徑。
[0090]合成氣體(也稱為合成氣或者發(fā)生爐煤氣)是煤炭和碳質(zhì)材料(如包括農(nóng)作物和農(nóng)業(yè)剩余物的生物質(zhì)材料)氣化的主要產(chǎn)物。合成氣是一種主要含H2和CO的混合物以及可以通過氣化任何有機(jī)原料(包括但不僅限于煤炭、煤油、天然氣、生物質(zhì)以及有機(jī)廢物)獲得。一般地，在高燃料/氧氣比的條件下進(jìn)行氣化。雖然大部分含H2和CO，合成氣還可以包括少量的CO2和其他氣體。因此，合成氣體提供了有成本效益的氣體碳源，如CO以及另外地，CO2。
[0091 ] Wood-Ljungdahl途徑催化從CO和H2到乙?；?CoA和其他產(chǎn)物(如乙酸)的轉(zhuǎn)化。能夠利用CO和合成氣的生物一般地也具有通過該Wood-Ljungdahl途徑包含的相同的基本酶和轉(zhuǎn)化組利用CO2和C02/H2混合物的能力。通過微生物依賴H2的從CO2到乙酸的轉(zhuǎn)化得到公認(rèn)很長時(shí)間之后，顯示，CO也可以被相同的生物采用以及涉及的途徑也相同。已有顯示，許多產(chǎn)乙酸菌在CO2的存在下生長，以及只要存在氫以提供必需的還原當(dāng)量，便生產(chǎn)化合物，如乙酸(見例如，Drake, Acetogenesis, pp.3-60Chapman and Hall, New York, (1994))。這可以概括為如下的反應(yīng)式:
[0092]2C02+4H2+n ADP+n Pi — CH3C00H+2H20+n ATP。[0093]因此，具有該Wood-Ljungdahl途徑的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物來生產(chǎn)乙?；?Cok和其他所需的產(chǎn)品。
[0094]該Wood-Ljungdahl途徑為本領(lǐng)域熟知以及由12個(gè)反應(yīng)組成,所述反應(yīng)可以分為兩個(gè)支路:(1)甲基支路和(2)羰基支路。該甲基支路將合成氣轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸(甲基-THF)而該羰基支路將甲基-THF轉(zhuǎn)化為乙酰基-CoA。依次通過如下酶或者蛋白質(zhì)催化該甲基支路中的反應(yīng):鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲?；臍淙~酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。依次通過如下酶或者蛋白質(zhì)催化在該羰基支路中的反應(yīng):甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶(例如AcsE)、鈷鐵硫蛋白質(zhì)、鎳-蛋白質(zhì)裝配蛋白質(zhì)(例如AcsF)、鐵氧還蛋白、乙?；?CoA合酶、一氧化碳脫氫酶和鎳-蛋白質(zhì)裝配蛋白質(zhì)(例如CooC)。遵循本文提供的關(guān)于引入足夠數(shù)量的編碼核酸以生成丁二烯途徑的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，關(guān)于至少引入編碼宿主生物中缺少的Wood-Ljungdahl酶或者蛋白質(zhì)的核酸，也可以進(jìn)行相同的工程設(shè)計(jì)。因此，將一種或者多種編碼核酸引入本發(fā)明的微生物使得修飾的生物包含完整的Wood-Ljungdahl途徑,這將獲得合成氣利用能力。
[0095]另外，與一氧化碳脫氫酶和/或氫化酶活性偶合的還原(逆)三羧酸循環(huán)用于也可以用于C0、C02和/或4到乙?；?CoA和其他產(chǎn)物(如乙酸)的轉(zhuǎn)化。能夠經(jīng)由還原TCA途徑來固定碳的生物可以利用一種或者多種如下酶:ATP檸檬酸-裂解酶、檸檬酸裂解酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、α -酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸還原酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、NAD (P)H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、一氧化碳脫氫酶，以及氫化酶。具體地，將通過一氧化碳脫氫酶和氫化酶從CO和/或H2萃取得到的還原當(dāng)量用于經(jīng)由還原TCA循環(huán)將CO2固定入乙酰基-CoA或者乙酸。乙酸可以通過酶(如乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶/磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶以及乙?；?CoA合成酶)轉(zhuǎn)化為乙?；?CoA。乙酰基-CoA可以通過丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和糖異生酶轉(zhuǎn)化為丁二烯、甘油醛-3-磷酸、磷酸烯 醇丙酮酸以及丙酮酸。遵循本文提供的關(guān)于引入足夠數(shù)量的編碼核酸以生成丁二烯途徑的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，關(guān)于至少引入編碼宿主生物中缺少的還原TCA途徑酶或者蛋白質(zhì)的核酸，也可以進(jìn)行相同的工程設(shè)計(jì)。因此，將一種或者多種編碼核酸引入本發(fā)明的微生物使得修飾的生物包含完整的還原TCA途徑，這將獲得合成氣利用能力。
[0096]因此，考慮到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，可以生產(chǎn)一種非天然存在的微生物，該微生物當(dāng)在碳源(如碳水化合物)上培養(yǎng)時(shí)分泌本發(fā)明的生物合成的化合物。這類化合物包括，例如，丁二烯以及在丁二烯途徑中的任何中間體代謝產(chǎn)物。所有需要的是在一種或多種所需的酶或蛋白質(zhì)活性中進(jìn)行設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)所需化合物或中間體(包括，例如部分或全部所述丁二烯生物合成途徑的包涵物)的生物合成。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，所述微生物當(dāng)培育在碳水化合物或其他碳源上時(shí)生產(chǎn)和/或分泌丁二烯以及當(dāng)培育在碳水化合物或其他碳源上時(shí)分泌丁二烯途徑中所示的任何中間體代謝產(chǎn)物。本發(fā)明的所述生產(chǎn)丁二烯的微生物可以啟動(dòng)始自中間體(例如，乙酰乙酰基-CoA、3-羥基丁?；?CoA、巴豆?；?CoA、巴豆醛、巴豆醇、2- 丁烯基-磷酸、2- 丁烯基-4- 二磷酸、赤蘚醇-4-磷酸、4-(胞啶5’ - 二磷酸)_赤蘚醇、2-磷酸-4-(胞啶5’ - 二磷酸)-赤蘚醇、赤蘚醇_2，4-環(huán)二磷酸、1-羥基-2- 丁烯基4- 二磷酸、丁烯基4- 二磷酸、2-丁稀基4_ 二憐酸、3_氧代戍二酸基-CoA、3_羥基戍二酸基-CoA、3_羥基-5-氧代戍酸、3，5-二羥基戊酸、3-羥基-5-磷酰氧基戊酸、3-羥基-5-[羥基(膦酰氧基)磷?；鵠氧基戊酸、巴豆酸、赤蘚糖、赤蘚醇、3，5- 二氧代戊酸或者5-羥基-3-氧代戊酸)的合成。
[0097]利用本領(lǐng)域熟知的方法如本文所示范構(gòu)建本發(fā)明所述的非天然存在的微生物，以以足夠的量外源性表達(dá)編碼丁二烯途徑酶的至少一種核酸，以生產(chǎn)丁二烯。理解的是，在足以生產(chǎn)丁二烯的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的所述微生物。遵循本文提供的教誨和指導(dǎo)，本發(fā)明所述的非天然存在的微生物可以實(shí)現(xiàn)丁二烯的生物合成，產(chǎn)生在約0.001-2000mM或更多之間的細(xì)胞內(nèi)濃度。一般地，丁二烯的細(xì)胞內(nèi)濃度在約3-1500mM或更多之間，特別地在約
5-1250mM或更多之間以及更特別地在約8-1000mM之間，包括約10mM、100mM、200mM、500mM、800mM或更多。也可以從本發(fā)明的所述非天然存在的微生物獲得這些示例性范圍的每個(gè)之間和以上的細(xì)胞內(nèi)濃度。
[0098]在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)條件包括厭氧或基本上厭氧培育或維持條件。示例性的厭氧條件已有先前描述并為本領(lǐng)域所熟知。用于發(fā)酵過程的示例性的厭氧條件的描述見于本文以及，例如2007年8月10日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S2009/0047719。任何這些條件可以與所述非天然存在的微生物以及本領(lǐng)域熟知的其他厭氧條件一起使用。在這種厭氧或基本上厭氧的條件下，丁二烯生產(chǎn)者可以合成細(xì)胞內(nèi)濃度為5-10mM或更多以及本文示例性的所有其他濃度的丁二烯。理解的是，雖然上文的描述指細(xì)胞內(nèi)濃度，生產(chǎn)丁二烯的微生物可以在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)丁二烯和/或分泌產(chǎn)物到培養(yǎng)基內(nèi)。
[0099]在一些實(shí)施方式中，可以選擇碳原料和其他細(xì)胞攝取源，例如磷酸鹽、氨、硫酸鹽、氯化物和其他鹵素來改變丁二烯或任何丁二烯途徑中間體中存在的原子的同位素分布。上面列舉的各種碳原料和其他攝取源在本文中將被統(tǒng)稱為“攝取源”。攝取源可以為產(chǎn)品丁二烯或丁二烯途徑中間體(包括在任何點(diǎn)從該途徑`岔開時(shí)生成的任何丁二烯雜質(zhì))中存在的任何原子提供同位素富集?？梢葬槍?duì)任何靶原子(包括，例如碳、氫、氧、氮、硫、磷、氯化物或其他鹵素)實(shí)現(xiàn)同位素富集。
