用于細(xì)菌的多順反子表達(dá)系統(tǒng)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及革蘭氏陽(yáng)性菌中的多順反子表達(dá)，并且特別地涉及多順反子表達(dá)單元，所述多順反子表達(dá)單元包含與對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的一個(gè)或更多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的對(duì)所述細(xì)菌內(nèi)源的一個(gè)或更多個(gè)基因?！緦＠f明】用于細(xì)菌的多順反子表達(dá)系統(tǒng)【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域，更特別地屬于分子和細(xì)胞生物學(xué)的領(lǐng)域，并且涉及通過微生物重組改造和表達(dá)產(chǎn)物，例如肽、多肽或蛋白質(zhì)。更特別地，本發(fā)明涉及用于通過微生物表達(dá)這樣的產(chǎn)物的多順反子表達(dá)構(gòu)建體或盒，并且還涉及載體、經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主、用途和應(yīng)用，例如向患者遞送(尤其是治療性遞送)如此表達(dá)的產(chǎn)物?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]迄今為止，已開發(fā)了重組蛋白的多種表達(dá)系統(tǒng)用于多種生物技術(shù)應(yīng)用。在原核生物、酵母和真菌中并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已建立了用于異源或同源基因表達(dá)的系統(tǒng)。[0003]使用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為宿主系統(tǒng)表達(dá)了酵母中產(chǎn)生的大多數(shù)重組蛋白。盡管如此，還是在釀酒酵母系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了一些限制。例如產(chǎn)率通常低和分泌效率低(發(fā)現(xiàn)許多釀酒酵母蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中不是游離的，而是保留在周質(zhì)空間中或者與細(xì)胞壁締合)(Dominguez等.1nt.Microbiol.，1998,vol.1(2)，131-142)。由于在酵母中進(jìn)行生產(chǎn)的限制，對(duì)于在細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)生了很大的興趣，細(xì)菌易于在廉價(jià)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)并經(jīng)常用于生產(chǎn)重組蛋白。在原核系統(tǒng)中，使用大腸桿菌(E.coli)中的重組表達(dá)通常得到最高的蛋白質(zhì)水平(Jana&Deb.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2005,vol.67(3),289-298)。但是，在大腸桿菌中，最常用的生產(chǎn)策略是細(xì)胞內(nèi)的(在周質(zhì)或胞質(zhì)中)，因此涉及昂貴且經(jīng)常產(chǎn)生問題的下游純化過程。[0004]作為用于在體外重組表達(dá)異源多肽(例如，US5,559,007)以及用于在體內(nèi)或原位表達(dá)并遞送抗原和/或治療相關(guān)多肽(例如，WO97/14806)的宿主，乳酸菌(LacticAcidBacteria,LAB)變得越來越重要。這些革蘭氏陽(yáng)性菌宿主中產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)可容易地分泌到培養(yǎng)基中，從而有助于其純化以及其向?qū)ο蟮闹苯舆f送。[0005]大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)可非常好地處理單一蛋白質(zhì)的表達(dá)(由單一基因序列引起)。但是，在一些情況下期望存在這樣的表達(dá)系統(tǒng)，其能夠表達(dá)多種蛋白質(zhì)或多基因蛋白質(zhì)復(fù)合體，例如，不僅在體外表達(dá)抗體或蛋白質(zhì)復(fù)合體，而且在體內(nèi)或原位表達(dá)并遞送對(duì)具體疾病具有協(xié)同效應(yīng)的兩種或更多種蛋白質(zhì)，或者在體內(nèi)或原位表達(dá)并遞送抗體或其功能性(多基因)片段。在這些情況下，由于必須嚴(yán)格共同調(diào)控多個(gè)基因，所以期望存在在一個(gè)啟動(dòng)子控制下編碼期望蛋白質(zhì)或抗體的多個(gè)基因。[0006]產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)復(fù)合體的兩種最常見途徑是使單獨(dú)表達(dá)并純化的亞基進(jìn)行體外重組，或者通過在適當(dāng)宿主中共表達(dá)亞基來實(shí)施體內(nèi)重組(Selleck&Tan,“RecombinantproteincomplexexpressioninE.coli，，，Curr.Protoc.ProteinSc1.,2008,第5章:第5單元，21)。雖然體外重組已被成功使用，但是該方法是繁瑣的(必須表達(dá)并純化每個(gè)亞基，并且在重組之后必須進(jìn)一步純化復(fù)合體)并且重組產(chǎn)率通常較低。相比之下，通過共表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)重組提供了效率的益處(僅一輪表達(dá)和純化)以及期望復(fù)合體的潛在較高產(chǎn)率和質(zhì)量(復(fù)合體的再折疊和裝配在細(xì)胞環(huán)境中在蛋白質(zhì)折疊酶存在下發(fā)生)(SelleCk&Tan2008，見上)。通過用表達(dá)各蛋白質(zhì)亞基的桿狀病毒共感染昆蟲細(xì)胞(Tirode等.Mol.Cell,1999,vol.3(I)，87-95)，以及在細(xì)菌中由多個(gè)質(zhì)粒(Johnston等.ProteinExpr.Purif.,2000,vol.20(3)，435-443；McNally等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,1988,vol.85(19),7270-7273)或?qū)ｉT化的多順反子質(zhì)粒(Henricksen等.J.Biol.Chem.,1994，vol.269(15)，II121-1I132;Ishiai等?J.Biol.Chem.1996，vol.271(34)，20868-20878；Li等?Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,1997,vol.94(6)，2278-2283)成功進(jìn)行了體內(nèi)重組。[0007]已描述了用于在大腸桿菌中產(chǎn)生蛋白質(zhì)復(fù)合體的一般多順反子表達(dá)系統(tǒng)(Selleck&Tan2008,見上；Tan.Protein.Expr.Purif.,2001,vol.21(1),224-234；Tan等?ProteinExpr.Purif.,2005,vol.40(2),385-395)。這些系統(tǒng)利用了翻譯盒的概念,所述翻譯盒由具有需要的起始密碼子和終止密碼子的編碼區(qū)以及之前的翻譯起始信號(hào)例如夏因-達(dá)爾加諾(Shine-Dalgarno(SD))序列和翻譯增強(qiáng)子(Tan2001，Tan等?2005，見上)構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí),翻譯盒包含使大腸桿菌翻譯機(jī)構(gòu)啟動(dòng)并維持mRNA翻譯成期望多肽的必需且足夠的信息(Selleck&Tan2008，見上)。[0008]雖然在大腸桿菌中已描述了用于白細(xì)胞介素18的雙順反子表達(dá)載體，但是兩個(gè)基因之間的基因間區(qū)域由合成接頭組成，并且其具有明顯的基因特異性因?yàn)殡滋斓鞍酌?4的表達(dá)比ICE的表達(dá)高得多。Smolke等之前證實(shí)了可使用合成基因間區(qū)域序列來差異性控制由操縱子的兩種或更多種基因編碼的蛋白質(zhì)水平(Smolke等.Appl.Environ.Microbiol.，2000,vol.66(12)，5399-5405；SmoIke&Keasling.Biotechnol.Bioeng.，2002,vol.80(7),762-776)。但是，該途徑依賴于隨機(jī)組合，并且需要將合成序列引入表達(dá)宿主中。[0009]近些年來對(duì)新的改良抗體生產(chǎn)系統(tǒng)的需求增加。在原核生物、酵母和真菌中并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已建立了用于抗體表達(dá)的系統(tǒng)。雖然由細(xì)菌更容易產(chǎn)生單鏈抗體和單結(jié)構(gòu)域抗體，但是全尺寸抗體一般具有更高的結(jié)合親和力和更小的在注射時(shí)形成中和抗體的風(fēng)險(xiǎn)。[0010]可由細(xì)菌產(chǎn)生全尺寸抗`體(Mazor等.Nat.Biotechnol.,2007,vol.25(5)，563-565；Simmons等?J.1mmunol.Methods,2002，vol.263(1-2)，133-147)。關(guān)于重組原核表達(dá)的大多數(shù)報(bào)道描述了抗體片段的產(chǎn)生，雖然幾乎僅由大腸桿菌產(chǎn)生。雖然多種經(jīng)改造LAB能夠發(fā)生正確的二硫鍵連接，但是文獻(xiàn)僅包含由LAB產(chǎn)生的抗體樣分子的有限個(gè)數(shù)的實(shí)例(Kruger等.NatureBiotechnology,2002,vol.20(7),702-706；Beninati等.NatureBiotechnology,2000,vol.18(10),1060-1064；Chancey等?J.1mmunol.,2006，vol.176(9),5627-5636；Hultberg等.BMCBiotechnol.,2007,vol.7,58；Yuvarai等?Mol.Nutr.Food.Res.，2008，vol.52(8)，913-920)。這些報(bào)道僅描述了在乳桿菌(Lactobacillus)物種、乳酸乳球菌(LactococcusIactis)和格氏鏈球菌(Streptococcusgordonii)中表達(dá)的單鏈抗體片段，而沒有描述多基因的雙鏈抗體片段或全尺寸抗體。[0011]多順反子表達(dá)系統(tǒng)在得到復(fù)雜蛋白質(zhì)如抗體的有效原核合成和表達(dá)中可以是至關(guān)重要的。自從FDA在1986年批準(zhǔn)了莫羅單抗-⑶3(Muromonab-⑶3)(仍然是可用于控制移植排斥的最有效免疫抑制藥之一)(Hooks等.Pharmacotherapy,1991,vol.11(1),26-37)以來，全尺寸抗體和抗體片段成為了醫(yī)藥中越來越重要和通用的工具。[0012]雖然現(xiàn)有技術(shù)水平揭示了細(xì)菌細(xì)胞中多順反子表達(dá)系統(tǒng)的幾個(gè)實(shí)例，但是這些是相當(dāng)有限的，突出了對(duì)用于引入和表達(dá)多個(gè)基因的更有效系統(tǒng)的需要。因此，有需要提供可有利地用于蛋白質(zhì)表達(dá)，優(yōu)選異源蛋白質(zhì)表達(dá)，并且甚至更優(yōu)選地多種異源蛋白質(zhì)表達(dá)的另外的序列。[0013]除以上之外，產(chǎn)生更高量的重組蛋白(對(duì)于通過重組微生物的直接蛋白質(zhì)遞送以及大量(bulk)蛋白質(zhì)生產(chǎn)和下游純化二者)的嘗試代表了大的技術(shù)努力方向。增加異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的一種現(xiàn)有途徑是使用所選擇的強(qiáng)啟動(dòng)子(參見例如WO2008/084115)。在這種途徑中，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析以鑒定由微生物表達(dá)的最豐富的內(nèi)源蛋白質(zhì)。通過使用基因組序列，可鑒定和分離各基因和啟動(dòng)子。這些強(qiáng)啟動(dòng)子(例如，乳酸乳球菌hllA基因啟動(dòng)子，PhllA)可定位在異源基因之前，并且通過這種方式可實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。但是，損害宿主生理機(jī)能的表達(dá)水平可對(duì)宿主構(gòu)成生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)并導(dǎo)致反選擇(counter-selection)。這固有地將表達(dá)宿主中任意給定異源蛋白質(zhì)的最高可能表達(dá)限制在某一特定水平。這是染色體定位表達(dá)單元的開發(fā)中特別麻煩的障礙。[0014]傳統(tǒng)地通過提供選擇標(biāo)志物來解決反選擇的問題。的確，陽(yáng)性選擇或陰性選擇(例如，通過提供抗生素抗性基因)可防止引入的異源基因丟失?？商娲鼗蛘叱褂眠x擇標(biāo)志物之外，可采用誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)，其允許使宿主繁殖與異源蛋白質(zhì)的表達(dá)的解偶聯(lián)，從而在異源基因不表達(dá)時(shí)防止繁殖期期間可能的反選擇。在該背景下，EP0569604描述了嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng),其中異源基因強(qiáng)制性定位在LacZ基因的5’。通過這種方式，異源基因的表達(dá)不僅是誘導(dǎo)型的，而且另外通過使細(xì)菌在其自然棲息地乳中以乳糖作為碳源生長(zhǎng)(這需要表達(dá)LacZ基因)來選擇異源基因的保持。[0015]清楚的是，以上描述的用于異源基因表達(dá)的系統(tǒng)在應(yīng)用中受到限制。例如，使用選擇標(biāo)志物例如抗生素抗性基因不太容易為食品生產(chǎn)中的應(yīng)用或藥劑應(yīng)用所接受。此外，在自然棲息地生長(zhǎng)或使用來自生長(zhǎng)自然棲息的碳源生長(zhǎng)的限制顯著減少了用于異源基因表達(dá)的任意系統(tǒng)的多功能性。另外，誘導(dǎo)型系統(tǒng)的使用固有地取決于宿主的生長(zhǎng)條件，使得需要應(yīng)添加誘導(dǎo)物的限定培養(yǎng)基以確保異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。[0016]因此，本領(lǐng)域中還存在對(duì)增加異源蛋白質(zhì)表達(dá)的需要，并且需要可實(shí)現(xiàn)高表達(dá)水平的序列、克隆系統(tǒng)和策略，以得到工業(yè)和/或治療環(huán)境下以足夠量表達(dá)并且同時(shí)在多種不同條件下是通用的并且可廣泛使用的異源蛋白質(zhì)。在這些環(huán)境中，還特別有用的是得到多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，每一種具有其自身的生物學(xué)活性和治療性作用?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0017]本發(fā)明的方面和實(shí)施方案解決了以上所討論的本領(lǐng)域需要中的至少一些需要，例如一種或更多種需要。[0018]本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽(yáng)性菌可通過也包含這些細(xì)菌的內(nèi)源基因的多順反子表達(dá)單元有效地表達(dá)外源或異源基因。因此，當(dāng)外源或異源基因與革蘭氏陽(yáng)性菌的內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)時(shí)，這些細(xì)菌可由多順反子表達(dá)單元有效地表達(dá)所述外源或異源基因。出乎意料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，多順反子表達(dá)單元中內(nèi)源基因與外源基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯偶聯(lián)(transcriptionaland/ortranslationalcoupling)導(dǎo)致了革蘭氏陽(yáng)性菌中外源基因的高表達(dá)水平。特別地，發(fā)現(xiàn)跟不與革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的外源基因的表達(dá)水平相比，與革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯偶聯(lián)的外源基因的表達(dá)水平至少與其相當(dāng)并且有利地更高。[0019]因此，在本發(fā)明的一方面涉及包含多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。因此，多順反子表達(dá)單元也可表示為包含內(nèi)源基因(例如但不限于一個(gè)內(nèi)源基因)和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。