用于調(diào)節(jié)mir-21活性的微rna化合物以及方法
【專利摘要】本文描述了用于抑制miR-21活性的組合物和方法。這些組合物具有某些產(chǎn)生miR-21活性的有效抑制劑的核苷修飾型態(tài)。這些組合物可用于抑制miR-21，以及治療與miR-21的異常表達(dá)相關(guān)的疾病，諸如纖維化及癌癥。
【專利說明】用于調(diào)節(jié)MIR-21活性的微RNA化合物以及方法
[0001]本申請要求2011年4月25日提交的美國臨時申請案61/478，767號以及2011年12月I日提交的美國臨時申請案61/565，779號的優(yōu)先權(quán)益，這些申請案出于任何目的通過引用以其全文結(jié)合在此。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本文提供用于調(diào)節(jié)miR-21活性的方法和組合物。
[0003]相關(guān)技術(shù)說明
[0004]微RNA (microRNA)亦稱為“成熟微RNA”，是在植物及動物的基因組中編碼的小型(長約18-24個核苷酸)非編碼RNA分子。在某些情況下，高度保守的內(nèi)源性表達(dá)的微RNA通過結(jié)合至特定mRNA的3’ -非翻譯區(qū)(3’ -UTR)來調(diào)控基因的表達(dá)。已在植物和動物中鑒別出超過1000種不同的微RNA。某些成熟微RNA似乎來源于長度通常為數(shù)百個核苷酸的長內(nèi)源性初級微RNA轉(zhuǎn)錄物(亦稱為初級微RNA、初級mir、初級miR或初級微RNA前體)(Lee等人，EMBO J.，2002，21 (17)，4663-4670)。
[0005]對微RNA的功能性分析揭示，這些小型非編碼RNA促進(jìn)動物的不同生理過程，包括發(fā)育時序、器官發(fā)生、分化、成型(patterning)、胚胎發(fā)生、生長控制及漸進(jìn)式細(xì)胞死亡。微RNA參與的特定過程的實例包括干細(xì)胞分化、神經(jīng)生成、血管生成、造血作用及胞吐作用(由 Alvarez-Garcia 及 Miska, Development (《發(fā)育》),2005, 132, 4653-4662 評述)。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本文提供包含經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21互補且經(jīng)修飾寡核苷酸具有本文所述的核苷型態(tài)。
[0008]本文提供抑制miR-21活性的方法，包括使細(xì)胞與本文所述的化合物接觸。在某些實施例中，細(xì)胞在活體內(nèi)。在某些實施例中，細(xì)胞在活體外。
[0009]本文提供治療與miR-21相關(guān)的疾病的方法，包括向患有與miR-21相關(guān)的疾病的受試者給予本文所述的化合物。在某些實施例中，動物是人類。
[0010]本文所述的化合物被提供用于療法中。
[0011]本文提供包含由8至22個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)I的至少8個連續(xù)核苷:
[0012](R) x-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Nq_Nz
[0013]其中每個R獨立地是非雙環(huán)核苷；X是I至4 ;每個Nb獨立地是雙環(huán)核苷；每個Nq獨立地是非雙環(huán)核苷；并且每個Nz獨立地是經(jīng)修飾的核苷。
[0014]本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)II的至少8個連續(xù)核苷:
[0015]Nm-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Nq_Nz
[0016]其中Nm獨立地是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；每個Nb獨立地是雙環(huán)核苷；每個Nq獨立地是非雙環(huán)核苷；且Nz獨立地是經(jīng)修飾的核苷。
[0017]本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)III的至少8個連續(xù)核苷:
[0018](R) x-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Ny_Nz
[0019]其中每個R是非雙環(huán)核苷；X是I至4 ;每個Nb是雙環(huán)核苷；每個Nq是非雙環(huán)核苷；Ny是經(jīng)修飾的核苷或未經(jīng)修飾的核苷；且每個Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0020]本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)IV的至少8個連續(xù)核苷:
[0021]Nm-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Ny_Nz
[0022]其中Nm是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；每個Nb是雙環(huán)核苷；每個Nq是非雙環(huán)核苷；NY是經(jīng)修飾的核苷或未經(jīng)修飾的核苷；且Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0023]本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)V的至少8個連續(xù)核苷:
[0024]Nm-Nb- (Nq-Nq-Nb-Nb) 4_Nz
[0025]其中Nm是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；每個Nb是雙環(huán)核苷；每個Nq是非雙環(huán)核苷；且Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0026]在核苷型態(tài)I或III的某些實施例中，X是1，X是2，X是3，或X是4。
[0027]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸包含核苷型態(tài)1、
I1、II1、IV或V的至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續(xù)核苷。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸由核苷型態(tài)1、I1、II1、IV 或 V 之 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個連接的核苷組成。
[0028]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21的核苷堿基序列(SEQ ID NO:1)至少90%互補、至少95%互補或100%互補。