[0100]在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變碳-12、碳-13和碳-14的比率。在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變氧-16、氧-17和氧-18的比率。在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變氫、氘和氚的比率。在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變氮-14和氮-15的比率。在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變硫-32、硫-33、硫-34和硫-35的比率。在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變磷-31、磷-32和磷-33的比率。在一些實(shí)施方式中，可以選擇攝取源以改變氯-35、氯-36和氯-37的比率。
[0101]在一些實(shí)施方式中，可以通過攝取源的合成化學(xué)富集獲得該攝取源的靶同位素比率。這種同位素富集的攝取源可以從市場(chǎng)上購得或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制備得到。在一些實(shí)施方式中，通過選擇攝取源在自然界中的來源可以獲得該攝取源的靶同位素比率。在一些這樣的實(shí)施方式中，例如，碳源可以選自衍生自化石燃料的碳源(其碳-14可能相對(duì)貧化)；或環(huán)境碳源，如CO2 (其與其衍生自石油的對(duì)應(yīng)物相比，可能具有更大量的碳-14)。
[0102]不穩(wěn)定的碳同位素碳-14或放射性碳組成地球大氣層中碳原子的大約1/1012。碳-14的半衰期約為5700年。儲(chǔ)備在上層大氣中通過涉及宇宙射線和普通氮(14N)的核反應(yīng)得以補(bǔ)充。化石燃料中不含碳-14，因?yàn)槠涓癄€發(fā)生在很久以前。燃燒化石燃料可降低大氣中的碳-14組分(“休斯效應(yīng)”)。事實(shí)上，自核彈試驗(yàn)開始向大氣中注入碳-14起，在樹木年輪上測(cè)得，大氣中的碳-14從約1850年到1954年下降了 2%至2.5%。
[0103]美國開發(fā)了ASTM D6866作為用于使用放射性碳測(cè)年法測(cè)定固體、液體和氣體樣品的生物基含量的標(biāo)準(zhǔn)化分析方法。具體來說，ASTM D6866是應(yīng)美國農(nóng)業(yè)部的要求開發(fā)的，以滿足要求立法的聯(lián)邦機(jī)構(gòu)，根據(jù)制造商產(chǎn)品中的最大生物量對(duì)制造商優(yōu)先采購(根據(jù)2002 年的Farm Security and Rural Investment Act)。很快便證實(shí),放射性碳測(cè)年法是用于產(chǎn)品生物基含量測(cè)定的唯一可行且準(zhǔn)確的技術(shù)。工業(yè)用的放射性碳測(cè)年法的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)完成于 2004年，且目前被美國聯(lián)邦法律(7CFR2902)引用。ASTM D6866首次公開于2004年。從那時(shí)起，已經(jīng)發(fā)布有好幾個(gè)版本。該標(biāo)準(zhǔn)的當(dāng)前有效版本是2011年4月I日起生效的ASTM D6866-11。
[0104]利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜(SIRMS)和點(diǎn)特異性天然同位素分餾核磁共振(SNIF-NMR)，通過質(zhì)譜法很容易對(duì)同位素富集進(jìn)行評(píng)估。這種質(zhì)譜技術(shù)可以結(jié)合分離技術(shù)，如液相色譜(LC)和/或高效液相色譜法(HPLC)。
[0105]通過加速器質(zhì)譜(AMS)測(cè)得的碳-14 (14C)與碳-12 (12C)的比率估算單體的生物基含量(即，F(xiàn)m或現(xiàn)代組分(modern fraction))。具體而言，該現(xiàn)代組分(Fm)根據(jù)如下表達(dá)式計(jì)算:Fm=(S-B)/(M-B)，其中B、S和M分別代表空白對(duì)照、樣品和現(xiàn)代參考物的 14C/12C比率?，F(xiàn)代組分是樣品相對(duì)于“現(xiàn)代”的14C/12C比率偏差的量度?，F(xiàn)代被定義為被歸一化為6 13CVPDB=-19%。的，NBS草酸I (即SRM4990b)的放射性碳濃度(公元1950年)的 95%。Olsson, The use of Oxalic acid as a Standard。見 Radiocarbon Variations and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John ffiley&Sons, New York(1970)o 使用國際上通用的關(guān)于被歸一化為S13CVPDB=-19%。的NBS草酸I (SRM4990b)的比活度的 0.95倍的定義算得AMS結(jié)果。這相當(dāng)于1.176±0.010X 10_12的絕對(duì)(公元1950年)14C/12C 比率。Karlen 等人，Arkiv Geofysik, 4:465-471 (1968)。
[0106]草酸標(biāo)準(zhǔn)物(SRM4990b或者HOxl)從1955年的甜菜作物中制得。雖然當(dāng)時(shí)制有 1000磅,但是這種草酸標(biāo)準(zhǔn)物已經(jīng)不能從市場(chǎng)上購得了。當(dāng)SRM4990b的存量開始減少時(shí)， 制備了另一種標(biāo)準(zhǔn)物草酸II。草酸II標(biāo)準(zhǔn)物(H0x2 ；N.1.S.T名稱為SRM4990C)從1977年法國的甜菜糖蜜作物中制得。在20世紀(jì)80年代初，一組12個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量了這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的比率。草酸II與I的活性比率為1.293±0.001 (加權(quán)平均)。Mann, Radiocarbon, 25(2): 519-527(1983)。HOx II 的同位素比率是-17.8%。。ASTM D6866-11 建議將 SRM4990C 用作現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)物。Fm=0%表示材料中完全沒有碳-14原子，從而表明是化石(例如石油基)碳源。 Fm=100% (針對(duì)1950年后炸彈向大氣中注入碳_14的現(xiàn)象校正之后)同樣表明是完全現(xiàn)代的碳源。
[0107]如ASTM D6866中 所述，現(xiàn)代碳百分?jǐn)?shù)(pMC)可能大于100%，這是由于20世紀(jì)50 年代核試驗(yàn)方案的持續(xù)但遞減的效果，這導(dǎo)致如ASTMD6866-11中所述的，大氣中有相當(dāng)大量的碳-14富集。因?yàn)樗袠悠诽?14活性參考“炸彈前”(pre-bomb)標(biāo)準(zhǔn)，而因?yàn)閹缀跛行碌纳锘a(chǎn)品在后炸彈環(huán)境(post-bomb environment)中生產(chǎn),所以所有的pMC值 (同位素組分校正后)必須乘以0.95 (自2010年起)，以更好地反映樣品真實(shí)的生物基含量。 大于103%的生物基含量表明，要么發(fā)生了分析錯(cuò)誤，要么生物基碳的來源有些年頭。
[0108]ASTM D6866相對(duì)材料的總有機(jī)物含量對(duì)生物基含量進(jìn)行量化，并不考慮存在的無機(jī)碳及其他非含碳物質(zhì)。下面通過一些示例性的配方及其相應(yīng)的ASTM D6866結(jié)果進(jìn)行說明:
[0109]產(chǎn)品1-具有50%淀粉基材料和50%水的液體。生物基含量=100% (產(chǎn)品1具有 50%有機(jī)物含量以及該組分的100%是生物基的)；
[0110]產(chǎn)品2 -具有50%淀粉基材料、25%石油基材料、25%水的液體。生物基含量=66.7% (產(chǎn)品2具有75%有機(jī)物含量，但該組分中只有50%是生物基的)；
[0111]產(chǎn)品3 - 50%是玻璃以及50%是來自石油的聚乙烯的固體。生物基含量=0%(產(chǎn)品 3具有50%但來自化石源的有機(jī)碳；玻璃是不含碳的)；
[0112]產(chǎn)品4-50%是玻璃以及50%是來自生物質(zhì)的聚乙烯的固體。生物基含量=100% (產(chǎn)品4具有50%有機(jī)碳以及其100%是可再生的)；以及
[0113]產(chǎn)品5 -具有50%大豆基材料、30%石油基材料、10%水和10%無機(jī)物質(zhì)的液體。 生物基含量=62.5% (產(chǎn)品5具有80%有機(jī)碳，但其中只有50%是可再生的)。
[0114]碳-14測(cè)年技術(shù)在量化可再生材料生物基含量方面的應(yīng)用為本領(lǐng)域已知。Currie 等人，Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172:281-287 (2000)。 例如，碳-14測(cè)年法已被用來量化含對(duì)苯二甲酸鹽的材料的生物基含量。Colonna等人，Green Chemistry, 13:2543-2548 (2011)。值得注意的是，衍生自可再生的1，3-丙二醇的聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(PPT)聚合物和衍生自石油的對(duì)苯二甲酸產(chǎn)生了接近30%的Fm 值(即，由于3/11的聚合物碳衍生自可再生的1，3-丙二醇以及8/11衍生自化石端元(end member)對(duì)苯二甲酸)。Currie等人，同上文。與此相反,衍生自可再生的1，4-丁二醇和可再生的對(duì)苯二甲酸的聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯聚合物產(chǎn)生了超過90%的生物基含量。Colonna 等人，同上文。