優(yōu)選地，多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。因此，這樣的多順反子表達(dá)單元也可表示為連續(xù)地包含內(nèi)源基因(例如但不限于一個(gè)內(nèi)源基因)和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。多順反子表達(dá)單元被構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄為多順反子mRNA。因此，本發(fā)明革蘭氏陽(yáng)性菌可另外地表示為包含與一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因。因此，還提供了包含與一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因的革蘭氏陽(yáng)性菌。[0020]另一個(gè)方面提供了包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸，所述多順反子表達(dá)單元包含對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的基因和一個(gè)或更多個(gè)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的基因。優(yōu)選地，多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。因此，還提供了包含多順反子表達(dá)單元的的重組核酸，所述多順反子表達(dá)單元包含與一個(gè)或更多個(gè)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的基因。[0021]優(yōu)選地，如本說明書全文所意圖的，所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因可與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因的3’末端轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，這樣的構(gòu)造在異源蛋白質(zhì)表達(dá)水平，多順反子表達(dá)單元的維持和/或基因組穩(wěn)定性方面是有益的。而且發(fā)現(xiàn)其他的下游基因組布置的重要性較小或不重要。[0022]轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)錄可被能夠在革蘭氏陽(yáng)性菌中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子合適地調(diào)節(jié)或控制，并且優(yōu)選地可被所述革蘭氏陽(yáng)性菌的內(nèi)源啟動(dòng)子調(diào)節(jié)或控制。因此，還提供了這樣的革蘭氏陽(yáng)性菌，其包含與位于其天然染色體基因座的一個(gè)或更多個(gè)`內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因。因此，優(yōu)選地，這些轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)錄被所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因的天然啟動(dòng)子控制或調(diào)節(jié)。合適地，轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)可通過將一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合到所述基因座來實(shí)現(xiàn)，例如通過將一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合到所述基因座中所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因的3’來實(shí)現(xiàn)。[0023]因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，優(yōu)選地，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因是多順反子表達(dá)單兀的最3’基因。[0024]本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)到天然基因(其自身可以是多順反子基因，例如操縱子)3’的外源或異源基因(或多個(gè)異源基因)的染色體整合產(chǎn)生穩(wěn)定的表達(dá)單元，其中針對(duì)(一個(gè)或更多個(gè))外源基因的反選擇不存在或最小，這與預(yù)期的相反。[0025]本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在某些條件下(特別是通過某些類型的啟動(dòng)子)實(shí)現(xiàn)多順反子表達(dá)單元的表達(dá)時(shí)，更加體現(xiàn)出本文描述的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本文所述的多順反子表達(dá)系統(tǒng)(其中通過常規(guī)方法例如使用選擇標(biāo)志物或通過使用誘導(dǎo)型系統(tǒng)沒有解決針對(duì)異源蛋白質(zhì)的反選擇)可以仍穩(wěn)定維持并以高水平表達(dá)，從而在不需要選擇劑或誘導(dǎo)物的多種不同條件下廣泛應(yīng)用。如本文所述的多順反子表達(dá)模塊因此允許使用非選擇性(non-selectable)內(nèi)源基因和/或外源基因。[0026]在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過組成型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。[0027]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過中心代謝基因啟動(dòng)子(centralmetabolismgenepromoter)實(shí)現(xiàn)。[0028]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過管家基因啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。[0029]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過必需基因啟動(dòng)子(essentialgenepromoter)實(shí)現(xiàn)。[0030]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)不通過誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。[0031]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過核糖體基因啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。[0032]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過糖酵解基因啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。[0033]如以上所示的，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如上所述的啟動(dòng)子是內(nèi)源基因啟動(dòng)子。如以下進(jìn)一步詳細(xì)描述的，優(yōu)選地，本文使用的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子。優(yōu)選地但非限制地，所述內(nèi)源啟動(dòng)子可選自eno、usp45、gapB、pyk、rpmB和rplS的啟動(dòng)子。非常優(yōu)選地,翻譯偶聯(lián)的內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)錄可被所述內(nèi)源基因(之一)的天然啟動(dòng)子調(diào)節(jié)或控制。[0034]應(yīng)理解，本文所述啟動(dòng)子的特征可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行組合。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸或革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過例如以下來實(shí)現(xiàn):(內(nèi)源)組成型管家基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型中心代謝基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型必需基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型核糖體基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型糖酵解基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)中心代謝管家基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)必需中心代謝基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)必需中心代謝管家基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)必需管家基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型中心代謝管家基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型必需中心代謝管家基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)必需核糖體基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)必需糖酵解基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型必需核糖體基因啟動(dòng)子、(內(nèi)源)組成型必需糖酵解基因啟動(dòng)子。[0035]優(yōu)選地，如貫穿本說明書所意圖的，所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因可與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因的3’末端轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因存在于其細(xì)菌染色體上的天然位置處。在這種構(gòu)造中，一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因5’末端的序列(最少包含內(nèi)源基因啟動(dòng)子)與野生型菌株中的相同，并且一個(gè)或更多個(gè)外源基因3’末端之后的區(qū)域與野生型菌株中一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因3’區(qū)域的序列相同。[0036]外源蛋白質(zhì)表達(dá)的許多應(yīng)用例如通過重組微生物遞送治療性蛋白質(zhì)可得益于在具體選擇的宿主微生物中表達(dá)所述治療性蛋白質(zhì)?？苫谄涠ㄖ衬芰M(jìn)行選擇這些微生物，例如選擇來源于人或動(dòng)物微生物群(microbiota)的菌株。也可基于加強(qiáng)任何具體遞送的治療性蛋白質(zhì)的活性的能力選擇微生物，例如因其細(xì)胞壁、細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)容物與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，例如通過與toll樣受體、Ig家族成員、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等的相互作用?？筛鶕?jù)堅(jiān)持在具體的嚴(yán)苛遞送位點(diǎn)(例如腫瘤內(nèi)、皮膚、具有高膽汁含量的位點(diǎn)，PH低的位點(diǎn)等)中或其上的其穩(wěn)健性來選擇具體的微生物。貫穿本說明書所引述的革蘭氏陽(yáng)性菌可優(yōu)選是乳酸菌(LAB),更優(yōu)選是乳球菌屬(Lactococcussp.)、甚至更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LactococcusIactis)或其亞種或菌株。可替代地，所述LAB可優(yōu)選是腸球菌屬(^Enterococcussp.),更優(yōu)選是屎腸球菌或糞腸球菌(^Enterococcusfecium或Enterococcusfaecalis)或其亞種或菌株。[0037]為了避免側(cè)向基因轉(zhuǎn)移(lateralgenetransfer)至內(nèi)源生物群落(microflora)，由嵌入染色體的表達(dá)單元進(jìn)行表達(dá)對(duì)于將重組微生物群落用作醫(yī)藥中治療性蛋白質(zhì)的遞送工具是高度有利的。另外，可證明位于染色體上的表達(dá)單元在后代中更為穩(wěn)定地遺傳，因此位于染色體上的表達(dá)單元可以是用于大量蛋白質(zhì)生產(chǎn)的生產(chǎn)菌株的期望結(jié)構(gòu)。在現(xiàn)有技術(shù)水平下，通過使用條件性非復(fù)制并且在允許同源重組的側(cè)翼區(qū)之間包含異源基因的敲入(KI)型載體進(jìn)行染色體插入。在常規(guī)途徑(參見，例如W02008/084115)中，在同源宿主中構(gòu)建KI質(zhì)粒(用`于乳酸乳球菌的KI質(zhì)粒在乳酸乳球菌中建立)。對(duì)于需要蛋白質(zhì)分泌的異源表達(dá)尤其是如此，原因是許多分泌信號(hào)不適用于其他宿主。表達(dá)構(gòu)建體中旨在放置在細(xì)菌染色體上的強(qiáng)啟動(dòng)子的使用被來自KI質(zhì)粒中間體的異源基因的表達(dá)阻礙。異源基因之前緊接強(qiáng)啟動(dòng)子，使得來自KI質(zhì)粒的表達(dá)(雖然不是所意圖的也不是需要的)固有地限制了最強(qiáng)啟動(dòng)子的使用，在許多情況下，KI質(zhì)粒的拷貝數(shù)是宿主中染色體數(shù)目的多倍，使得整合后表達(dá)將減少幾倍。因此，染色體表達(dá)單元本質(zhì)上比可實(shí)現(xiàn)的最高的弱。通過本文所述的本發(fā)明避免了這個(gè)問題。在該途徑中，異源基因定位在細(xì)菌染色體上(強(qiáng)表達(dá))內(nèi)源基因的下游并且與其轉(zhuǎn)錄和/或翻譯偶聯(lián)。該策略不需要KI質(zhì)粒上存在內(nèi)源(強(qiáng))啟動(dòng)子。相反地，(強(qiáng)表達(dá))內(nèi)源基因的不含啟動(dòng)子的3’末端定位在異源基因的上游。這種類型的KI質(zhì)粒是沉默的并且不限制強(qiáng)啟動(dòng)子的使用。[0038]如本文所述的一個(gè)或更多個(gè)外源基因與一種或更多種其他基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)可借助在革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性(即，功能性、有效)的基因間區(qū)域(優(yōu)選地借助革蘭氏陽(yáng)性菌中的內(nèi)源基因間區(qū)域)來實(shí)現(xiàn)。因此，另一個(gè)方面提供了這樣的重組核酸，其包含與對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源之基因可操作連接的在所述革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性的基因間區(qū)域，優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性菌的內(nèi)源基因間區(qū)域。可操作連接確保了與外源基因轉(zhuǎn)錄物一起存在于mRNA上的基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄物能夠在革蘭氏陽(yáng)性菌中提供外源基因的翻譯起始位點(diǎn)。優(yōu)選地，基因間區(qū)域可設(shè)置在外源基因的5’。核酸可包含以多順反子布置的兩種或更多種外源基因，每個(gè)外源基因的前面具有基因間區(qū)域?；蜷g區(qū)域可相同或不同。例如，當(dāng)基因間區(qū)域不同時(shí)，其可對(duì)應(yīng)于來源于相同或不同物種之不同基因或者來源于不同物種之相同基因的基因間區(qū)域。這些核酸可用于構(gòu)建包含一個(gè)或更多個(gè)外源基因的多順反子表達(dá)單元，其中一個(gè)或更多個(gè)其他基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。