[0029]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，miR-21位置I上的核苷堿基與經(jīng)修飾寡核苷酸的3’端上的第一核苷堿基配對。
[0030]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個雙環(huán)核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。
[0031 ] 在本文提供的任何化合物的某些實施例中，至少兩個非雙環(huán)核苷包含彼此不同的糖部分。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷具有相同類型的糖部分。
[0032]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個雙環(huán)核苷為cEt核苷。在某些實施例中，cEt核苷是S-cEt核苷。在某些實施例中，cEt核苷是R-cEt核苷。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個雙環(huán)核苷是LNA核苷。
[0033]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷獨立地選自β -D-脫氧核糖核苷、β -D-核糖核苷、2’ -O-甲基核苷、2’ -O-甲氧基乙基核苷及2’ -氟核苷。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷獨立地選自β -D-脫氧核糖核苷及2’ -O-甲氧基乙基核苷。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷是β-D-脫氧核糖核苷。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷是2’ -O-甲氧基乙基核苷。[0034]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個雙環(huán)核苷包含非甲基化核苷。[0035]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，不超過2個非雙環(huán)核苷是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些此類實施例中，每個其他非雙環(huán)核苷是β-D-脫氧核糖核苷。[0036]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，5’最末端非雙環(huán)核苷及3’最末端非雙環(huán)核苷是2’-0-甲氧基乙基核苷且其他每個非雙環(huán)核苷是β-D-脫氧核糖核苷。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，兩個非雙環(huán)核苷是2’ -MOE核苷且每個其他非雙環(huán)核苷是β -D-脫氧核糖核苷。[0037]在核苷型態(tài)I或III的某些實施例中，每個核苷R是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)I或III的某些實施例中，三個核苷R是2’ -O-甲氧基乙基核苷且一個核苷R是β -D-脫氧核糖核苷。[0038]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，至少一個核苷間鍵是經(jīng)修飾的核苷間鍵。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個核苷間鍵均為經(jīng)修飾的核苷間鍵。在某些實施例中，經(jīng)修飾的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。[0039]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，至少一個核苷間鍵包含經(jīng)修飾的核苷堿基。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，至少一個胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，每個胞嘧啶均是5-甲基胞嘧啶。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，經(jīng)修飾寡核苷酸的位置2上的胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。[0040]在核苷型態(tài)I的某些實施例中，R由四個連接的核苷Nk1-Nk2-Nk3-Nk4組成，其中Nki是2’ -O-甲氧基乙基核苷且Nk2-Nk3-Nk4的每一個是β -D-脫氧核糖核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，每個R是2’ -O-甲氧基乙基核苷；Χ是I ;每個Nb是S-cEt核苷；每個爐是β-D-脫氧核糖核苷；且#是2’-0-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，每個R是2’-O-甲氧基乙基核苷；Χ是I ;每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是2’-O-甲氧基乙基核苷；且Nz是2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，每個R是2’-O-甲氧基乙基核苷；Χ是I ;每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是S_cEt核苷。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，每個R是2’ -O-甲氧基乙基核苷；X是I ;每個Nb是LNA核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，每個R是2’ -O-甲氧基乙基核苷；Χ是I ;每個Nb是LNA核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是LNA核苷。[0041]在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個爐是2’ -O-甲氧基乙基核苷；且Nz是2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；每個N是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是S-cEt核苷。在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是LNA核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’-0_甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是LNA核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是LNA核苷。