[0115]因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有反映大氣中碳攝取源的碳-12、 碳-13和碳-14的比率的丁二烯或丁二烯中間體。例如，在一些方面，丁二烯或丁二烯中間體可以具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少98%或高達(dá)100%的Fm值。在一些這類實(shí)施方式中，該攝取源是C02。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有反映石油基碳攝取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的丁二烯或丁二烯中間體。在這方面，丁二烯或丁二烯中間體可以具有小于10%、小于5%、小于2%或小于 1%的Fm值。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有碳-12、碳-13和碳-14的比率的丁二烯或丁二烯中間體，所述比率通過將大氣中的碳攝取源與石油基攝取源相結(jié)合而獲得。攝取源的這種組合是碳-12、碳-13和碳-14的比率可以變化的一種手段。
[0116]除本文披露的培養(yǎng)和發(fā)酵條件之外，用于實(shí)現(xiàn)丁二烯的生物合成的培育條件可以包括將滲透保護(hù)劑添加到培養(yǎng)條件中。在某些實(shí)施方式中，可以在滲透保護(hù)劑的存在下如本文所述維持、培養(yǎng)或者發(fā)酵本發(fā)明所述的非天然存在的微生物。簡(jiǎn)言之，滲透保護(hù)劑指作為滲透物起作用以及幫助如本文所述的微生物經(jīng)受得住滲透應(yīng)力的化合物。滲透保護(hù)劑包括但不僅限于甜菜堿、氨基酸以及海藻糖。這類滲透保護(hù)劑的非限制性的實(shí)施例是甘油酸甜菜堿、果仁糖甜菜堿、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸(dimethylsulfoniopropionate)、 3-二甲基锍基-2-甲基丙酸、哌可酸、二甲基锍基乙酸、膽堿、L-肉毒堿和四氫嘧啶。在一個(gè)方面，該滲透保護(hù)劑是甘油酸甜菜堿。本領(lǐng)域的任一普通技術(shù)人員理解的是，適于保護(hù)本文所述的微生物不受滲透應(yīng)力影響的滲透保護(hù)劑的量和類型將取決于所用的微生物。在培養(yǎng)條件下的滲透保護(hù)劑的量可以是例如，不多于約0.1mM、不多于約0.5mM、不多于約1.0mM、不多于約1.5mM、不多于約2.0mM、不多于約2.5mM、不多于約3.0mM、不多于約5.0mM、不多于約7.0mM、不多于約10mM、不多于約50mM、不多于約IOOmM或者不多于約500mM。
[0117]培養(yǎng)條件可以包括，例如液體培養(yǎng)程序以及發(fā)酵和其他大規(guī)模培養(yǎng)程序。如本文所描述，在厭氧或基本上厭氧的培養(yǎng)條件下可以獲得本發(fā)明生物合成產(chǎn)物的特別有用的收率。
[0118]如本文所描述，一種用于實(shí)現(xiàn)丁二烯生物合成的示例性培育條件包括厭氧培養(yǎng)或發(fā)酵條件。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述非天然存在的微生物可以在厭氧或基本上厭氧的條件下維持、培養(yǎng)或發(fā)酵。簡(jiǎn)言之，厭氧條件指缺乏氧的環(huán)境?；旧蠀捬醯臈l件包括，例如培養(yǎng)菌分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵以便培養(yǎng)基中溶解的氧濃度保持在0和10%的飽和度之間?；旧蠀捬醯臈l件還包括在保持在小于1%的氧氣氛中的密封室內(nèi)部的液體培養(yǎng)基中或固體瓊脂上培育或靜置細(xì)胞。可以通過，例如用n2/co2混合物或一種或多種其他合適的非氧氣體噴射培養(yǎng)菌來保持氧的百分比。
[0119]本文所述的培養(yǎng)條件可以按比例擴(kuò)大并連續(xù)增長，以用于生產(chǎn)丁二烯。示例性的培養(yǎng)程序包括，例如補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)分離；或者連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。所有這些過程都為本領(lǐng)域所熟知。發(fā)酵程序?qū)τ诠I(yè)規(guī)模的丁二烯的生物合成生產(chǎn)是特別有用的。一般地以及與非連續(xù)培養(yǎng)程序一樣，丁二烯的連續(xù)和/或接近連續(xù)的生產(chǎn)將包括在足夠的營養(yǎng)物和培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的生產(chǎn)丁二烯的非天然存在的生物， 以維持和/或接近維持指數(shù)期的生長。這種條件下的連續(xù)培養(yǎng)可以包括，例如I天、2天、3 天、4天、5天、6天或7天或更多。此外，連續(xù)培養(yǎng)可以包括I周、2周、3周、4周或5周或更多周乃至數(shù)月。替代性地，如果適于具體的應(yīng)用，本發(fā)明的生物可以培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。理解的是， 連續(xù)和/或接近連續(xù)培養(yǎng)的條件還可以包括這些示例性周期之間的所有的時(shí)間間隔。進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明的所述微生物的培養(yǎng)時(shí)間是足以生產(chǎn)足夠量的用于所需目的的產(chǎn)品的時(shí)間段。
[0120]發(fā)酵程序?yàn)楸绢I(lǐng)域所熟知。簡(jiǎn)言之，可以以，例如補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)分離；或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離的方式利用用于丁二烯的生物合成生產(chǎn)的發(fā)酵。分批和連續(xù)發(fā)酵程序的例子為本領(lǐng)域所熟知。
[0121]除了上文將本發(fā)明的所述丁二烯生產(chǎn)者分別用于丁二烯的連續(xù)的生產(chǎn)的發(fā)酵程序，所述丁二烯生產(chǎn)者還可以，例如同時(shí)經(jīng)受化學(xué)合成程序，以將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其他化合物， 以及產(chǎn)物可以從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離以及后續(xù)經(jīng)受化學(xué)或酶催轉(zhuǎn)化，以將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其他化合物(如有需要)。
[0122]為生成更好的生產(chǎn)者，可以利用代謝建模優(yōu)化培育條件。建模還可被用以設(shè)計(jì)另外優(yōu)化途徑應(yīng)用的基因敲除(參見，例如美國專利公布US2002/0012939、US2003/0224363、 US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654 和 US2004/0009466 ； 以及美國專利號(hào)7，127，379)。建模分析允許對(duì)偏移代謝對(duì)細(xì)胞生長的影響進(jìn)行可靠的預(yù)測(cè)，以便更高效地生產(chǎn)丁二烯。
[0123]一種用于識(shí)別和設(shè)計(jì)支持所需產(chǎn)品的生物合成的代謝改變的計(jì)算方法是 OptKnock 計(jì)算框架(Burgard 等人，Biotechnol.Bioeng.84:647-657 (2003))。OptKnock 是一種代謝建模和模擬程序，該程序提出基因刪除或者中斷策略，其產(chǎn)生從基因方面來說穩(wěn)定的微生物，該微生物超過定額地生產(chǎn)靶產(chǎn)品。具體而言，該框架檢查微生物的完整的代謝和/或生化網(wǎng)絡(luò)，以便提出迫使所需的生化品變?yōu)榧?xì)胞生長的專性副產(chǎn)品的基因操作。通過戰(zhàn)略性放置的基因缺失或其他功能基因中斷把生化生產(chǎn)與細(xì)胞生長耦合起來，在生物反應(yīng)器中長時(shí)間之后，施加至設(shè)計(jì)菌株的生長選擇壓力由于結(jié)合強(qiáng)制性生長的生化生產(chǎn)引起效能改善。最后，當(dāng)基因缺失被構(gòu)建時(shí)，由于OptKnock選擇的基因?qū)幕蚪M完全去除,設(shè)計(jì)菌株回復(fù)到其野生型狀態(tài)的可能性可以忽略不計(jì)。因此，該計(jì)算方法可用以識(shí)別導(dǎo)致所需產(chǎn)品生物合成的替代性途徑或與所述非天然存在的微生物結(jié)合用于所需產(chǎn)品生物合成的進(jìn)一步優(yōu)化。
[0124]簡(jiǎn)言之，術(shù)語OptKnock在本文用以指用于建模細(xì)胞代謝的計(jì)算方法和系統(tǒng)。 OptKnock方案涉及將具體的約束因素引入通量平衡分析(FBA)模型的模型和方法的框架。這些約束因素包括，例如定性動(dòng)力信息、定性調(diào)節(jié)信息和/或DNA微陣列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 OptKnock還通過，例如收緊通過通量平衡模型導(dǎo)出的通量邊界以及隨后在基因添加或刪除的存在下探測(cè)代謝網(wǎng)絡(luò)的效能極限來計(jì)算各種代謝問題的解。OptKnock計(jì)算框架允許使代謝網(wǎng)絡(luò)的效能極限的有效質(zhì)詢可行的模型表述的構(gòu)建以及提供用于解決引起的混合整數(shù)線性規(guī)劃問題的方法。本文稱為OptKnock的代謝建模和模擬方法的描述見于，例如 2002年I月10日提交的美國公布2002/0168654、2002年I月10日提交的國際專利號(hào)PCT/ US02/00660以及2007年8月10日提交的美國公布2009/0047719。