例如，這些核酸可用于構(gòu)建如本文教導(dǎo)的多順反子表達(dá)單元，其中一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。優(yōu)選地，多順反子表達(dá)單元的第一順反子是強(qiáng)表達(dá)的內(nèi)源基因。[0039]本發(fā)明的重組核酸可包含在復(fù)制子上。因此，一個(gè)方面涉及包含如本文教導(dǎo)的核酸的復(fù)制子或載體。例如，載體可以是原核表達(dá)載體，優(yōu)選是原核多順反子表達(dá)載體。但是，開發(fā)這樣的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)可以是繁瑣的，因?yàn)槟承?fù)制子與強(qiáng)啟動(dòng)子的組合可以是不穩(wěn)定的。另外，因?yàn)樘烊毁|(zhì)粒的存在，所以可能不能用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所選擇的微生物并在微生物中穩(wěn)定維持所述重組質(zhì)粒，在表達(dá)質(zhì)粒中不可包含抗生素選擇標(biāo)志物的情況下(如在用于治療性蛋白質(zhì)遞送的應(yīng)用中的情況)尤其可能不能。這個(gè)問題可通過將異源基因定位在細(xì)菌染色體上的(強(qiáng)表達(dá))內(nèi)源基因下游并與其轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)來避開。由于該策略不需要基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)，所以其可用作適用于遺傳改造任意類型的所選微生物群體的一般途徑。所需的唯一菌株特異性信息可通過本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)水平快速建立。將高通量測(cè)序與豐富表達(dá)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析相組合將快速產(chǎn)生編碼豐富存在之蛋白質(zhì)的區(qū)域的核苷酸序列。因此，最優(yōu)選地，如本文所述的載體可構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌中的同源重組，例如產(chǎn)生外源基因的染色體整合。[0040]還提供了如本文所述的重組核酸或載體在革蘭氏陽(yáng)性菌中多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)外源基因或者多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的用途。另外，公開了包含如本文所教導(dǎo)的重組核酸或載體(例如，用其轉(zhuǎn)化)的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌能夠多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)外源基因或者多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。還提供了在革蘭氏陽(yáng)性菌中實(shí)現(xiàn)多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)外源基因或者實(shí)現(xiàn)多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的方法，其包括將如本文`所教導(dǎo)的重組核酸或載體引入所述革蘭氏陽(yáng)性菌中的步驟。另外，提供了能夠多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)外源基因或者能夠多順反子表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的革蘭氏陽(yáng)性菌的產(chǎn)生方法，其包括將如本文所教導(dǎo)的重組核酸或載體引入所述革蘭氏陽(yáng)性菌中的步驟。[0041]本發(fā)明允許在革蘭氏陰性菌中表達(dá)(優(yōu)選強(qiáng)(高度)表達(dá))單一外源基因或多個(gè)(例如，兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè))不同的外源基因。所述單一外源基因或多個(gè)外源基因可編碼單一表達(dá)產(chǎn)物或多種表達(dá)產(chǎn)物，例如，有利地為蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。例如而非限制，這樣的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽可涵蓋抗原(例如，用于誘導(dǎo)免疫或免疫耐受性)、變應(yīng)原、非致疫苗作用的(non-vaccinogenic)治療性多肽(細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、創(chuàng)傷愈合因子......)、抗體或其功能性片段(例如，F(xiàn)ab片段)、融合蛋白、多聚蛋白等及其任意組合。[0042]多順反子結(jié)構(gòu)可使如本文所教導(dǎo)的表達(dá)單元特別適合于表達(dá)包含兩條或更多條多肽鏈的蛋白質(zhì)(例如，多聚蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合體)。因此，如本說明書所意圖的兩個(gè)或更多個(gè)外源基因可優(yōu)選地編碼多聚體蛋白質(zhì)的不同單體或亞基，借此使基因共轉(zhuǎn)錄為多順反子mRNA并且由該mRNA翻譯各單體或亞基。這可允許嚴(yán)格調(diào)控外源基因的共表達(dá)，例如以實(shí)現(xiàn)各單體或亞基至多聚體蛋白質(zhì)的平衡且最優(yōu)的組裝。[0043]抗體或其功能性片段的表達(dá)特別有利地闡明了該原理。因此，如本文所教導(dǎo)的兩個(gè)或更多個(gè)外源基因可優(yōu)選地編碼抗體或其功能性片段的不同鏈。例如，一個(gè)外源基因可編碼抗體的輕鏈(\)或其功能性片段，另一個(gè)外源基因可編碼抗體的重鏈(Vh)或其功能性片段。優(yōu)選地，抗體的功能性片段可以是Fab。在一些具體但非限制性的實(shí)施方案中，所述Fab可與細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、趨化因子或免疫/炎性活化分子結(jié)合和/或抑制其生物作用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)ab可與TNFa結(jié)合和/或抑制其生物作用，例如但不限于，所述Fab可以是cA2抗TNF或CDP870抗TNF。[0044]因此，使編碼抗體或其片段各鏈的外源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)以在革蘭氏陽(yáng)性菌中進(jìn)行多順反子表達(dá)。優(yōu)選地，編碼\或其功能性片段的外源基因可與編碼Vh或其功能性片段的外源基因的3’末端轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。該基因結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了抗體或其功能性片段的特別有效的表達(dá)和組裝。[0045]多順反子結(jié)構(gòu)還可使如本文所教導(dǎo)的表達(dá)單元特別適合于共表達(dá)這樣的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))，所述產(chǎn)物在例如通過細(xì)菌原位遞送時(shí)配合以實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，例如協(xié)同的治療性或預(yù)防性作用。[0046]另一個(gè)方面提供了如本文所教導(dǎo)的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼在對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用的一種或更多種產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽。特別地提供這樣的細(xì)菌用作藥劑，更特別地用于將所述一種或更多種產(chǎn)物施用或遞送至對(duì)象，甚至更特別地用于治療可得益于所述一種或更多種產(chǎn)物之施用或遞送的疾病。因此，還提供了包含這樣的革蘭氏陽(yáng)性菌的藥物組合物。[0047]另外，提供了用于將`一種或更多種產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)、多肽或肽)遞送至對(duì)象的方法，其包括向?qū)ο笫┯萌绫疚乃虒?dǎo)的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼所述一種或更多種產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述一種或更多種產(chǎn)物在對(duì)象中可具有治療性或預(yù)防性作用。[0048]為了將本發(fā)明革蘭氏陽(yáng)性菌原位遞送至對(duì)象，有利的是通過除用于外源表達(dá)產(chǎn)物的序列之外不引入或引入更少的外源或甚至致病性序列使細(xì)菌更接近地保留其內(nèi)源特征。從而，盡可能多地維持GRAS規(guī)則或“一般認(rèn)為安全的(GenerallyRecognizedAsSafe)”狀態(tài)，從而方便獲得將改造菌株用于人或動(dòng)物的臨床批準(zhǔn)或市場(chǎng)許可的過程。[0049]下文中的(i)至(xxii)項(xiàng)示出了根據(jù)本發(fā)明的另一些方面和實(shí)施方案。[0050](i)包含多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因。[0051](ii)包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的基因和與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的基因。[0052](iii)根據(jù)(i)的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)(ii)的重組核酸，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼在對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，或者用于誘導(dǎo)免疫或免疫耐受性的抗原，非致疫苗作用的治療活性多肽，抗體或其功能性片段如Fab，融合蛋白或多聚體蛋白質(zhì)。[0053](iv)根據(jù)⑴的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)(ii)的重組核酸，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，所述產(chǎn)物在對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用，所述革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸用作藥物，優(yōu)選地用于將所述產(chǎn)物施用或遞送至所述對(duì)象。[0054](V)根據(jù)或(iv)的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)(ii)至(iv)的重組核酸，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因是多順反子表達(dá)單元的最3’基因。[0055](vi)根據(jù)(i)、(iii)、(iv)或(V)中任一項(xiàng)的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)(ii)至(V)中任一項(xiàng)的重組核酸，其中所述內(nèi)源基因和所述一種或跟多種外源基因被對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。[0056](vii)根據(jù)(Vi)的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子是必需基因啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、中心代謝基因啟動(dòng)子和/或管家基因啟動(dòng)子。[0057](viii)根據(jù)(Vi)的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子是核糖體基因啟動(dòng)子。[0058](ix)根據(jù)(Vi)的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子是糖酵解基因啟動(dòng)子。[0059](x)根據(jù)(Vi)的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子選自所述革蘭氏陽(yáng)性菌的eno、usp45、gap、pyk、rpmB和rplS的啟動(dòng)子。[0060](xi)根據(jù)⑴或(ii)至(X)中任一項(xiàng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中所述內(nèi)源基因位于革蘭氏陽(yáng)性菌的其天然染色體基因座中。[0061](xii)根據(jù)(Xi)的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中通過將一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合至所述基因座、優(yōu)選地通過將一個(gè)或更`多個(gè)外源基因染色體整合至所述基因座中內(nèi)源基因的3’來將所述內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。[0062](xiii)根據(jù)⑴或(iii)至(xii)中任一項(xiàng)的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)(ii)至(X)中任一項(xiàng)的重組核酸，其中所述內(nèi)源基因與所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過在革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性的一個(gè)或更多個(gè)基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)，優(yōu)選地，其中所述一個(gè)或更多個(gè)基因間區(qū)域?qū)τ谒龈锾m氏陽(yáng)性菌是內(nèi)源的。[0063](xiv)根據(jù)(xiii)的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述基因間區(qū)域選自在rplff>rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因間區(qū)域。[0064](XV)重組核酸，其包含與對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的基因可操作連接的在所述革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性的基因間區(qū)域，優(yōu)選地，其中所述基因間區(qū)域是革蘭氏陽(yáng)性菌的內(nèi)源基因間區(qū)域。[0065](xvi)根據(jù)(xiv)的重組核酸，其中所述基因間區(qū)域選自在rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因間區(qū)域。[0066](xvii)根據(jù)⑴或(iii)至(xiv)中任一項(xiàng)的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)(ii)至(X)或(Xiii)至(XVi)中任一項(xiàng)的重組核酸，其中一個(gè)外源基因編碼抗體的輕鏈或其功能性片段，另一個(gè)外源基因編碼抗體的重鏈(Vh)或其功能性片段，更優(yōu)選地，其中所述功能性片段是Fab。[0067](xviii)根據(jù)(xvii)的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中編碼'或其功能性片段的外源基因與編碼Vh或其功能性片段的外源基因的3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。[0068](xix)根據(jù)⑴、(iii)至(xiv)、(xvii)或(xviii)中任一項(xiàng)的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)Qi)至(X)或(xiii)至(xviii)中任一項(xiàng)的重組核酸,其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌是乳酸菌，優(yōu)選乳球菌、乳桿菌或腸球菌，更優(yōu)選是乳酸乳球菌或屎腸球菌，或者其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌是雙歧桿菌(Bifidobacterium)。