[0125]另一種用于識(shí)別和設(shè)計(jì)支持產(chǎn)品的生物合成生產(chǎn)的代謝改變的計(jì)算方法是一種
代謝建模和模擬系統(tǒng)，稱為SimPheny?。該計(jì)算方法和系統(tǒng)的描述見于，例如2002年6月
14日提交的美國公布2003/0233218以及見于2003年6月13日提交的PCT/US03/18838。
SimPhenyB是一種計(jì)算系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用以產(chǎn)生硅內(nèi)網(wǎng)絡(luò)模型并用以通過生物系統(tǒng)的化
學(xué)反應(yīng)模擬質(zhì)量、能量或`電荷的通量，以限定包含該系統(tǒng)中化學(xué)反應(yīng)的任何以及所有可能的函數(shù)的解空間，從而確定該生物系統(tǒng)一系列的允許活性。這種方法稱為基于約束因素的建模，因?yàn)樵摻饪臻g由約束因素限定，如所包含的反應(yīng)的已知的化學(xué)計(jì)量以及通過反應(yīng)與最大通量關(guān)聯(lián)的反應(yīng)熱動(dòng)力和能力約束因素?？梢栽儐栠@些約束因素限定的空間，以確定該生物系統(tǒng)或其生化部件的顯型能力和行為。
[0126]這些計(jì)算方法與生物現(xiàn)實(shí)一致，因?yàn)樯锵到y(tǒng)具有靈活性并可以許多不同的方式達(dá)到相同的結(jié)果。生物系統(tǒng)已經(jīng)通過由所有生物系統(tǒng)必須面對(duì)的基本的約束因素限制的進(jìn)化機(jī)制加以設(shè)計(jì)。因此，基于約束因素的建模策略包括這些一般現(xiàn)實(shí)。進(jìn)一步地，通過約束因素收緊向網(wǎng)絡(luò)模型連續(xù)施加進(jìn)一步的限制的能力導(dǎo)致解空間的尺寸變小，從而提升生理效能或顯型可預(yù)測(cè)的精確性。
[0127]考慮到本文提供的教誨和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠應(yīng)用各種用于代謝模型和模擬的計(jì)算框架，以在宿主微生物中設(shè)計(jì)和實(shí)施所需化合物的生物合成。這種代謝建模
和模擬方法包括，例如上文示范為SimPhenyK和OptKnock的計(jì)算系統(tǒng)。為了說明本發(fā)明，
本文描述一些關(guān)于用于建模和模擬的OptKnock計(jì)算框架的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)了解如何利用OptKnock將代謝改變的識(shí)別、設(shè)計(jì)和實(shí)施應(yīng)用于為本領(lǐng)域所熟知的任何這類其他代謝模型和模擬計(jì)算框架和方法。
[0128]上文描述的方法將提供待中斷的一組代謝反應(yīng)。該組或代謝修飾內(nèi)每個(gè)反應(yīng)的消除可以在生物的培育期期間產(chǎn)生作為專性產(chǎn)品的所需產(chǎn)品。由于反應(yīng)已知，雙層OptKnock 問題的解也將提供編碼一種或多種催化該組反應(yīng)內(nèi)每個(gè)反應(yīng)的酶的有關(guān)基因。一組反應(yīng)及其相應(yīng)的編碼參與每個(gè)反應(yīng)的酶的基因的識(shí)別通常是自動(dòng)化過程，通過將反應(yīng)與具有酶和編碼基因之間的關(guān)系的反應(yīng)數(shù)據(jù)庫相關(guān)聯(lián)得以完成。
[0129]一旦確定，通過至少一個(gè)編碼該組反應(yīng)內(nèi)每個(gè)代謝反應(yīng)的基因的功能中斷在靶細(xì)胞或生物內(nèi)實(shí)施該組反應(yīng)，該組反應(yīng)待中斷以便實(shí)現(xiàn)所需產(chǎn)品的生產(chǎn)。一種實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)組的功能中斷的特別有用的手段是通過刪除每個(gè)編碼基因。然而，在某些情況下，通過其他的遺傳畸變(包括，例如調(diào)節(jié)區(qū)域如啟動(dòng)子或針對(duì)調(diào)節(jié)因子的順式結(jié)合位點(diǎn)的突變、刪除或者通過大量位置的任意處編碼序列的截?cái)?中斷該反應(yīng)可能是有利的。這些導(dǎo)致基因組不完全刪除的后者畸變可能是有用的，例如，當(dāng)需要產(chǎn)物耦合的快速評(píng)估或當(dāng)不太可能發(fā)生遺傳回復(fù)變異時(shí)。
[0130]為識(shí)別上文描述的導(dǎo)致進(jìn)一步的中斷反應(yīng)組或可以導(dǎo)致生物合成(包括所需產(chǎn)品的生長耦合的生物合成)的代謝修飾的雙層OptKnock問題的其他的富有成效的解，可以實(shí)施一種優(yōu)化方法，稱為整數(shù)切割。該方法通過在每次迭代時(shí)納入被稱為整數(shù)切割的另一約束因素迭代地解決上文示例性的OptKnock問題而進(jìn)行下去。整數(shù)切割約束因素有效地阻止解程序選擇在任何先前的強(qiáng)制耦合產(chǎn)品生物合成至生長的迭代中確定的恰好相同的反應(yīng)組。例如，如果先前確定的耦合生長的代謝修飾指定反應(yīng)1、2和3進(jìn)行中斷，則接下來的約束因素阻止相同的反應(yīng)被同時(shí)考慮在后續(xù)解中。該整數(shù)切割方法為本領(lǐng)域所熟知以及可以發(fā)現(xiàn)其被描述于，例如Burgard等人,Biotechnol.Prog.17:791-797 (2001)。與本文關(guān)于其結(jié)合用于代謝模型和模擬的OptKnock計(jì)算框架的用途所述的所有方法一樣，減少迭代計(jì)算分析中的冗余的整數(shù)切割方法還可以與本領(lǐng)域所熟知的其他計(jì)算框架(包括，例如 SimPheny?) 一起應(yīng)用。
[0131]本文示例性的方法允許生物合成地生產(chǎn)所需產(chǎn)品的細(xì)胞和生物的構(gòu)建，包括靶生化產(chǎn)品的生產(chǎn)與被設(shè)計(jì)包括所識(shí)別的基因改變的細(xì)胞或生物生長的強(qiáng)制耦合。因此，本文所述的計(jì)算方法允許通過選自O(shè)ptKnock或SmPheny?的硅內(nèi)方法識(shí)別的代謝修飾的識(shí)別和實(shí)施。代謝修飾組可包括，例如一種或多種生物合成途徑酶的添加和/或一種或多種代謝反應(yīng)的功能中斷(包括，例如通過基因刪除中斷)。
[0132]如上文所討論，該OptKnock方法的開發(fā)前提是當(dāng)遭受長期的生長選擇時(shí)突變微生物網(wǎng)絡(luò)可以朝向其計(jì)算地預(yù)測(cè)最大生長顯型進(jìn)化。換言之，該方法利用生物在選擇壓力下的自優(yōu)化能力。該OptKnock框架允許有基于網(wǎng)絡(luò)化學(xué)計(jì)量強(qiáng)迫形成生化生產(chǎn)和細(xì)胞生長之間的稱合的基因刪除組合的窮盡枚舉(exhaustive enumeration)。最佳基因/反應(yīng)敲除的確認(rèn)需要雙層優(yōu)化問題的解，所述解選擇活性反應(yīng)組以 便所得網(wǎng)絡(luò)的最佳生長解超過定額地生產(chǎn)相關(guān)生化品(Burgard 等人，Biotechnol.Bioeng.84:647-657 (2003))。
[0133]大腸桿菌代謝的硅內(nèi)化學(xué)計(jì)量模型可用以識(shí)別代謝途徑必需的基因，如先前示范以及描述，見于，例如美國專利公布 US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、 US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654 和 US2004/0009466 以及見于美國專利號(hào)7，127，379。如本文所披露，OptKnock數(shù)學(xué)框架可用以精確地定位基因刪除，導(dǎo)致所需產(chǎn)品的耦合生長的生產(chǎn)。進(jìn)一步地，雙層OptKnock問題的解僅提供一組刪除。要枚舉所有有意義的解，即導(dǎo)致耦合生長的生產(chǎn)的形成的所有敲除組，可以實(shí)施優(yōu)化技術(shù)，稱為整數(shù)切割。這必伴有通過在每次迭代時(shí)納入被稱為整數(shù)切割的另一約束因素迭代地解決該 OptKnock問題,如上文所討論。
[0134]如本文所披露，可將編碼丁二烯途徑的所需活性的核酸引入宿主生物。在某些情況下，修飾丁二烯途徑酶或者蛋白質(zhì)的活性以提高丁二烯的生產(chǎn)，這會(huì)是可取的。例如，可將增加蛋白質(zhì)或者酶的活性的已知突變引入編碼核酸分子。另外，可以采用優(yōu)化方法來提高酶或者蛋白質(zhì)的活性和/或降低抑制活性，例如，降低負(fù)調(diào)節(jié)因子的活性。
[0135]一種這類的優(yōu)化方法是定向進(jìn)化。定向進(jìn)化是一種涉及引入靶向特異性基因的突變以改善和/或改變酶的特性的強(qiáng)有力的方法。可以通過開發(fā)和實(shí)施允許許多酶變體 (如>104)的自動(dòng)篩選的敏感性高通量篩選測(cè)定確定改善和/或改變的酶。通常進(jìn)行迭代輪的誘變和篩選，以使酶具有優(yōu)化的特性。可有助于識(shí)別進(jìn)行誘變的基因區(qū)域的計(jì)算算法也已經(jīng)被開發(fā)并可以顯著地減少需要生成和篩選的酶變體的數(shù)目。已經(jīng)開發(fā)了大量的定向進(jìn)化技術(shù)(參閱 Hibbert 等人,Biomol.Eng22:11-19 (2005) ；Huisman 和 Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs.717—742
(2007), Patel (ed.), CRC Press ；0tten 和 Quax.Biomol.Eng22:1-9 (2005) ?;以及 Sen 等人，Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007))以有效地創(chuàng)建多樣化變體庫并且這些方法已被成功地應(yīng)用于許多酶等級(jí)范圍內(nèi)各種特性的改善。通過定向進(jìn)化技術(shù)改善和/或改變的酶特性包括，例如選擇性/特異性-針對(duì)非自然底物的轉(zhuǎn)化；溫度穩(wěn)定性-針對(duì)魯棒高溫處理；pH值穩(wěn)定性-針對(duì)較低或較高pH值條件下的生物工藝；底物或產(chǎn)物容忍性 (tolerence)-以便可以實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)物滴度；結(jié)合性(Km)-擴(kuò)大底物結(jié)合以包括非自然底物； 抑制性(Ki)-以通過產(chǎn)物、底物或關(guān)鍵的中間體去除抑制；活性(k。J-提高酶催反應(yīng)速率，以獲得所需通量；表達(dá)水平-增加蛋白質(zhì)收率和整個(gè)途徑通量；氧穩(wěn)定性-針對(duì)在有氧條件下空氣敏感性酶的操作；以及厭氧活性-針對(duì)缺氧條件下需氧酶的操作。
[0136]下文對(duì)示例性的方法進(jìn)行更詳細(xì)的描述，所述示例性的方法已經(jīng)被開發(fā)用于基因的誘變和多樣化以靶向特異性酶的所需特性。這類方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。任何這些方法可用以改變和/或優(yōu)化丁二烯途徑酶或者蛋白質(zhì)的活性。
[0137]EpPCR(Pritchard等人，J Theor.Biol.234:497-509 (2005))通過添加Mn2+離子降低PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的保真度、通過加偏壓于dNTP濃度或通過其他條件性的改變引入隨機(jī)點(diǎn)突變。將誘變局限于相關(guān)靶基因的五步驟克隆過程涉及:1)相關(guān)基因的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增；2)限制酶切；3)所需DNA片段的凝膠純化；4)連接入載體；5)基因變體至合適的宿主的轉(zhuǎn)化以及為改善效能進(jìn)行的庫篩選。該方法可以同時(shí)在單個(gè)基因中產(chǎn)生多個(gè)突變，所述突變可用于篩選更大量的具有所需活性的潛在變體。通過EpPCR可以生成大量的突變體， 因此高通量篩選測(cè)定或選擇方法(例如，利用機(jī)器人)對(duì)于識(shí)別那些 具有所需特性的突變體是有用的。
[0138]易錯(cuò)滾環(huán)擴(kuò)增(epRCA)(Fujii 等人，Nucleic Acids Res.32: el45 (2004);以及 Fujii等人，Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))具有許多與印PCR相同的要素，除了整個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒被用作模板以及在最后2個(gè)核苷酸上具有核酸外切酶抗性硫代磷酸酯鍵的隨機(jī) 6-引物被用以擴(kuò)增該質(zhì)粒，接著轉(zhuǎn)化至細(xì)胞，在那里該質(zhì)粒以串聯(lián)反復(fù)被再環(huán)化。調(diào)整Mn2+ 濃度可以稍微改變突變率。該技術(shù)利用一種簡(jiǎn)易的易錯(cuò)、單步驟方法以3-4突變/kbp創(chuàng)建質(zhì)粒的完整副本。無需限制酶消化或特異性引物。此外，該方法通常以可購得的試劑盒的形式被利用。
[0139]DNA 或家族改組(Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA91:10747-10751 (1994));以及Stemmer, Nature370:389-391 (1994))通常涉及以核酸酶(如脫氧核糖核酸酶I或核酸內(nèi)切酶V)消化兩種或兩種以上的變體基因，以生成隨機(jī)片段池，所述隨機(jī)片段在DNA聚合酶的存在下通過退火和擴(kuò)展循環(huán)進(jìn)行重裝，以創(chuàng)建嵌合基因庫。片段相互作為引物以及當(dāng)一個(gè)副本作為另一副本的引物(模板切換)時(shí)發(fā)生重組。該方法可以與>lkbp的DNA序列一起使用。除了片段重裝(fragment reassembly)創(chuàng)建的突變重組,該方法以與易錯(cuò)PCR類似的速率在擴(kuò)展步驟引入點(diǎn)突變。該方法可用以去除有害的、隨機(jī)的以及中性的突變。
[0140]交錯(cuò)延伸(StEP)(Zhao 等人，Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))必伴有模板引物，接著是以變性和持續(xù)非常短(短似5秒)的退火/延伸進(jìn)行的2步PCR的重復(fù)循環(huán)。成長的片段退火至不同的模板并進(jìn)一步延伸，這被重復(fù)直至形成完整長度的序列。模板切換意味著多數(shù)所得的片段具有多個(gè)親本。低保真度聚合酶(Taq和Mutazyme)的組合由于相反的突變譜減少易錯(cuò)偏差。
[0141]在隨機(jī)引物重組(RPR)中，隨機(jī)序列引物被用以生成許多與不同的模板段互補(bǔ)的短 DNA 片段(Shao 等人，Nucleic Acids Res26:681-683 (1998))。通過印PCR 的堿的錯(cuò)誤摻入和錯(cuò)引物(mispriming)帶來點(diǎn)突變?；谕葱?，短的DNA片段相互作為引物以及通過重復(fù)熱循環(huán)被重組并重裝成完整長度。該步驟之前的模板去除保證了低親本重組。與多數(shù)其他方法類似，該方法進(jìn)行多重迭代，以逐步得到不同的特性。該技術(shù)避免了序列偏差， 不依賴于基因長度并且施用需要親本DNA少之又少。
[0142]在異源雙鏈重組中，線性質(zhì)粒DNA被用以形成通過錯(cuò)配修復(fù)得以修復(fù)的異源雙鏈(Volkov 等人,Nucleic Acids Res.27: el8 (1999)；以及 Volkov 等人,Methods Enzymo1.328:456-463 (2000))。錯(cuò)配修復(fù)步驟至少是有點(diǎn)誘變的。異源雙鏈的轉(zhuǎn)化比線性同源雙鏈較為高效。這種方法適于大基因和整體操縱子。
[0143]臨時(shí)模板隨機(jī)嵌合生長(RACHITT) (Coco等人，Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))采用單鏈DNA的脫氧核糖核酸酶I斷裂和大小分級(jí)。在缺少聚合酶的條件下將同源片段雜交至互補(bǔ)單鏈DNA支架。通過外核酸酶修整任何重疊的未雜交片段端。填充片段之間的空隙，然后連接以提供完整長度的多樣化鏈池，所述鏈雜交至包含U以阻止擴(kuò)增的支架。然后破壞所述支架并通過PCR擴(kuò)增取代以與所述多樣化鏈互補(bǔ)的新鏈。該方法涉及僅來自一個(gè)親本的一個(gè)鏈(支架)而引物片段則來自其他基因，以及相對(duì)選擇親本支架 。因此，不會(huì)有親本片段的重退火發(fā)生。用核酸外切酶修整重疊的片段。 在其他方面，這類似于DNA改組和StEP。因此，應(yīng)該沒有親子(sibling)、幾乎沒有滅活物以及沒有未改組的親本。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于幾乎沒有或沒有親本基因產(chǎn)生以及相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的DNA改組可以產(chǎn)生許多更多的交叉(crossover)。
[0144]截短狀模板重組延伸(RETT)必伴有在單向單鏈DNA片段作為模板池的存在下自引物單向生長的鏈的模板切換(Lee等人，J.Molec.Catalysis26:119-129 (2003))。不使用 DNA核酸內(nèi)切酶。通過帶有隨機(jī)引物的DNA聚合酶或利用核酸外切酶的連續(xù)刪除(serial deletion)生成單向單鏈DNA。單向單鏈DNA僅僅是模板而非引物。隨機(jī)引物和核酸外切酶不引入如同DNA改組/RACHITT的酶催斷裂的序列偏差。RETT的優(yōu)化可以比StEP更容易，因?yàn)槠淅谜５腜CR條件而非非常短的擴(kuò)展。重組作為PCR步驟的部分發(fā)生，即無直接改組。這種方法由于無停頓也可以比StEP更隨機(jī)。
[0145]在簡(jiǎn)并寡核苷酸基因改組(DOGS)中，簡(jiǎn)并引物被用以控制分子之間的重組； (Bergquist 和 Gibbs, Methods Mol.Biol352:191-204 (2007);Bergquist 等人,Biomol.Eng22:63-72 (2005) ; Gibbs 等人，Gene271:13-20 (2001))這可用以控制其他方法(如 DNA 改組)再簡(jiǎn)并親本基因的趨勢(shì)。這種方法可以結(jié)合選擇基因區(qū)段的隨機(jī)誘變(epPCR)。這會(huì)是一個(gè)良好的阻礙親本序列再形成的方法。不需要核酸內(nèi)切酶。通過調(diào)整所得區(qū)段的輸入濃度，可以偏向所需的骨架。這種方法允許自不相關(guān)親本的DNA改組，而無限制酶消化并允許選擇隨機(jī)誘變方法。