[0069](XX)藥物組合物，其包含根據(jù)(i)、(iii)至(xiv)或(xvii)至(xix)中任一項(xiàng)的革蘭氏陽(yáng)性菌。[0070](xxi)根據(jù)(XX)的藥物組合物，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，所述產(chǎn)物在對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用。[0071](xxii)載體,其包含根據(jù)(ii)至(X)或(xiii)至(xix)中任一項(xiàng)的重組核酸。[0072]在以下部分和所附權(quán)利要求書中描述了本發(fā)明的以上和另一些方面和優(yōu)選實(shí)施方案。所附權(quán)利要求書的主題具體地引入本說明書中?！緦＠綀D】【附圖說明】[0073]圖1:乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactisssp.Cremoris)菌株MG1363對(duì)數(shù)期結(jié)束(end-log)培養(yǎng)物的細(xì)胞蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)染色。主要的蛋白質(zhì)帶標(biāo)示為I至12。[0074]圖2:參照的單順反子表達(dá)構(gòu)建體(上圖，SAGX0090)和根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的多順反子(雙順反子(bicistronic)、雙重順反子(dualcistron))構(gòu)建體(下圖)的圖示，其中基因X表示內(nèi)源基因。兩種表達(dá)構(gòu)建體旨在用于由大腸桿菌UidA基因表達(dá)P-葡萄糖醛酸酶，其在這里充當(dāng)示例性外源基因。[0075]圖3:在參照宿主(單順反子:PhllA>>uidA,sAGX0090)中和包含根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的多順反子(雙順反子)構(gòu)建體(如圖2所構(gòu)造)的宿主(內(nèi)源基因X>>rpmD>>uidA)中的相對(duì)P-葡萄糖醛酸酶(CTS)活性。在該實(shí)施例中，內(nèi)源基因X是usp45、enoA、rplS、rpmB、pyk和gapB。在該實(shí)施例中，rpmD基因間區(qū)域提供了內(nèi)源基因與外源基因的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。外源大腸桿菌uidA基因編碼3-葡萄糖醛酸酶。所有的表達(dá)構(gòu)建體都嵌在細(xì)菌染色體中。單順反子構(gòu)建體存在于thyA基因座中，雙順反子構(gòu)建體嵌在基因X的天然位置處。數(shù)據(jù)表明所有的雙順反子構(gòu)建體具有優(yōu)于單順反子PhllA>>uidA構(gòu)建體的b-半乳糖苷酶活性。[0076]圖4:在參照宿主(SAGX0122)和根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的宿主(sAGX0121和sAGX0164)中通過乳酸乳球菌的人胰島素原(ins)分泌的定量。(A)ins表達(dá)模塊的概述圖。菌株sAGX0122攜帶單順反子表達(dá)構(gòu)建體,其中thyA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)分泌前導(dǎo)物(secretionleader)-人胰島素原融合物(SS::ins)的表達(dá),所述構(gòu)建體在thyA基因座處嵌在乳酸乳球菌MG1363染色體中。SAGX0121和sAGX0164中的雙順反子表達(dá)構(gòu)建體由內(nèi)源usp45和enoA分別與SS::1ns通過rpmD基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)組成。這些構(gòu)建體分別位于乳酸乳球菌MG1363染色體上usp45和enoA基因的天然位置處。(B)在多種菌株的上清液中檢測(cè)到的胰島素原水平。分別指示這些菌株的上清液中的人胰島素原水平的柱下面標(biāo)示出菌株代碼(SAGX0122、SAGX0121和sAGX0164)。數(shù)據(jù)表明攜帶雙順反子構(gòu)建體的兩種菌株具有優(yōu)于攜帶單順反子PthyA>>ins構(gòu)建體的菌株的人胰島素原水平。[0077]圖5:乳酸乳球菌中的cA2抗TNFFab表達(dá)。編碼VLCL(L)與VHCHl⑶片段的基因通過rpmD、rplB、rpsG、rpsE和rplN基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。制備了其中L或H定位為雙順反子構(gòu)建體第一基因的構(gòu)建體。所有的抗TNA表達(dá)構(gòu)建體都是基于質(zhì)粒的并且受PthyA啟動(dòng)子控制。在多種菌株的上清液中測(cè)量抗TNF活性。數(shù)據(jù)表明在H是雙順反子構(gòu)建體第一基因的所有構(gòu)建體中抗TNF活性較高。[0078]圖6:乳酸乳球菌中的⑶P870抗TNFFab表達(dá)。(A)將與usp45分泌前導(dǎo)物編碼序列融合的CDP870輕鏈和重鏈(SS::CDP870VLCL和SS::CDP870VHCH1)作為第二和第三順反子插入乳酸乳球菌MG1363染色體中usp45(sAGX0219、sAGX0220)的下游。在sAGX0219和SAGX0220中，rpmD用于偶聯(lián)SS::⑶870基因與usp45。為了避免遺傳不穩(wěn)定，輕鏈與重鏈基因通過在rplN前面的基因間區(qū)域偶聯(lián)。在SAGX0219中，輕鏈基因在重鏈基因之前，而在SAGX0220中，重鏈基因在輕鏈基因之前。⑶粗制培養(yǎng)物上清液中抗人TNF活性的定量。雙順反子構(gòu)建體高度表達(dá)了重鏈和輕鏈二者，產(chǎn)生了高水平的功能性⑶P870抗TNFFab。當(dāng)重鏈定位在輕鏈之前時(shí)CDP870抗TNF表達(dá)大幅度增加。[0079]圖7:在參照宿主(SAGX0085)和根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的宿主(sAGX0276)中通過乳酸乳球菌的人三葉因子I(hTFFl)分泌的定量。(A)hTFFl表達(dá)模塊的概述圖。菌株SAGX0085攜帶單順反子表達(dá)構(gòu)建體，其中PhllA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)分泌前導(dǎo)物-hTFFl融合物(SS::hTFFl)的表達(dá)，所述構(gòu)建體嵌在乳酸乳球菌MG1363染色體中的thyA基因座處。SAGX0276中的雙順反子構(gòu)建體由gapB與SS::hTFFl通過rpmD基因間區(qū)域的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)組成。該構(gòu)建體位于乳酸乳球菌MG1363染色體上gapB基因的天然位置處。(B)在多種菌株的上清液中檢測(cè)到的hTFFl的水平。分別指示這些菌株上清液中的人hTFFl水平的柱下面標(biāo)示出菌株代碼(SAGX0085和SAGX0276)。數(shù)據(jù)表明攜帶雙順反子構(gòu)建體的sAGX0276產(chǎn)生hTFFl的水平優(yōu)于具有單順反子構(gòu)建體的SAGX0085。[0080]圖8:屎腸球菌菌株LMG15709對(duì)數(shù)期結(jié)束培養(yǎng)物的細(xì)胞蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)染色。主要的蛋白質(zhì)帶標(biāo)示為I至12。[0081]圖9:根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的多順反子(雙順反子、雙重順反子)構(gòu)建體的圖示，其中基因X表示內(nèi)源基因。表達(dá)構(gòu)建體旨在用于由大腸桿菌uidA基因表達(dá)(6-葡萄糖醛酸酶，其在這里充當(dāng)示例性外源基因。Gap和eno是代表性的“第一”內(nèi)源基因。[0082]圖10:在參照宿主(單順反子:PhllA>>uidA,sAGX0090)中和包含根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的多順反子(雙順反子)構(gòu)建體(如圖9所構(gòu)造)的宿主(內(nèi)源基因X>>rpmD>>uidA)中的相對(duì)P-葡萄糖醛酸酶(CTS)活性。在該實(shí)施例中，內(nèi)源基因X是gapB和eno。在該實(shí)施例中，rpmD基因間區(qū)域提供了內(nèi)源基因與外源基因的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。外源大腸桿菌uidA基因編碼3-葡萄糖醛酸酶。所有的表達(dá)構(gòu)建體均嵌在細(xì)菌染色體中。單順反子構(gòu)建體存在于thyA基因座中，雙順反子構(gòu)建體嵌在基因X的天然位置處。數(shù)據(jù)表明所有的雙順反子構(gòu)建體具有優(yōu)于單順反子PhllA>>uidA構(gòu)建體的P-半乳糖苷酶活性。[0083]圖11:在參照宿主(SAGX0270)和根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的宿主(sAGX0279)中通過屎腸球菌的人白細(xì)胞介素10(hIL-10)分泌的定量。(A)hIL-10表達(dá)模塊的概述圖。SAGX0279中的雙順反子表達(dá)構(gòu)建體由內(nèi)源gap與SS::hIL10通過rpmD基因間區(qū)域的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)組成。(B)在多種菌株的上清液中檢測(cè)到的hIL-10水平。[0084]圖12:在參照宿主(SAGX0270)和根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的宿主(sAGX0317)中通過屎腸球菌的人白細(xì)胞介素27(hIL-27)分泌的定量。(A)hIL-27表達(dá)模塊的概述圖。SAGX0317中的雙順反子表達(dá)構(gòu)建體由內(nèi)源gap與SS::hIL27通過rpmD基因間區(qū)域的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)組成。(B)在多種菌株的上清液中檢測(cè)到的hIL-27水平。[0085]圖13:屎腸球菌中的CDP870抗TNFFab表達(dá)。(A)將與usp45分泌前導(dǎo)物編碼序列融合的⑶P870輕鏈和重鏈(SS::⑶P870VHCHl和SS::⑶P870VLCL)作為第二和第三順反子插入gap(sAGX0278)的下游。為了避免遺傳不穩(wěn)定，輕鏈與重鏈基因通過來自乳酸乳球菌(LL)的在rpmD前面的基因間區(qū)域偶聯(lián)，而來自屎腸球菌(EF)的rpmD用于偶聯(lián)gap與重鏈基因。(B)粗制培養(yǎng)物上清液中抗人TNF活性的定量。雙順反子構(gòu)建體高度表達(dá)了重鏈和輕鏈二者，產(chǎn)生了高水平的功能性⑶P870抗TNFFab。[0086]圖14:產(chǎn)生抗hTNF之乳酸乳球菌(sAGX0220)在A20?小鼠中對(duì)hTNF誘導(dǎo)毒性和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，(a)用載劑、SAGX0220或MG1363將A20IEG_K°小鼠(n=5/組)預(yù)處理I小時(shí)后注射2iig(左圖)和6iig(右圖)重組hTNF，并且隨時(shí)間追蹤體溫。向一組A20iE_小鼠注射類克(Remicade)后注射6ughTNF。(b)注射2yghTNF5小時(shí)后回腸、近端結(jié)腸和血清中的MCP-1水平。(c)注射2iighTNF5小時(shí)后回腸勻漿中的KC和IL-6水平。⑷注射6iighTNF5小時(shí)后回腸、近端結(jié)腸和血清中的MCP-1水平。(e)注射6yghTNF5小時(shí)后回腸勻漿中的KC和IL-6水平。誤差線表示SEM。*，p<0.05。[0087]圖15:根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的菌株中的⑶P870產(chǎn)生。(A)整合在usp45基因座、enoA基因座或gapB基因座中的CDP870重鏈和輕鏈。(B)表明在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的不同菌株中⑶P870表達(dá)的Western印跡分析。(C)和(D)表明在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的不同菌株中CDP870表達(dá)的ELISA分析。(E)根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的不同菌株的TNF中和活性。[0088]圖16:與用野生型乳酸乳球菌菌株處理的小鼠和用Cimzia處理的小鼠相比，患有誘導(dǎo)型TNBS結(jié)腸炎的Tgl278小鼠用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)處`理后的存活。[0089]圖17:與用野生型乳酸乳球菌菌株處理的小鼠和用Cimzia處理的小鼠相比，患有誘導(dǎo)型TNBS結(jié)腸炎的Tgl278小鼠用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)處理后的體重演變。上圖:絕對(duì)體重(g);下圖:相對(duì)于初始體重的體重(%)。[0090]圖18:與用野生型乳酸乳球菌菌株處理的小鼠和用Cimzia處理的小鼠相比，患有誘導(dǎo)型TNBS結(jié)腸炎的Tgl278小鼠用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)處理后結(jié)腸組織的組織學(xué)評(píng)分。平均值示于條上。示出每組的存活率。[0091]圖19:與健康小鼠、用野生型乳酸乳球菌菌株處理的小鼠和用Cimzia處理的小鼠相比，患有誘導(dǎo)型TNBS結(jié)腸炎的Tgl278小鼠用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)處理后的促炎性細(xì)胞因子分泌。(A)、(B)和(C)分別表不遠(yuǎn)端結(jié)腸中的mIL6、mKC和mMCPl水平，以pg/mg為單位。[0092]發(fā)明詳述[0093]除非上下文另有清楚規(guī)定，否則本文未使用數(shù)量詞限定時(shí)包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指示物二者。[0094]本文使用的術(shù)語(yǔ)“包含”和“含有”與“包括”同義，并且是包括性或開放式的，并且不排除另外的未敘述的成員、要素或方法步驟。應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)“包含”和“含有”包括術(shù)語(yǔ)“由……組成”以及術(shù)語(yǔ)“基本由……組成”。[0095]通過端點(diǎn)敘述的數(shù)值范圍包括包括在各個(gè)范圍內(nèi)的所有數(shù)字和部分，以及所敘述的端點(diǎn)。[0096]本文使用的術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)涉及可測(cè)量值例如參數(shù)、量、時(shí)距等時(shí)，意指涵蓋給定值的+/-20%或更小，優(yōu)選+/-10%或更小，更優(yōu)選+/-5%或更小并且又更優(yōu)選+/-1%或更小的變化，其程度為這些變化適用于在所公開的本發(fā)明中執(zhí)行。應(yīng)理解修飾詞“約”涉及的值自身也是具體的，并優(yōu)選是公開的。[0097]雖然術(shù)語(yǔ)“一或更多”或“至少一”，例如一組成員的一個(gè)或更多個(gè)或至少一個(gè)成員自身通過進(jìn)一步舉例變得清楚，但是術(shù)語(yǔ)尤其涵蓋涉及所述成員的任意一個(gè)或者所述成員的任意兩個(gè)或更多個(gè)，例如，所述成員的任意>3、>4、>5、>6或>7等，并且多至所有的所述成員。[0098]本說明書引用的所有參考文獻(xiàn)都通過引用整體并入本文。特別地，本文所具體引用的所有參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)通過引用并入本文。[0099]除非另有定義，否則用于公開本發(fā)明的所有術(shù)語(yǔ)，包括技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)，具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意思。通過進(jìn)一步的指導(dǎo)，包括術(shù)語(yǔ)定義以更好地理解本發(fā)明的教導(dǎo)。[0100]在下文中，更詳細(xì)地定義了本發(fā)明的不同方面。除非明確指明有矛盾，否則如此定義的每個(gè)方面可與任意其他的一個(gè)或更多個(gè)方面組合。特別地，指示為優(yōu)選的或有利的的任意特性可與指示為優(yōu)選的或有利的的任意其他任意特性組合。