[0146]漸進(jìn)式切割產(chǎn)生雜合酶(ITCHY)創(chuàng)建帶有相關(guān)基因或基因片段的I堿基對(duì)刪除的組合庫(Ostermeier 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:3562-3567 (1999)；以及 Ostermeier 等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209 (1999))。以相反的方向?qū)⑶懈钗镆胫?2個(gè)不同的基因片上。將這些連接在一起并克隆融合。該技術(shù)不需要2個(gè)親本基因之間的同源性。當(dāng)ITCHY結(jié)合DNA改組時(shí)，該系統(tǒng)被稱為SCRATCHY (見下文)。兩者主要的優(yōu)勢(shì)是無需親本基因之間的同源性；例如，通過ITCHY創(chuàng)建大腸桿菌和人基因之間的功能融合。當(dāng) ITCHY文庫形成，捕捉所有可能的交換。
[0147]除了硫代磷酸dNTP被 用以產(chǎn)生切割物，硫代漸進(jìn)式切割產(chǎn)生雜合酶 (TH10-1TCHY)與 ITCHY相似(Lutz 等人，Nucleic Acids Res29:E16 (2001))。相比于 ITCHY， TH10-1TCHY可以更易優(yōu)化、提供更多的再現(xiàn)性和可調(diào)性。
[0148]SCRATCHY結(jié)合兩種用于重組基因的方法ITCHY和DNA改組(Lutz等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:11248-11253 (2001))。SCRATCHY 兼具 ITCHY 和 DNA 改組的最好特性。首先，ITCHY被用來以不依賴DNA同源性的方式創(chuàng)建一套全面的基因片段之間的融合。 然后，對(duì)該人造的家族執(zhí)行DNA改組步驟，以增加交叉的數(shù)量。計(jì)算預(yù)測(cè)法可以在優(yōu)化中使用。當(dāng)序列一致性低于80%時(shí)，SCRATCHY比DNA改組更有效。
[0149]在隨機(jī)漂變誘變(RNDM)中，通過epPCR進(jìn)行突變，接著對(duì)保留有用活性的那些進(jìn)行篩選/選擇(Bergquist等人，Biomol.Eng.22:63-72 (2005))。然后，這些被用于D0GS，以產(chǎn)生具有多個(gè)活性突變體之間或活性突變體和其他一些所需的親本之間的融合的重組體。 設(shè)計(jì)以促進(jìn)中性突變的隔離；其目的是對(duì)保留的催化活性進(jìn)行這種活性是高于還是低于原始基因中的活性的篩選。當(dāng)篩選能夠檢測(cè)背景(background)上的活性時(shí)，RNDM在高通量測(cè)定中是有用的。在產(chǎn)生多樣性方面，RNDM已被用作DOGS的前端。該技術(shù)提出改組或其他后續(xù)步驟之前的活性要求；中性漂變文庫被指出相比更小的文庫產(chǎn)生更高/更快的活性改善。雖然公布利用epPCR，這可應(yīng)用于其他大規(guī)模誘變方法。
[0150]序列飽和誘變(SeSaM)是一種隨機(jī)誘變方法，該方法:I)利用硫代磷酸核苷酸的隨機(jī)摻入和斷裂生成隨機(jī)長度片段池；該池被用作模板，以2)在“通用”堿(如肌苷) 的存在下延伸；3)包含肌苷的補(bǔ)體的復(fù)制提供隨機(jī)堿摻入以及因此提供誘變(Wong等人，Biotechnol.J.3:74-82(2008) ;Wong 等人，Nucleic Acids Res.32: e26 (2004);以及 Wong等人，Anal.Biochem.341:187-189 (2005))。利用這種技術(shù),采用簡(jiǎn)易的方法在2天到 3天內(nèi)產(chǎn)生突變體的大型文庫是可能的。較之于DNA聚合酶的突變偏向，這是不定向的。這種方法的差異使得該技術(shù)是epPCR的補(bǔ)充(或者替代性選擇)。[0151]在合成改組中，重疊的寡核苷酸被設(shè)計(jì)以編碼“靶中所有的遺傳多樣性”并允許改組的后代有非常高的多樣性(Ness,等人，Nat.Biotechnol.20:1251-1255 (2002))。在這種技術(shù)中，可以將片段設(shè)計(jì)為被改組。這有助于提高后代所得的多樣性?？梢栽O(shè)計(jì)序列/ 密碼子偏差，以使得更遠(yuǎn)緣的相關(guān)序列以與更密切相關(guān)的序列所遵循的速率接近的速率重組。另外，該技術(shù)不需要物質(zhì)上占有模板基因。
[0152]核苷酸交換和切除技術(shù)(NexT)利用dUTP摻入組合，繼之以用尿嘧啶DNA 糖基化酶然后哌唳進(jìn)行處理，以執(zhí)行端點(diǎn)DNA斷裂(Muller等人，Nucleic Acids Res.33:ell7(2005))o利用內(nèi)部PCR引物擴(kuò)展以校正聚合酶重裝基因。利用變化的 dUPT::dTTP比率，改組的大小是直接可控的。這種是一種利用尿嘧啶摻入和斷裂的簡(jiǎn)易方法的端點(diǎn)反應(yīng)。對(duì)于這種方法，可以使用其他的核苷酸類似物，如8-氧代-鳥嘌呤。此外， 該技術(shù)對(duì)于非常短的片段(86bp)效果良好并具有低的出錯(cuò)率。該項(xiàng)技術(shù)中所用的DNA的化學(xué)斷裂導(dǎo)致幾乎沒有未改組的克隆。
[0153]在不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組(SHIPREC)中，接頭被用以促進(jìn)兩個(gè)遠(yuǎn)緣/不相關(guān)的基因之間的融合。核酸酶處理被用以在這兩個(gè)基因之間產(chǎn)生一系列嵌合體。這些融合產(chǎn)生單交叉文庫(Sieber等人.Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))。這產(chǎn)生有限類型的改組以及誘變需要一個(gè)單獨(dú)的過程。此外，因?yàn)椴恍枰葱裕@項(xiàng)技術(shù)可以用兩個(gè)不相關(guān)的親本基因的每個(gè)的變化分?jǐn)?shù)創(chuàng)建嵌合體文庫。通過細(xì)菌CP450的血紅素結(jié)合區(qū)域融合至哺乳動(dòng)物CP450的N末端區(qū)域?qū)HIPREC進(jìn)行了測(cè)試；這在更具可溶性的酶中產(chǎn)生了哺乳動(dòng)物活性。
[0154]在基因位點(diǎn)飽和誘變? (GSSM?)中，起始材料是在所需的突變位點(diǎn)包含插入和兩個(gè)引物簡(jiǎn)并的超螺旋雙鏈DNA質(zhì)粒(Kretz等人，Methods Enzymol.388:3-11 (2004))。帶有相關(guān)突變的引物為DNA相對(duì)鏈上的相同序列退火。突變通常在引物的中間以及位于每邊上正確序列的大約20個(gè)核苷酸的側(cè)面。引物中的序列是NNN或NNK (編碼)和MNN (未編碼)(N=全部4、K=G，T, M=A, C)。延伸后，Dpn I被用以消化dam-甲基化DNA，以消除野生型模板。這項(xiàng)技術(shù)探索了給定位點(diǎn)(即一個(gè)密碼子)的所有可能的氨基酸替代。該技術(shù)便于產(chǎn)生沒有無意義密碼子的單個(gè)位點(diǎn)上所有可能的取代以及導(dǎo)致最可能的等位基因的相等或近乎相等的表現(xiàn)。該項(xiàng)技術(shù)不需要靶酶的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理或區(qū)域的現(xiàn)有知識(shí)。如果隨后是改組或基因重裝，這項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)建包含所有可能的組合的單位點(diǎn)向上突變的重組體的多樣化文庫。這項(xiàng)技術(shù)組合的實(shí)用性已被證明用于超過50個(gè)不同的酶的成功進(jìn)化以及用于給定酶中一個(gè)以上的特性。
[0155]組合式盒式誘變(CCM)涉及短寡核苷酸盒以大量可能的氨基酸序列改變?nèi)〈邢迏^(qū)域的用途(Reidhaar-Olson 等人，Methods Enzymol.208:564-586 (1991);以及 Reidhaar-Olson等人，Science241:53-57 (1988))。利用這項(xiàng)技術(shù)在兩個(gè)或三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)替 代是可能的。此外，該方法測(cè)試有限范圍的位點(diǎn)上大量可能的序列改變。這項(xiàng)技術(shù)已被用于探索、抑制子DNA結(jié)合區(qū)域的信息內(nèi)容。
[0156]組合式多重盒式誘變(CMCM)在本質(zhì)上與CCM相似，除了其被作為更大方案的部分所采用:1)以高突變速率使用epPCR，以2)確認(rèn)熱點(diǎn)和熱區(qū)域，然后3)通過CMCM延伸，以覆蓋蛋白質(zhì)序列空間的限定區(qū)域(Reetz等人，Angew.Chem.1nt.Ed Engl.40:3589-3591 (2001))。與CCM —樣，這種技術(shù)實(shí)際上可以測(cè)試靶區(qū)域上所有可能的改變。如果與產(chǎn)生隨機(jī)突變和改組基因的方法一起使用，其提供一種極好的生成多樣的、改組的蛋白質(zhì)的手段。這種方法成功地將酶的對(duì)映選擇性提高了 51倍。
[0157]在致突變菌株技術(shù)中，附條件的ts致突變質(zhì)粒允許選擇期間隨機(jī)和自然突變頻率增加20到4000倍以及當(dāng)無需選擇時(shí)，允許阻礙有害突變的堆積(Se I i fonova等人，Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649 (2001))。這項(xiàng)技術(shù)基于質(zhì)粒衍生mutD5 基因， 其編碼DNA聚合酶III的突變亞基。該亞基結(jié)合至內(nèi)源性DNA聚合酶III并危害任何包含該質(zhì)粒的菌株中聚合酶III的校正能力。范圍廣泛的堿替代和移碼突變發(fā)生。為了有效地使用，一旦實(shí)現(xiàn)所需的顯型，該致突變質(zhì)粒應(yīng)被去除；其通過復(fù)制的溫度敏感性(ts)起點(diǎn)完成，這允許在41°C下消除質(zhì)粒。應(yīng)注意的是，致突變菌株已得到長時(shí)間的探究(參見Low 等人，J.Mol Biol.260:359-3680(1996))。在這項(xiàng)技術(shù)中，觀察到非常高的自發(fā)突變速率。 附條件的特性使非所需的本底突變最小化。這項(xiàng)技術(shù)可以結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化，以提高誘變速率并更迅速地獲得所需的顯型。
[0158]精確誘變(LTM)是一種評(píng)估和優(yōu)化選擇氨基酸的組合突變的多維誘變方法 (Rajpal 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA102:8466-8471 (2005))。不是用所有可能的氨基酸改變使每個(gè)位點(diǎn)飽和，而是選擇一組九個(gè)以覆蓋氨基酸R基化學(xué)品的范圍。每個(gè)位點(diǎn)的較少改變?cè)试S多個(gè)位點(diǎn)遭受這種類型的誘變。已通過這種方法實(shí)現(xiàn)針對(duì)抗體的從低納摩爾到皮可摩爾的結(jié)合親和性的>800倍增加。這是一種合理的最小化隨機(jī)組合數(shù)目的方法以及這能夠通過極大地減少待篩選克隆的數(shù)目提高發(fā)現(xiàn)改善的性狀的能力。這已被用于抗體工程，尤其是提高結(jié)合親和性和/或減少解離。該技術(shù)可以結(jié)合篩選或選擇。
[0159]基因重裝是一種DNA改組方法，該方法可以一次應(yīng)用于多個(gè)基因或應(yīng)用于創(chuàng)建單基因的大型嵌合體(多重突變)文庫(由Verenium Corporation提供的可調(diào)基因重裝 ?(TGR?))。通常這項(xiàng)技術(shù)與超高通量的篩選結(jié)合使用，以質(zhì)詢用于所需改善的所表示的序列空間。這項(xiàng)技術(shù)允許不依賴于同源性的多個(gè)基因重組?？梢岳猛ㄟ^生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)的片段預(yù)先確定交叉事件的確切數(shù)目和位置。這項(xiàng)技術(shù)導(dǎo)致非常高水平的多樣性而實(shí)際上無親本基因再形成以及低水平的滅活基因。與GSSM?結(jié)合，可以對(duì)大范圍的突變進(jìn)行改善活性測(cè)試。該方法允許DNA改組的“混合”和“微調(diào)”，例如可以優(yōu)化密碼子用法。
[0160]計(jì)算機(jī)模擬的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)自動(dòng)化(PDA)是一種優(yōu)化算法，所述算法固定具有特定折疊子的結(jié)構(gòu)上限定的蛋白質(zhì)骨架，以及為可以穩(wěn)固該折疊子和整個(gè)蛋白質(zhì)能量的氨基酸替代尋找序列空間(Hayes 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA99:15926-15931 (2002))。這項(xiàng)技術(shù)利用計(jì)算機(jī)模擬的基于結(jié)構(gòu)的熵預(yù)測(cè)，以便尋求對(duì)于蛋白質(zhì)氨基酸變化的結(jié)構(gòu)容忍性。統(tǒng)計(jì)力學(xué)被用以計(jì)算每個(gè)位置上的耦合相互作用。對(duì)于氨基酸替代的結(jié)構(gòu)容忍性是耦合的量度。最后，這項(xiàng)技術(shù)被設(shè)計(jì)以取得蛋白質(zhì)特性的所需修飾同時(shí)保持結(jié)構(gòu)特性的完整性。該方法計(jì)算地評(píng)估并允許非常大量的可能的序列變體(1050)的 過濾。待測(cè)序列變體的選擇與基于最適合的熱力學(xué)預(yù)測(cè)相關(guān)。明顯地，只有穩(wěn)定性或與穩(wěn)定性相聯(lián)系的特性可以用這項(xiàng)技術(shù)有效地解決。該方法已被成功地用于一些醫(yī)用蛋白質(zhì)，特別用于工程免疫球蛋白。計(jì)算機(jī)模擬的預(yù)測(cè)避免測(cè)試異常大量的潛在變體。基于現(xiàn)有三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)比基于假擬結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)更有可能成功。這項(xiàng)技術(shù)可以很容易地預(yù)測(cè)和允許多重同時(shí)突變的靶向篩選，由于數(shù)目的指數(shù)增加這在簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是不可能的事情。
[0161]迭代飽和誘變(ISM)涉及:1)利用結(jié)構(gòu)/功能的知識(shí)選擇用于酶改善的適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)；2)利用誘變方法，如 Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA)在選定的位點(diǎn)進(jìn)行飽和誘變；3)篩選/選擇所需的特性；以及4)利用改善的克隆，在另一位點(diǎn)重新開始并持續(xù)重復(fù)，直至實(shí)現(xiàn)所需的活性(Reetz等人，Nat.Protoc.2:891-903 (2007)；以及 Reetz 等人，Angew.Chem.1nt.Ed Engl.45:7745-7751 (2006))。這是一種被證明的操作法， 其確保在給定位置所有可能的取代有助于篩選/選擇。
[0162]前述的用于誘變的任何方法可以單獨(dú)或以任何組合使用。此外，所述定向進(jìn)化方法的任何一個(gè)或組合可以結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)使用，如本文所述。
[0163]應(yīng)理解的是，本質(zhì)上不影響本發(fā)明各種實(shí)施方式的效能的修改也包含在本文提供的本發(fā)明的定義中。因此，下文的實(shí)施例旨在說明而非限制本發(fā)明。
[0164]實(shí)施例1
[0165]用于生產(chǎn)丁二烯或巴豆醇的途徑
[0166]本文披露了利用經(jīng)設(shè)計(jì)的非天然的微生物直接生產(chǎn)丁二烯或巴豆醇的新方法，所述微生物具有普通代謝物轉(zhuǎn)化為四碳二烯，即1，3-丁二烯或巴豆醇所需的酶。通向直接生產(chǎn)丁二烯的一個(gè)新路徑需要:經(jīng)由利用醛和醇脫氫酶的還原，從已知的丁醇途徑代謝物巴豆酰基-CoA還原為巴豆醇；接著是利用激酶的磷酸化作用，以提供巴豆基焦磷酸以及隨后利用異戊二烯合酶或者其變體轉(zhuǎn)化為丁二烯(見圖2)。另一路徑(圖3)是用于異戊間二烯化合物的生物合成、具有良好表征的DXP途徑的變體。在這個(gè)路徑中，底物缺乏2-甲基基團(tuán)并通過丁二烯合酶提供丁二烯而非異戊二烯?？梢岳帽疚乃龅亩喾N方法，例如定向進(jìn)化從異戊二烯合酶衍生得到這類丁二烯合酶。最后，圖4顯示出通向丁二烯的途徑，該途徑涉及底物3-羥基戊二?；?CoA，該底物作為天然甲羥戊酸途徑底物3-羥基-3-甲基-戊二?；?CoA的替代性底物(如圖1所示)。下文提供用于圖2的步驟A-P、圖3的步驟A-K 和圖4的步驟A-O的候選酶。
[0167]乙酰某-CoA:乙酰某-CoA酰某轉(zhuǎn)移酶(圖2,步驟A)
[0168]乙酰乙?；?Cok硫解酶將乙酰基-Cok的兩個(gè)分子轉(zhuǎn)化為乙酰乙?；?Cok 和CoA的每個(gè)的一個(gè)分子。示例性的乙酰乙?；?Cok硫解酶包括來自大腸桿菌的 atoB (Martin 等人，Nat.Biotechnol21:796-802 (2003))、來自丙酮丁醇梭菌的 thlA 和 thlB (Hana i 等人，Appl Environ Microbiol73:7814-7818 (2007) ;ffinzer 等人，J.Mol.Microbiol Biotechnol2:531-541 (2000))和來自釀酒酵母的 ERGlO (Hiser 等人，J.Biol.Chem.269:31383-31389(1994))的基因產(chǎn)物。
[0169]
蛋白質(zhì) GenBank ID GI號(hào)生物
AtoBNP—416728 16130161 大腸桿菌
ThlANP—349476.1 15896127 丙酮丁醇梭菌
ThlBNP—149242.1 15004782 丙酮丁醇梭菌
ERGlO NP—015297 6325229 釀酒酵母
[0170]乙酰乙酰某-CoA還原酶(圖2,步驟B)[0171]催化乙酰乙?；?Cok還原為3-羥基丁?；?Cok的乙酰乙?；?Cok還原酶參與梭菌屬的多個(gè)物種中通向丁酸的乙?；?CoA發(fā)酵途徑并已經(jīng)得到了詳細(xì)的研究(Jones等人,Microbiol Rev.50:484-524 (1986))。來自丙酮丁醇梭菌的由hbd編碼的所述酶已經(jīng)被克隆并功能表達(dá)于大腸桿菌中(Youngleson等人，J Bacteriol.171:6800-6807 (1989))。 此外，由fadB和fadj編碼的、大腸桿菌中的兩種脂肪酸氧化復(fù)合物的亞基起3-羥基?；?CoA 脫氫酶的作用(Binstock 等人，Methods Enzymol.71Pt C:403_411 (1981))。經(jīng)證實(shí)的將乙酰乙?；?CoA還原為3-羥基丁?；?CoA的仍然其他的候選基因是來自生枝動(dòng)膠菌的phbB (Ploux等人，Eur.J Biochem.174:177-182 (1988))和來自類球紅細(xì)菌的 phaB (Alber 等人，Mol.Microbiol61:297-309 (2006))。前面的候選基因是依賴 NADPH 的，其核苷酸序列已被測(cè)定(Peoples等人，Mol.Microbiol3:349-357 (1989))以及該基因已表達(dá)于大腸桿菌中。對(duì)該基因的底物特異性研究得出的結(jié)論是，除了乙酰乙酰基-CoA 之外，該基因還可接受3-氧代丙?；?CoA作為底物(Ploux等人，同上，(1988))。另外的候選基因包括克魯佛氏梭菌中的ffidl (C-末端域)和Hbd2 (N-末端域)(Hillmer和 Gottschalk, Biochim.Biophys.Acta3334:12-23 (1974))和牛中的 HSD17B10 (WAKIL 等人，J Biol.Chem.207:631-638(1954))。