[0101]貫穿本說明書，提及“一個(gè)實(shí)施方案”意指關(guān)于所述實(shí)施方案所描述的具體特性、結(jié)構(gòu)或特征包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，貫穿本說明書在不同地方短語(yǔ)“在一個(gè)實(shí)施方案中”的出現(xiàn)不一定都涉及相同的實(shí)施方案，而是可能涉及相同的實(shí)施方案。此外，如由本公開對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，在一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案中，可以以任意合適方式組合具體特性、結(jié)構(gòu)或特征。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，雖然本文所述的一些實(shí)施方案包括包括在另一些實(shí)施方案中的一些特性而不包括其另一些特征，但是不同實(shí)施方案的特性的組合意味著在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且構(gòu)成不同的實(shí)施方案。例如，在所附權(quán)利要求中，可以以任意組合使用所要求保護(hù)的實(shí)施方案中的任意一個(gè)。[0102]在以下的本發(fā)明詳述中，參照構(gòu)成本發(fā)明一部分并且其中僅通過闡明本發(fā)明可實(shí)施的具體實(shí)施方案示出的附圖。應(yīng)理解，可利用另一些實(shí)施方案并且可作出結(jié)構(gòu)或邏輯變化而不偏離本發(fā)明的范圍。因此，以下的詳細(xì)描述不應(yīng)視為限制意義，并且本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。[0103]列出重組DNA技術(shù)一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考書包括MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第1-3卷,Sambrook等編，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編，GreenePublishingandffiley-1nterscience,NewYork,1992(定期更新)("Ausubel等.1992");Innis等,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress:SanDiego,1990。例如在Davis,B.D.等，Microbiology,第3版，Harper&Row,publishers,Philadelphia,Pa.(1980)中列出了微生物學(xué)的一般原則。[0104]如所指出的，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含與一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的內(nèi)源基因的革蘭氏陽(yáng)性菌。優(yōu)選地，一個(gè)或更多個(gè)外源基因在內(nèi)源基因的下游(即，在3’末端)轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。一個(gè)相關(guān)方面提供了包含多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元包含內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。優(yōu)選地，多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因。另一個(gè)方面提供了包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸，所述多順反子表達(dá)單元包含與一個(gè)或更多個(gè)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的對(duì)所述革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的基因。優(yōu)選地，一個(gè)或更多個(gè)外源基因在內(nèi)源基因的下游(即，在3，末端)轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。[0105]優(yōu)選地，一個(gè)或更多個(gè)外源基因是多順反子表達(dá)單元的最3’基因，即，一個(gè)或更多個(gè)外源基因是多順反子表達(dá)單元的最后的或最下游基因。例如，如果內(nèi)源基因是單順反子，則一個(gè)或更多個(gè)外源基因位于所述基因開放閱讀框之后或下游(即，3’末端)，并且與其轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。類似地，如果內(nèi)源基因自身是多順反子的，例如操縱子(的一部分)，則一個(gè)或更多個(gè)外源基因位于內(nèi)源多順反子基因最后(即，最下游或最3’)的內(nèi)源基因之后或下游(即，3’末端)。[0106]最優(yōu)選地，貫穿本說明書，本文所提及的內(nèi)源基因是單順反子。因此，內(nèi)源基因優(yōu)選地不構(gòu)成內(nèi)源操縱子的一部分。[0107]優(yōu)選地，本文所述的多順反子表達(dá)單元的表達(dá)通過可以是或可展現(xiàn)出以下特征的一種或更多種的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn):組成型啟動(dòng)子、中心代謝基因啟動(dòng)子、必需基因啟動(dòng)子、強(qiáng)啟動(dòng)子、管家基因啟動(dòng)子、核糖體基因啟動(dòng)子、糖酵解基因啟動(dòng)子。最優(yōu)選地，啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。[0108]本文使用的術(shù)語(yǔ)“革蘭氏陽(yáng)性菌”具有其在本領(lǐng)域中已知的普通意思。對(duì)于進(jìn)一步的指導(dǎo)，革蘭氏陽(yáng)性菌可通過革蘭氏染色為保留結(jié)晶紫染色來鑒定。[0109]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陽(yáng)性菌是非致病性的，即其在施用于目的對(duì)象時(shí)不造成傷害或不引起`有害作用。[0110]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陽(yáng)性菌是乳酸菌(LAB)，包括但不限于乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、芽抱乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、四體球菌屬(Tetragenococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Weisella)。更優(yōu)選地，LAB是乳球菌物種例如但不限于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、Lactococcuspiscium、植物乳球菌(Lactococcuspiantarum)和棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)及其任意亞種和菌株。最優(yōu)選地，乳球菌物種是乳酸乳球菌及其任意亞種和菌株，例如但不限于乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactisssp.cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亞種(Lactococcuslactisssp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactisssp.lactis)、乳酸乳球菌亞種雙乙酸乳酸變種(Lactococcuslactisssp.bv.diacetylactis)。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施方案中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亞種或乳酸乳球菌乳酸亞種，更優(yōu)選是乳酸乳球菌乳脂亞種，并且涵蓋其任意菌株，例如，乳酸乳球菌乳脂亞種SKl1、乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363或乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，LAB是腸球菌物種優(yōu)選糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)及其任意亞種和菌株，例如但不限于屎腸球菌菌株LMG15709。[0111]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陽(yáng)性菌是雙歧桿菌。[0112]雙歧桿菌是革蘭氏陽(yáng)性的，非運(yùn)動(dòng)性的，通常分支的厭氧細(xì)菌的屬。本文使用的雙歧桿菌可包括青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、有角雙歧桿菌(B.angulatum)、動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)、星形雙歧桿菌(B.asteroides)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、波恩雙歧桿菌(B.bourn)、短雙歧桿菌(B.breve)、鏈狀雙歧桿菌(B.catenulatum)、小豬雙歧桿菌(B.choerinum)、棒狀雙歧桿菌(B.coryneforme)、兔雙歧桿菌(B.cuniculi)、B.denticolens、齒雙歧桿菌(B.dentium)、嘉利肯雙歧桿菌(B.galIicum)、雞雙歧桿菌(B.galIinarum)、印度雙歧桿菌(B.1ndicum)、嬰兒雙歧桿菌(B.1nfantis)、B.1nopinatum、乳雙歧桿菌(B.lactis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(B.1ongum)、巨大雙歧桿菌(B.magnum)、瘤胃雙歧桿菌(B.merycicum)、微小雙岐桿菌(B.minimum)、假鏈狀雙歧桿菌(B.pseudocatenulatum)、假長(zhǎng)雙歧桿菌(B.pseudolongum)、小雞雙歧桿菌(B.pul1rum)、反會(huì)雙岐桿菌(B.ruminantium)、沙庫(kù)來雙岐桿菌(B.saeculare)、沙布提雙岐桿菌(B.subtile)、豬雙歧桿菌(B.suis)、熱嗜酸性雙岐桿菌(B.thermacidophilum)、嗜熱雙歧桿菌(B.thermophilum)。優(yōu)選地，雙歧桿菌是青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌。應(yīng)理解雙歧桿菌的所有亞種和菌株也包括在內(nèi)。[0113]如本文在內(nèi)源和外源基因環(huán)境下使用的術(shù)語(yǔ)“連續(xù)”指多核酸、載體或染色體中各基因的5’至3’順序。例如，連續(xù)地包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的多順反子表達(dá)單元是指其中一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因定位在一個(gè)或更多個(gè)外源基因上游的單元。因此，一個(gè)或更多個(gè)外源基因定位在一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因的3’末端之后。應(yīng)理解，如本文所述的連續(xù)偶聯(lián)或排序不一定意味著內(nèi)源基因與外源基因直接偶聯(lián)。在內(nèi)源基因與外源基因之間可存在另外的序列。作為一個(gè)實(shí)例，如本文另外定義的基因間區(qū)域可存在于連續(xù)的內(nèi)源基因與外源基因之間(即，內(nèi)源基因的下游或3’與外源基因的上游或5’)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源基因”、“內(nèi)源啟動(dòng)子”、“內(nèi)源基因間區(qū)域”、“內(nèi)源核糖體結(jié)合位點(diǎn)”分別指革蘭氏陽(yáng)性菌天然的或者在`自然中可在革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)的基因、啟動(dòng)子、基因間區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，術(shù)語(yǔ)內(nèi)源基因、啟動(dòng)子、基因間區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)涵蓋革蘭氏陽(yáng)性菌不同屬、種、亞種或菌株之間直系同源(orthologous)的基因、啟動(dòng)子、基因間區(qū)域和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。特別地，認(rèn)為分離自革蘭氏陽(yáng)性菌一個(gè)屬、種、亞種或菌株的基因、啟動(dòng)子、基因間區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌所有的其他屬、種、亞種或菌株是內(nèi)源的(不考慮可能的多核酸序列差異)，前提條件是革蘭氏陽(yáng)性菌的所述其他屬、種、亞種或菌株也天然地包含這樣的基因、啟動(dòng)子、基因間區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，這這種相異但天然存在的基因、啟動(dòng)子、基因間區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列被認(rèn)為是內(nèi)源的。例如并非限制，分離自乳酸乳球菌乳酸亞種的編碼烯醇酶的基因enoA也被認(rèn)為對(duì)于乳酸乳球菌乳脂亞種是內(nèi)源的。[0114]但是，優(yōu)選地，如本文所意圖的革蘭氏陽(yáng)性菌給定屬、種、亞種或菌株的“內(nèi)源”基因、啟動(dòng)子或基因間區(qū)域可分別指在革蘭氏陽(yáng)性菌同一屬、種、亞種或菌株中天然的(即，對(duì)其為自然存在的或自身的)基因、啟動(dòng)子或基因間區(qū)域。例如并非限制，分離自乳酸乳球菌乳酸亞種的編碼烯醇酶的基因enoA可優(yōu)選地被認(rèn)為對(duì)于乳酸乳球菌乳酸亞種是“內(nèi)源”的，而對(duì)于乳酸乳球菌乳脂亞種不是。[0115]本文使用的術(shù)語(yǔ)“外源基因”是指對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌不是天然的或者不能在自然中在革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)的基因。術(shù)語(yǔ)外源基因與術(shù)語(yǔ)異源基因同義。外源基因可以是全長(zhǎng)基因或者可替代地是截短基因或基因片段。例如，外源基因可來源于病毒，其他原核生物例如革蘭氏陰性菌，或可替代地并且優(yōu)選地可來源于真核生物，例如植物、動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人?？商娲?，外源基因可以是完全或部分合成或人造的，即其完全或部分不天然存在。此外，外源基因可以是嵌合的，即其可由來源于不同物種的序列或天然序列和合成或人造序列的組合構(gòu)成。還涵蓋了由革蘭氏陽(yáng)性菌序列和對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌外源的序列構(gòu)成的嵌合序列，例如，編碼由革蘭氏陽(yáng)性菌分泌信號(hào)肽和外源蛋白質(zhì)構(gòu)成的融合蛋白的序列。[0116]因?yàn)檎婧嘶蛟诖蠖鄶?shù)情況下在外顯子旁包含內(nèi)含子，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明，外源基因的任何提及涉及這種基因的不含內(nèi)含子的開放閱讀框，即這種基因的蛋白質(zhì)編碼序列。術(shù)語(yǔ)“開放閱讀框”或ORF指一連串的編碼核苷酸三聯(lián)體，以翻譯起始密碼子(例如，ATG或GTG)開始并且以翻譯終止密碼子(例如，TAA、TAG或TGA)結(jié)束并且編碼單一多肽。[0117]原核基因(特別是來自革蘭氏陽(yáng)性菌的基因)不包含內(nèi)含子。因此，原核基因的編碼序列或開放閱讀框?qū)?yīng)于位于原核基因組(特別是細(xì)菌染色體)上的一連串編碼核苷酸三聯(lián)體，其以翻譯起始密碼子開始并以翻譯終止密碼子結(jié)束。[0118]因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含與一個(gè)或更多個(gè)外源開放閱讀框或編碼序列轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)的內(nèi)源開放閱讀框或編碼序列的革蘭氏陽(yáng)性菌。