[0172]
【權(quán)利要求】
1.一種用于生產(chǎn)丁二烯的方法: (a)在足夠量的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生巴豆醇的非天然存在的微生物；以及 (b)將通過培養(yǎng)所述非天然存在的微生物所產(chǎn)生的巴豆醇轉(zhuǎn)化為丁二烯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(b)在催化劑的存在下通過化學(xué)脫水執(zhí)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述非天然存在的微生物包很含巴豆醇途徑，該巴豆醇途徑包括編碼巴豆醇途徑酶的以足以產(chǎn)生巴豆醇的量表達(dá)至少一種外源性核酸，所述巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁酰基-Cok脫水酶；巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶；巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)；戊烯二?；?CoA脫羧酶；戊二?；?CoA脫氫酶；3_氨基丁酰基-CoA脫氨酶；或者4-羥基丁?；?Cok脫水酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述微生物包含兩種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述微生物包含三種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述微 生物包含四種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁酰基-CoA脫水酶和巴豆?；?CoA還原酶(醇形成)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括戊烯二?；?C0A脫羧酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆酰基-CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括戊二酰基-CoA脫氫酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括戊二酰基-CoA脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶以及巴豆酸酯還原酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括3-氨基丁酰基-Cok脫氨酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
17.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
18.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶以及巴豆酸酯還原酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
20.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括4-羥基丁酰基-CoA脫水酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
21.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶以及巴豆酸酯還原酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述至少一種外源性核酸是異源性核酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述非天然存在的微生物在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
24.—種非天然存在的微生物，該微生物包括巴豆醇途徑，該巴豆醇途徑包括編碼巴豆醇途徑酶的以足以生產(chǎn)巴豆醇的量表達(dá)的至少一種外源性核酸，所述巴豆醇途徑包括乙酰基-CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆?；?Cok還原酶(醛形成)；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-Cok水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；巴豆酸酯還原酶；巴豆酰基-Cok還原酶(醇形成)；戊烯二酰基-CoA脫羧酶；戊二酰基-CoA脫氫酶；3_氨基丁?；?CoA脫氨酶；或者4-羥基丁?；?CoA脫水酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述微生物包含兩種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述微生物包含三種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述微生物包含四種外源性核酸，每種均編碼巴豆醇途徑酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙酰基-CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁酰基-CoA脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中所述巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、3-羥基丁?；?CoA脫水酶和巴豆酰基-CoA還原酶(醇形成)。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括乙?；?CoA:乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶；乙酰乙?；?CoA還原酶；3_羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括戊烯二?；?CoA脫羧酶、巴豆酰基-Cok還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
32.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括戊烯二酰基-CoA脫羧酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
33.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括戊烯二酰基-CoA脫羧酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
35.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括戊二酰基-CoA脫氫酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括戊二?；?CoA脫氫酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
37.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括3-氨基丁酰基-CoA脫氨酶、巴豆酰基-Cok還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
38.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
39.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括3-氨基丁?；?CoA脫氨酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?Cok水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微`生物，其中，所述巴豆醇途徑包括4-羥基丁酰基-Cok脫水酶、巴豆?；?CoA還原酶(醛形成)和巴豆醛還原酶(醇形成)。
41.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶和巴豆?；?Cok還原酶(醇形成)。
42.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述巴豆醇途徑包括4-羥基丁?；?CoA脫水酶；巴豆醛還原酶(醇形成)；巴豆?；?CoA水解酶、合成酶或者轉(zhuǎn)移酶；以及巴豆酸酯還原酶。
43.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述至少一種外源性核酸是異源性核酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中，所述非天然存在的微生物在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
【文檔編號(hào)】C12P5/02GK103459602SQ201280016837
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年2月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月2日
【發(fā)明者】M·J·伯克, A·P·博加德, 孫軍, 羅賓·E·奧斯特豪特, 普里蒂·法克雅 申請(qǐng)人:基因組股份公司