[0119]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，雖然術(shù)語(yǔ)“基因”一般來說可以指對(duì)應(yīng)于遺傳單元的基因組序列的定位區(qū)(locatableregion),其與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)例如普里布諾盒(pribnowbox)、夏因-達(dá)爾加諾序列、操縱基因、終止子、轉(zhuǎn)錄區(qū)和/或其他功能性序列區(qū)締合，除非另有明確說明，否則在本文所述的外源序列環(huán)境中術(shù)語(yǔ)“基因”的任意提及優(yōu)選地指所述基因的編碼序列或開放閱讀框。在本文所述的內(nèi)源序列環(huán)境中術(shù)語(yǔ)“基因”的任意提及可以指對(duì)應(yīng)于遺傳單元的基因組序列的定位區(qū)，其與調(diào)節(jié)區(qū)、轉(zhuǎn)錄區(qū)和或其他功能性序列區(qū)締合，但是可替代地，也可指所述基因的編碼序列或開放閱讀框。[0120]本文使用的術(shù)語(yǔ)“翻譯偶聯(lián)”與“翻譯連接”同義。這些術(shù)語(yǔ)本質(zhì)上與多順反子表達(dá)系統(tǒng)或單元有關(guān)。當(dāng)共有的調(diào)節(jié)元件(例如特別是共有的啟動(dòng)子)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄為編碼所述兩個(gè)或更多個(gè)基因、開放閱讀框或編碼序列的單一mRNA，然后可翻譯為兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)多肽序列時(shí)，所述兩個(gè)或更多個(gè)基因、開放閱讀框或編碼序列認(rèn)為是翻譯偶聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，細(xì)菌操縱子是其中兩個(gè)或更多個(gè)基因翻譯或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的天然多順反子表達(dá)系統(tǒng)或單元。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)是翻譯偶聯(lián)的基礎(chǔ)。[0121]因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含與一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的內(nèi)源基因的革蘭氏陽(yáng)性菌。優(yōu)選地，革蘭氏陽(yáng)性菌連續(xù)地包含內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)”與“轉(zhuǎn)錄連接”同義。這些術(shù)語(yǔ)一般是指包含共同轉(zhuǎn)錄為單一mRNA并且可翻譯為兩條或更多條單獨(dú)多肽的兩個(gè)或更多個(gè)開放閱讀框或編碼序列的多核酸序列。[0122]在另一些方面中，本發(fā)明涉及包含多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，所述多順反子表達(dá)單元包含內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列。[0123]本文使用的術(shù)語(yǔ)“多順反子表達(dá)單元”或“多順反子表達(dá)系統(tǒng)”是指其中兩個(gè)或更多個(gè)基因的表達(dá)受共同調(diào)節(jié)機(jī)制(例如啟動(dòng)子、操縱基因等)調(diào)節(jié)的單元。本文使用的術(shù)語(yǔ)多順反子表達(dá)單元與多個(gè)順反子表達(dá)單元同義。多順反子表達(dá)單元的實(shí)例是但不限于雙順反子表達(dá)單元、三順反子表達(dá)單元、四順反子表達(dá)單元。包含編碼單獨(dú)表達(dá)產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的兩個(gè)或更多個(gè)(例如3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè))開放閱讀框或編碼區(qū)的任何mRNA涵蓋在術(shù)語(yǔ)多順反子中。[0124]在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述翻譯或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因被對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的多順反子表達(dá)單元或系統(tǒng)被對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌內(nèi)源的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。[0125]“啟動(dòng)子”一般意指核酸分子(優(yōu)選DNA分子)上的RNA聚合酶與之結(jié)合并使轉(zhuǎn)錄開始的區(qū)域。啟動(dòng)子優(yōu)選地但不一定定位在其控制轉(zhuǎn)錄的序列的上游，即5’。[0126]在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述翻譯或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因受所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因(之一)的天然啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的多順反子表達(dá)單元或系統(tǒng)受包含在所述多順反子表達(dá)系統(tǒng)或單元中的所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因(之一)的天然啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的多順反子表達(dá)單元或系統(tǒng)與革蘭氏陽(yáng)性內(nèi)源啟動(dòng)子可操作性連接。[0127]本文使用的術(shù)語(yǔ)“可操作性連接的”或“可操作性連接”是這樣的連接，其中調(diào)節(jié)DNA序列與試圖表達(dá)的DNA序列以這種方式連接以允許表達(dá)。例如，如果連接或結(jié)合允許或?qū)崿F(xiàn)了所述基因的表達(dá)，則認(rèn)為啟動(dòng)子與基因、開放閱讀框或編碼序列可操作性連接。在另一個(gè)實(shí)例中，如果連接或結(jié)合允許或`實(shí)現(xiàn)了至少3’基因的翻譯，則認(rèn)為5’和3’基因、順反子、開放閱讀框或編碼序列在多順反子表達(dá)單元中可操作性連接。[0128]例如，如果序列之間連接的性質(zhì)不⑴導(dǎo)致引入移碼突變，⑵干擾啟動(dòng)子指導(dǎo)開放閱讀框轉(zhuǎn)錄的的能力或(3)干擾開放閱讀框通過啟動(dòng)子區(qū)序列轉(zhuǎn)錄的能力，則認(rèn)為DNA序列(例如，優(yōu)選啟動(dòng)子和開放閱讀框)可操作性連接。[0129]在一個(gè)示例性的優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可定位在其與之可操作性連接的開放閱讀框的上游，即5’。[0130]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，啟動(dòng)子可與另外的天然調(diào)節(jié)序列或區(qū)域(例如操縱基因)締合。表達(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)的精確性質(zhì)可隨生物體而改變，但是一般應(yīng)包含啟動(dòng)子區(qū)，在原核生物中包含啟動(dòng)子(指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的開始)以及在轉(zhuǎn)錄為RNA時(shí)發(fā)出開始蛋白質(zhì)合成信號(hào)的DNA序列二者。這樣的區(qū)域通常包含參與轉(zhuǎn)錄和翻譯開始的那些5’非編碼序列，例如普里布諾盒(參見，TATA盒)、夏因-達(dá)爾加諾序列等。[0131]在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是多順反子表達(dá)單元中最5’(即，最上游)內(nèi)源基因的天然啟動(dòng)子。[0132]本文使用的在啟動(dòng)子環(huán)境(或引申至涉及內(nèi)源基因的基因表達(dá))下的術(shù)語(yǔ)“組成型”是指允許其締合基因連續(xù)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。特別地，在這種啟動(dòng)子控制下一種或更多種締合基因的轉(zhuǎn)錄不依賴于任何誘導(dǎo)物或其他調(diào)節(jié)信號(hào)而發(fā)生。[0133]本文使用的術(shù)語(yǔ)“管家基因”或“管家啟動(dòng)子”是指維持基礎(chǔ)細(xì)胞功能所需的基因或基因的啟動(dòng)子。雖然一些管家基因以相對(duì)恒定的水平表達(dá)，但是其他管家基因可根據(jù)外部條件或?qū)嶒?yàn)條件改變。管家基因可例如參與代謝、基因表達(dá)(例如，基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是也可以是結(jié)構(gòu)基因。[0134]本文使用的“糖酵解基因”或“糖酵解啟動(dòng)子”是指參與糖酵解途徑的基因或基因的啟動(dòng)子，并且包括編碼糖酵解酶的基因的啟動(dòng)子，特別是編碼己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶的基因的啟動(dòng)子。[0135]本文使用的“核糖體基因”或“核糖體啟動(dòng)子”是指核糖體基因的基因或啟動(dòng)子，包括編碼核糖體蛋白質(zhì)的基因以及轉(zhuǎn)錄為核糖體RNA的基因。優(yōu)選地，其可以指核糖體蛋白質(zhì)的基因或啟動(dòng)子。[0136]本文使用的“中心代謝基因”或“中心代謝啟動(dòng)子”或者可替代地“基礎(chǔ)代謝基因”或“基礎(chǔ)代謝啟動(dòng)子”是指參與關(guān)鍵代謝途徑的基因或基因的啟動(dòng)子，并且包括參與糖酵解、戊糖-磷酸途徑和三羧酸(TCA)循環(huán)的基因。[0137]本文使用的在基因環(huán)境(或引申至涉及這些基因的啟動(dòng)子)下的術(shù)語(yǔ)“必需”涉及這樣的基因，其天然表達(dá)產(chǎn)物的不存在對(duì)于宿主是不利的(例如，特別是致死的)，或者可替代地改變、抑制或阻止正常生理或功能(例如，特別是增殖或生長(zhǎng))。應(yīng)理解，本文使用的在基因或基因的啟動(dòng)子環(huán)境下的術(shù)語(yǔ)“必需”涉及組成型必需的，與條件性必需的是不同的。例如，幾種革蘭氏陽(yáng)性菌(特別是乳酸菌例如乳球菌屬)中的乳糖操縱子基因例如^-半乳糖苷酶基因當(dāng)在包含乳糖作為主要或唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)可以是必需的，當(dāng)在包含替代性碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)這些基因則是非必需的。因此，如本文所意圖的，這些基因僅是條件性必需的，而不是組成型必需的。[0138]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文所述的內(nèi)源啟動(dòng)子和/或內(nèi)源基因選自包含對(duì)應(yīng)于以下乳球菌啟動(dòng)子和/或基因(更優(yōu)選乳酸乳球菌乳脂亞種菌株MG1363啟動(dòng)子和/或基因)的革蘭氏陽(yáng)性菌啟動(dòng)子和/或基因的組或者由其組成的組:1)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，亞基/160kD亞基(rpoC);2)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，P亞基/140kD亞基(rpb2或rpoB);3)DNA結(jié)合鐵蛋白樣蛋白(氧化性損傷保護(hù)蛋白)(dps)；4)丙酮酸激酶(pyk)；5)谷氨酰基和谷氨酰胺?；鵷RNA合成酶(glnS或gltX)；6)烯醇酶(eno)；7)谷氨酰胺合成酶(glnA);8)HTH型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(glnR);9)Xaa-His二肽酶(argE或pepV)；10)FOFl型ATP合酶P亞基(ATP合酶FlP亞基)(atpD);11)3-磷酸甘油酸激酶(pgk)；12)甘油醒-3-磷酸脫氫酶/赤蘚糖-4-磷酸脫氫酶(gapA或gapB)；13)乙酸激酶(ackA);14)3-氧?；鵢(?；?載體-蛋白)合酶(fabB或fabF)；15)3_氧?；鵢(?；?載體-蛋白)還原酶(fabG);16)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，a亞基/40kD亞基(rpoA);17)Xaa-Pro氨基肽酶(pepP)；18)果糖/塔格糖二磷酸醒縮酶(tbp或fbaA)；19)核糖體蛋白S4(rpsD)；20)超氧化物歧化酶(sodA)；21)核糖體蛋白S12(rpsL)和核糖體蛋白S7(rpsG)；22)核糖體蛋白L18(rplR)和核糖體蛋白S5(rpsE)和核糖體蛋白L30/L7E(rpmD);23)S_核糖基高半胱氨酸裂合酶(S-ribosylhomocysteinelyase)(IuxS)；24)核糖體蛋白L19(rplS)；25)核糖體蛋白Sll(rpsK)；26)核糖體蛋白LlO(rplJ)；27)核糖體蛋白L7/L12(rplL)；28)細(xì)菌類核DNA結(jié)合蛋白/DNA結(jié)合蛋白HU(hup或hllA);29)50S核糖體蛋白L28(rpmB)；30)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)纖維二糖特異性組分IIB(lace或ptcB);31)R)F1型ATP合酶a亞基(atpA)；32)ABC型糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ATP酶組分)(malK或msmK)；33)乙偶姻脫氫酶復(fù)合物El組分a亞基(acoA或pdhA)；34)細(xì)胞分裂蛋白(difIVA或ftsA);35)UDP-吡喃半乳糖變位酶(gif);36)谷氨?；被拿?frvX或pepA)；37)預(yù)測(cè)的脫氫酶相關(guān)蛋白(mviM或llmg_0272)；38)核糖體蛋白S2(rpsB)；39)翻譯起始因子3(IF_3)(infC)；40)核糖體蛋白L4(rplD)和核糖體蛋白L23(rplff)和核糖體蛋白L2(rplB)；41)EMAP結(jié)構(gòu)域(ydjD)；42)轉(zhuǎn)錄延伸因子(greA);43)ATP依賴性Clp蛋白酶的蛋白酶亞基(clpP)；44)核糖體蛋白L15(rpl0)；45)核糖體蛋白Lll(rplK)；46)核糖體蛋白S8(rpsH)；47)核糖體蛋白L2l(rplU)；48)核糖體蛋白S13(rpsM)；49)核糖體蛋白S19(rpsS)和核糖體蛋白L22(rplU或rplV)和核糖體蛋白L16(rplP)和核糖體蛋白L14(rplN)；50)核糖體蛋白SlO(rpsJ)；51)共伴侶蛋白(co-chaperonin)GroES(HsplO)(cpnlO)；52)核糖體蛋白L24(rplX)；53)假設(shè)蛋白LACR_0137(duf965)和54)分泌的45kDa蛋白(usp45)。優(yōu)選地，內(nèi)源啟動(dòng)子和/或內(nèi)源基因選自包含enoA、usp45、gapB、pyk、rpmB和rplS的組或者由其組成的組。在例如TO2008/08411(通過引用并入本文)中公開了這些啟動(dòng)子及其序列，例如表1及其圖1A至H。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因受對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌而言內(nèi)源的啟動(dòng)子、優(yōu)選地通過選自所述革蘭氏陽(yáng)性菌的eno、usp45、gap、pyk、rpmB和rplS啟動(dòng)子的內(nèi)源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源基因位于革蘭氏陽(yáng)性菌中其天然染色體基因座中。[0139]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因、開放閱讀框或編碼序列的3’末端翻譯或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中所述多順反子表達(dá)單元包含一個(gè)或更多個(gè)5’內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)3’外源基因。優(yōu)選地，多順反子表達(dá)單元的最5’基因是內(nèi)源基因。例如并非限制，多順反子表達(dá)單元可從5’末端至3’末端包含內(nèi)源基因、然后是一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因、然后是一個(gè)或更多個(gè)外源基因，或者基本由其組成?？商娲氐窍拗?，多順反子表達(dá)單元可由5’末端至3’末端包含內(nèi)源基因、然后是一個(gè)或更多個(gè)外源基因，或者基本由其組成?？商娲?，多順反子表達(dá)單元可由5’末端至3’末端包含內(nèi)源基因、然后是一個(gè)或更多個(gè)外源基因，然后是一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因，或者基本由其組成。[0140]如本文所述的翻譯偶聯(lián)或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因或者多順反子表達(dá)單元或系統(tǒng)可包含在復(fù)制子中，所述復(fù)制子允許在如本文所述的根據(jù)本發(fā)明之革蘭氏陽(yáng)性菌中維持和/或增殖并表達(dá)內(nèi)源基因和外源基因。[0141]在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的翻譯偶聯(lián)或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因(任選地包含如本說明書其他地方所述的(內(nèi)源)啟動(dòng)子)或者多順反子表達(dá)單元或系統(tǒng)可包含在載體中，優(yōu)選允許在革蘭氏陽(yáng)性菌中表達(dá)的表達(dá)載體中。因此，本發(fā)明還涉及包含如本文所述的重組核酸的載體。[0142]本文使用的“載體”是指在其中可插入和克隆(即，增殖)核酸片段的核酸分子，通常是DNA。因此，載體通常包含一個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)，并且可以能夠在限定宿主或運(yùn)載生物體中自主復(fù)制使得克隆序列可再生。根據(jù)情況，載體可包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、噬菌體源載體、PAC、BAC、線性核酸(例如線性DNA)等(參見，例如Sambrook等，1989;Ausubel1992)。[0143]在具體載體(例如質(zhì)粒)的選擇中的重要因素尤其包括:包含載體的受體細(xì)胞可從不包含載體的那些受體細(xì)胞中被識(shí)別并選擇的容易程度；具體宿主中期望的載體的拷貝數(shù)；以及是否期望能夠使載體在不同物種的宿主細(xì)胞之間“穿梭”。優(yōu)選的原核載體包括質(zhì)粒，例如能夠在大腸桿菌中復(fù)制的那些(例如，pBR322、ColEl，pSClOl,puC19等)。這樣的質(zhì)粒在例如Sambrook等，1989；Ausubel1992中進(jìn)行了描述。特別優(yōu)選的載體可以是能夠在大腸桿菌(或其他革蘭氏陰性菌)中以及在另一種目的宿主細(xì)胞例如革蘭氏陽(yáng)性菌(乳酸菌，優(yōu)選乳球菌，更優(yōu)選乳酸乳球菌)中復(fù)制的那些載體(參見，例如Kok等.Appl.Environ.Microbiol.，1984,vol.48(4)，726-31)。另一些優(yōu)選的載體可以是能夠在一種或更多種革蘭氏陽(yáng)性菌而不能在革蘭氏陰性菌中復(fù)制和/或穿梭的那些載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，載體是如Steidler等Appl.Environ.Microbiol.，1995,vol.61⑷,1627-1629(通過引用具體地并入本文)所述的pTINX。[0144]在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將如本文所述的翻譯偶聯(lián)或轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因或者多順反子表達(dá)單元或系統(tǒng)整合在革蘭氏陽(yáng)性菌基因組或染色體中，用于得到重組革蘭氏陽(yáng)性菌和隨機(jī)以及同源重組的方法在本領(lǐng)域中是公知的，以及用于實(shí)現(xiàn)重組的載體也是公知的。通過進(jìn)一步的指導(dǎo)，例如在Steidler等(2003,NatureBiotechnology，21:785-789)、Law等(1995,JBacteriol,177(24):7011-7018)、Leenhouts等(1998，MethodsinCellScience,20:35-50)和W02004/046346中描述了這樣的方法和載體，其通過引用整體并入本文。優(yōu)選地，通過經(jīng)同源重組將需要序列定點(diǎn)整合在細(xì)菌染色體中來產(chǎn)生或引入如本文所述的多順反子表達(dá)單元。[0145]在一個(gè)實(shí)施方案中，重組載體包含如本說明書其他地方所述的內(nèi)源啟動(dòng)子和任選的另外的調(diào)節(jié)序列，以及如本文所述的多順反子表達(dá)單元。優(yōu)選地，內(nèi)源啟動(dòng)子與多順反子表達(dá)單元可操作性連接?？稍陬A(yù)定基因座處實(shí)現(xiàn)同源重組。這樣的系統(tǒng)是高度模塊化的(modular)，并且允許啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)序列、內(nèi)源基因和外源基因的單獨(dú)選擇和組合，以及插入位點(diǎn)的選擇。[0146]在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陽(yáng)性菌在其天然基因座處(即，在細(xì)菌染色體上其天然基因組環(huán)境中)包含`如本說明書其他地方所述的內(nèi)源啟動(dòng)子，其與包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因、開放閱讀框或編碼序列和一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列的多順反子表達(dá)單元可操作性連接?？刹僮餍赃B接可通過包含啟動(dòng)子的基因座與包含多順反子表達(dá)單元(兩側(cè)是構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)所述同源重組的序列)的重組載體之間的同源重組來實(shí)現(xiàn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)，這通過將一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合至所述基因座，優(yōu)選地通過將一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合至所述基因座的內(nèi)源基因3’來進(jìn)行。[0147]可選擇載體設(shè)計(jì)使得僅內(nèi)源基因和/或外源基因的開放閱讀框或編碼序列整合到目的染色體基因座中。在這種情況下，通過啟動(dòng)子的天然基因組基因座提供了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的啟動(dòng)子自身旁邊的調(diào)節(jié)序列(例如操縱基因、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、夏因-達(dá)爾加諾序列、終止子序列等)?？商娲?，可在包含多順反子表達(dá)單元的重組載體上提供這樣的序列。在后一種情況下，根據(jù)需要，與內(nèi)源啟動(dòng)子締合的天然調(diào)節(jié)序列可在同源重組期間移除。本文所述的系統(tǒng)關(guān)于內(nèi)源基因、外源基因和可能的調(diào)節(jié)序列的單獨(dú)選擇是模塊化的，但是其預(yù)定了所選擇啟動(dòng)子的內(nèi)源基因座處的插入位點(diǎn)。[0148]在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陽(yáng)性菌在其天然基因座處(即，在細(xì)菌染色體上其天然基因組環(huán)境中)包含均在本說明書其他地方描述的內(nèi)源啟動(dòng)子和一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因，所述內(nèi)源啟動(dòng)子和一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列可操作性連接，使得實(shí)現(xiàn)了一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因和一個(gè)或更多個(gè)外源基因的多順反子表達(dá)。在該系統(tǒng)中，內(nèi)源啟動(dòng)子和一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因，以及實(shí)現(xiàn)所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)序列存在于其天然基因座中。這些的系統(tǒng)最大程度地保留了革蘭氏陽(yáng)性菌的天然特征。[0149]多順反子表達(dá)單元包含至少兩個(gè)基因、開放閱讀框或編碼序列。為了使所有基因開始翻譯，這些基因的每一個(gè)一般都與實(shí)現(xiàn)核糖體結(jié)合的序列(即，核糖體結(jié)合位點(diǎn))締合。在原核生物中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)表示為夏因-達(dá)爾加諾(SD)序列，其具有一般的共有序列5'-AGGAGG-3'。SD序列平均位于翻譯開始密碼子或起始密碼子上游(即，5’)的約8個(gè)堿基對(duì)處。根據(jù)5’基因終止密碼子與3’基因起始密碼子之間的距離(以核苷酸的量計(jì))，SD序列可通常定位在以下位置處:1)如果距離至少是SD序列的大小則在兩種基因的基因間區(qū)域中；2)在5’基因與3’基因之間距離較小的情況下，在兩種基因之間的基因間區(qū)域中，但是與5’基因終止密碼子重疊；或者3)如果例如5’基因的終止密碼子與3’基因的起始密碼子非常接近或重疊，則在5’基因的終止密碼子的5’。[0150]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其還包含一條或更多條多核酸序列，所述一條或更多條多核酸序列包含構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)一個(gè)或更多個(gè)外源基因翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其還包含構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)一個(gè)或更多個(gè)外源基因翻譯的一個(gè)或更多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因與所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含如本文所述的多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中任意的5’基因與3’基因通過包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)或(基本)由核糖體結(jié)合位點(diǎn)組成的多核酸序列偶聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌是內(nèi)源的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)包含在基因間區(qū)域中，優(yōu)選包含在操縱子基因間區(qū)域中。[0151]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其還包含一條或更多條多核酸序列，所述一條或更多條多核酸序列包含構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)一個(gè)或更多個(gè)外源基因翻譯的基因間區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其還包含構(gòu)造成實(shí)現(xiàn)一個(gè)或更多個(gè)外源基因翻譯的一個(gè)或基因間區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因與所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄或翻譯偶聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含如本文所述的多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中任意的5’基因與3’基因通過包含基因間區(qū)域或由基因間區(qū)域組成的多核酸序列偶聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域?qū)τ诟锾m氏陽(yáng)性菌是內(nèi)源的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域是操縱子基因間區(qū)域。[0152]本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因間區(qū)域”與“基因間接頭”或“基因間間隔物”同義。基因間區(qū)域定義為毗連(即，位于相同多核酸序列上的)基因、開放閱讀框、順反子或編碼序列之間的多核酸序列。引申開來，基因間區(qū)域可包含通過所述基因間區(qū)域連接的5’基因的終止密碼子和/或3’基因的起始密碼子。本文定義的術(shù)語(yǔ)基因間區(qū)域特別地涉及多順反子表達(dá)單元中毗連基因之間的基因間區(qū)域。例如，本文定義的基因間區(qū)域可存在于操縱子中的毗連基因之間。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文定義的基因間區(qū)域是操縱子基因間區(qū)域。[0153]在一個(gè)實(shí)施方案中，基因間區(qū)域、接頭或間隔物選自包含以下基因間區(qū)域的組或由以下基因間區(qū)域組成的組:在革蘭氏陽(yáng)性菌rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN前面(即，在其5’，更特別地緊鄰其5’)的基因間區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述革蘭氏陽(yáng)性菌是乳酸菌，優(yōu)選是乳球菌物種，更優(yōu)選是乳酸乳球菌，及其任意亞種或菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域涵蓋rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN的起始密碼子和/或其前面(即5’)基因的終止密碼子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中內(nèi)源基因與一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性的一個(gè)或更多個(gè)基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)，優(yōu)選地其中一個(gè)或更多個(gè)基因間區(qū)域?qū)τ谒龈锾m氏陽(yáng)性菌是內(nèi)源的，更優(yōu)選地其中內(nèi)源基因間區(qū)域選自在rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF前面的基因間區(qū)域。[0154]技術(shù)人員應(yīng)理解，如果基因間區(qū)域涵蓋5’終止密碼子和/或3’起始密碼子，則這些各密碼子優(yōu)選地不存在于通過所述基因間區(qū)域連接的基因中，從而避免可影響正確的翻譯起始和/或終止的雙起始密碼子和/或終止密碼子。用于鑒定基因間區(qū)域的方法在本領(lǐng)域是已知的。通過進(jìn)一步的指導(dǎo)，基因間區(qū)域可例如基于預(yù)測(cè)操縱子和相關(guān)啟動(dòng)子及開放閱讀框來鑒定，在本領(lǐng)域已知并且可使用用于其的大量軟件。[0155]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域序列選自包含SEQIDNO:1至7中任意一種的組或者基本由其組成的組或者由其組成的組:[0156]SEQIDNO:ITAATG[0157]SEQIDNO:2TAATCCATG[0158]SEQIDNO:3TAAGGAGGAAAAAATG[0159]SEQIDNO:4TAATAGAGGAGGAAAATCGTG[0160]SEQIDNO:5TAAGAAGGGAGATAAGTAAGAATG[0161]SEQIDNO:6TAAGGAAAGGGGTAATTAAACATG[0162]SEQIDNO:7TAAGCAAAACTAGGAGGAATATAGCATG。[0163]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域選自包含以下序列的組或者基本由其組成的組或者由其組成的組:相對(duì)于SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表現(xiàn)出一個(gè)錯(cuò)配或者一個(gè)核苷酸的缺失或插入的序列，相對(duì)于SEQIDNO:3或SEQIDNO:4表現(xiàn)出一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)錯(cuò)配或者一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸的缺失或插入的序列，以及相對(duì)于SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7表現(xiàn)出一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)錯(cuò)配或者一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)核苷酸的缺失或插入的序列。[0164]SEQIDNO:1至7都包含5’終止密碼子和3’起始密碼子。SEQIDNO:1至7分別對(duì)應(yīng)于在乳酸乳球菌乳脂亞種菌株MG1363(基因庫(kù)登錄號(hào)AM406671.1)的rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN前面的基因間區(qū)域。這些序列與乳酸乳球菌乳酸亞種菌株CV56(基因庫(kù)登錄號(hào)CP002365.1)、乳酸乳球菌乳脂亞種菌株NZ9000(基因庫(kù)登錄號(hào)CP002094.1)、乳酸乳球菌乳酸亞種菌KF147(基因庫(kù)登錄號(hào)CP001834.1)、乳酸乳球菌乳酸亞種菌IL1403(基因庫(kù)登錄號(hào)AE005176.1)和乳酸乳球菌乳脂亞種菌株SKll(基因庫(kù)登錄號(hào)CP000425.1)等的對(duì)應(yīng)序列相同。[0165]在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因間區(qū)域、接頭或間隔物選自包含以下基因間區(qū)域或由以下基因間區(qū)域組成的組:在革蘭氏陽(yáng)性菌的rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplE或rplF前面(即，在其5’，更特別地緊鄰其5’)的基因間區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述革蘭氏陽(yáng)性菌是乳酸菌，優(yōu)選是腸球菌物種，更優(yōu)選是屎腸球菌，及其任意亞種或菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域涵蓋rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplE或rplF的起始密碼子和/或其前面(即，5’)基因的終止密碼子。技術(shù)人員應(yīng)理解，如果基因間區(qū)域涵蓋5’終止密碼子和/或3’起始密碼子，則這些各密碼子優(yōu)選地不存在于通過所述基因間區(qū)域連接的基因中，從而避免可影響正確的翻譯起始和/或終止的雙起始密碼子和/或終止密碼子。用于鑒定基因間區(qū)域的方法在本領(lǐng)域是已知的。通過進(jìn)一步的指導(dǎo)，基因間區(qū)域可例如基于預(yù)測(cè)操縱子和相關(guān)啟動(dòng)子及開放閱讀框來鑒定，在本領(lǐng)域已知并且可使用用于其的大量軟件。[0166]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域序列選自包含SEQIDNO:8至13中任意一種的組或者基本由其組成的組或者由其組成的組:[0167]SEQIDNO:8TAATC[0168]SEQIDNO:9TAAGGAGGACAACAATA[0169]SEQIDNO:10TAATAGGAGGGAATTTCA[0170]SEQIDNO:11TTAGAAGAAGGAGGAATACCATTC[0171]SEQIDNO:12`TAAAAGTTTAAGGAAGGAGGGTCTTACTGA[0172]SEQIDNO:13TAATCAAGTAGAATCTACAAGGAGGTGTCTTTAA。[0173]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因間區(qū)域選自包含以下序列的組或者基本由其組成的組或者由其組成的組:相對(duì)于SEQIDNO:8表現(xiàn)出一個(gè)錯(cuò)配或者一個(gè)核苷酸的缺失或插入的序列，相對(duì)于SEQIDNO:9或SEQIDNO:10表現(xiàn)出一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)錯(cuò)配或者一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸的缺失或插入的序列，以及相對(duì)于SEQIDNO=IUSEQIDN0:12或SEQIDNO:13表現(xiàn)出一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)錯(cuò)配或者一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)核苷酸的缺失或插入的序列。SEQIDNO:8至13分別對(duì)應(yīng)于在屎腸球菌菌株LMG15709的rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplE和rplF前面的基因間區(qū)域。[0174]在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的基因間區(qū)域(不包含任意之前的終止密碼子并且不包含任意后續(xù)的起始密碼子)可包含多于I個(gè)核苷酸或者由其組成，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個(gè)核苷酸，優(yōu)選多于5個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選10個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因間區(qū)域可包含I至50個(gè)核苷酸，例如I至40個(gè)、I至30個(gè)、I至25個(gè)、I至20個(gè)、I至15個(gè)或I至10個(gè)，優(yōu)選5至50個(gè)、5至40個(gè)、5至30個(gè)、5至25個(gè)、5至20個(gè)、5至15個(gè)或5至10個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選10至50個(gè)、10至40個(gè)、10至30個(gè)、10至25個(gè)、10至20個(gè)或10至15個(gè)核苷酸。[0175]表1和表2描述了如本文所述的包含多順反子表達(dá)單元之革蘭氏陽(yáng)性菌的一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案，其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌包含內(nèi)源啟動(dòng)子，在其3’內(nèi)源基因與如表1和2所述的基因間區(qū)域連接，在其3’一個(gè)或更多個(gè)外源基因、開放閱讀框或編碼序列與基因間區(qū)域連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表1和2所述的每個(gè)基因受其天然啟動(dòng)子和任選的調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄控制。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多順反子表達(dá)單元整合在細(xì)菌染色體中。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述內(nèi)源啟動(dòng)子和/或內(nèi)源基因存在于細(xì)菌基因組或染色體上其天然基因座處。優(yōu)選地，起始密碼子和終止密碼子(如果存在的話)分別替換所述外源基因和所述內(nèi)源基因的起始密碼子和終止密碼子。[0176]表1:示例性多順反子表達(dá)單元可包含內(nèi)源啟動(dòng)子>>內(nèi)源基因>>基因間區(qū)域>>外源基因或者基本由其組成，其中所述內(nèi)源基因和基因間區(qū)域選自以下組合。[0177]【權(quán)利要求】1.包含多順反子表達(dá)單元的革蘭氏陽(yáng)性菌，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含內(nèi)源基因和與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)外源基因，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因是所述多順反子表達(dá)單元的最3’基因。2.包含多順反子表達(dá)單元的重組核酸，所述多順反子表達(dá)單元連續(xù)地包含對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌而言內(nèi)源的基因和與所述一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源基因3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的一個(gè)或更多個(gè)對(duì)所述革蘭氏陽(yáng)性菌而言外源的基因，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因是所述多順反子表達(dá)單兀的最3’基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組核酸，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼產(chǎn)物，例如在對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，例如用于誘導(dǎo)免疫或免疫耐受的抗原、非致疫苗作用的治療活性多肽、抗體或其功能性片段如Fab、融合蛋白或多聚體蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組核酸，其用作藥物，優(yōu)選用于將產(chǎn)物施用或遞送至對(duì)象，所述革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼在所述對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用的所述產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，例如用于誘導(dǎo)免疫或免疫耐受的抗原、非致疫苗作用的治療活性多肽、抗體或其功能性片段如Fab、融合蛋白或多聚體蛋白。5.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4中任一項(xiàng)所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的重組核酸，其中所述內(nèi)源基因和所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因被對(duì)所述革蘭氏陽(yáng)性菌而言內(nèi)源的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子是必需基因啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、中心代謝基因啟動(dòng)子和/或管家基因啟動(dòng)子。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子是核糖體基因啟動(dòng)子。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子是糖酵解基因啟動(dòng)子。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述啟動(dòng)子選自所述革蘭氏陽(yáng)性菌的eno、usp45、gap、pyk、rpmB和rplS的啟動(dòng)子。10.根據(jù)權(quán)利要求1或3至9中任一項(xiàng)所述的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中所述內(nèi)源基因位于其在所述革蘭氏陽(yáng)性菌中的天然染色體基因座。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的革蘭氏陽(yáng)性菌，其中通過將所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合至所述基因座、優(yōu)選通過將所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因染色體整合至所述基因座中所述內(nèi)源基因的3’來將所述內(nèi)源基因與所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。12.根據(jù)權(quán)利要求1或3至11中任一項(xiàng)所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的重組核酸，其中所述內(nèi)源基因與所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因通過在所述革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性的一個(gè)或更多個(gè)基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)，優(yōu)選地，其中所述一個(gè)或更多個(gè)基因間區(qū)域?qū)τ谒龈锾m氏陽(yáng)性菌而言是內(nèi)源的。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中所述基因間區(qū)域選自在rplff>rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因間區(qū)域。14.重組核酸，其包含與對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌而言外源的基因可操作連接的在所述革蘭氏陽(yáng)性菌中有活性的基因間區(qū)域，優(yōu)選地，其中所述基因間區(qū)域是革蘭氏陽(yáng)性菌的內(nèi)源基因間區(qū)域。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組核酸,其中所述基因間區(qū)域選自在rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因間區(qū)域。16.根據(jù)權(quán)利要求1或3至13中任一項(xiàng)所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)權(quán)利要求2至9或12至15中任一項(xiàng)所述的重組核酸，其中一個(gè)外源基因編碼抗體的輕鏈(')或其功能性片段，并且另一個(gè)外源基因編碼所述抗體的重鏈(Vh)或其功能性片段，更優(yōu)選地，其中所述功能性片段是Fab。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或重組核酸，其中編碼'或其功能性片段的所述外源基因與編碼Vh或其功能性片段的所述外源基因的3’末端轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。18.根據(jù)權(quán)利要求1、3至13、16或17中任一項(xiàng)所述的革蘭氏陽(yáng)性菌或者根據(jù)權(quán)利要求2至9或12至17中任一項(xiàng)所述的重組核酸，其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌是乳酸菌，優(yōu)選乳球菌(Lactococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)或腸球菌(Enterococcus),更優(yōu)選乳酸乳球菌(LactococcusIactis)或屎腸球菌(Enterococcusfaecium),或者其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌是雙歧桿菌(Bifidobacterium)。19.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、3至13或16至18中任一項(xiàng)所述的革蘭氏陽(yáng)性菌。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述一個(gè)或更多個(gè)外源基因編碼產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，所述產(chǎn)物在對(duì)象中具有治療性或預(yù)防性作用。21.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求2至9或12至18中任一項(xiàng)所述的重組核酸?！疚臋n編號(hào)】C12N15/90GK103562390SQ201280026763【公開日】2014年2月5日申請(qǐng)日期:2012年6月1日優(yōu)先權(quán)日:2011年6月1日【發(fā)明者】克拉斯·萬(wàn)登布魯克,卡羅利安·萬(wàn)于伊內(nèi)蓋姆,洛塔爾·施泰德勒申請(qǐng)人:阿克托杰尼斯有限公司