[0042]在核苷型態(tài)III的某些實施例中，每個R是2’-0_甲氧基乙基核苷；X是I ;每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；ΝΥ是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，每個R是2’-O-甲氧基乙基核苷；Χ是I ;每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；ΝΥ是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是S-cEt核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，每個R是2’-O-甲氧基乙基核苷；X是I ;每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；ΝΥ是S-cEt核苷；且Nz是S-cEt核苷。
[0043]在核苷型態(tài)IV的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；ΝΥ是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -0-甲氧基乙基核苷。在核苷型態(tài)IV的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；ΝΥ是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是S-cEt核苷。在核苷型態(tài)IV的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；NY是S_cEt核苷；且Nz是S-cEt核苷。
[0044]在核苷型態(tài)V的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。
[0045]在本文提供的任何化合物的某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有SEQ ID NO:3的核苷堿基序列，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。在本文提供的任何化合物的某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有SEQ ID Ν0:4的核苷堿基序列，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0046]本文提供抑制miR-21活性的方法，包括使細(xì)胞與本文提供的化合物接觸。在某些實施例中，細(xì)胞在活體內(nèi)。在某些實施例中，細(xì)胞在活體外。在某些實施例中，細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、過度增殖性細(xì)胞、角化細(xì)胞或乏氧細(xì)胞。在某些實施例中，成纖維細(xì)胞是過度增殖性成纖維細(xì)胞。
[0047]本文提供減少細(xì)胞中的膠原蛋白表達(dá)的方法，包括使細(xì)胞與本文提供的化合物接觸。
[0048]本文提供治療與miR-21相關(guān)的疾病、預(yù)防或延遲其發(fā)作的方法，包括向患有這種疾病的受試者給予本文提供的任何化合物。
[0049]在某些實施例中，疾病為纖維化。在某些實施例中，纖維化為腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、皮膚纖維化、年齡相關(guān)性纖維化、脾纖維化、硬皮病或移植后纖維化。
[0050]在某些實施例中，纖維化為腎纖維化且存在于患有選自以下項的疾病的受試者中:腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化、IgA腎病、間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮；慢性腎損傷、腎小球疾病、腎小球腎炎、糖尿病、特發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化、膜性腎病、塌陷性腎小球病、慢性復(fù)發(fā)性腎臟感染以及終末期腎病。在某些實施例中，腎纖維化由腎臟的急性或反復(fù)性創(chuàng)傷引起。
[0051]在某些實施例中，纖維化是肝纖維化且存在于患有選自以下項的疾病的受試者中:慢性肝損傷、肝炎感染、非酒精性脂肪變性肝炎以及肝硬化。[0052]在某些實施例中，肺纖維化是特發(fā)性肺纖維化，或受試者患有慢性阻塞性肺病。
[0053]在某些實施例中，疾病是發(fā)炎性疾病。
[0054]本文提供促進(jìn)受試者的傷口愈合的方法,包括向具有急性或慢性傷口的受試者給予本文提供的任何化合物。在某些實施例中，慢性傷口是急性或慢性手術(shù)傷口、穿透傷口、撕脫傷、擠壓傷、剪力損傷、燒傷、撕裂、咬傷、動脈性潰瘍、靜脈性潰瘍、褥瘡及糖尿病性潰瘍。在某些實施例中，化合物被局部給予傷口。
[0055]本文提供治療受試者的纖維增生性病癥的方法，包括向受試者給予本文提供的任何化合物。
[0056]本文提供的任何方法可包括選擇一種或多種組織中的miR-21表達(dá)升高的受試
者。
[0057]在某些實施例中，向受試者給予本文提供的任何化合物減少了膠原蛋白表達(dá)。
[0058]在某些實施例中，受試者需要改善的器官功能，其中該器官功能選自心臟功能、肺功能、肝功能以及腎功能。在某些實施例中，給予本文提供的任何化合物改善受試者的器官功能，其中該器官功能選自心臟功能、肺功能、肝功能以及腎功能。
[0059]本文提供的任何方法包括評估受試者的腎功能，可包括測量受試者血液中的血液尿素氮；測量受試者血液中的肌酐；測量受試者的肌酐清除率；測量受試者的蛋白尿；測量受試者的白蛋白:Cr比率；和/或測量受試者的尿排泄量。
[0060]本文提供的任何方法可包括評估受試者的肝功能，可包括:測量受試者血液中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量；測量受試者血液中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量；測量受試者血液中的膽紅素含量；測量受試者血液中的白蛋白含量；測量受試者的凝血酶原時間；測量受試者的腹水；和/或測量受試者的腦病。
[0061]本文提供的任何方法可包括評估受試者的肺功能，可包括:測量受試者的肺活量；測量受試者的用力肺活量；測量受試者的一秒內(nèi)用力呼氣量；測量受試者的峰值呼氣流速；測量受試者的用力呼氣流量；測量受試者的最大隨意通氣量；測定受試者的一秒內(nèi)用力呼氣量與用力肺活量的比率；測量受試者的通氣/灌注比率；測量受試者的氮氣廓清；測量受試者一個或多個肺中的絕對空氣容積。
[0062]本文提供的任何方法可包括評估受試者的心臟功能，可包括:測量受試者的心輸出量；測量受試者的心搏排血量；測量受試者的平均收縮期射血率；測量受試者的收縮期血壓；測量受試者的左心室射血分?jǐn)?shù)；測定受試者的心搏指數(shù)；測定受試者的心臟指數(shù)；測量受試者的左心室縮短百分率；測量受試者的周徑纖維平均縮短速度；測量受試者的左心室流入血流速度圖；測量受試者的肺靜脈血流速度圖；測量受試者二尖瓣環(huán)的舒張早期峰值速度。
[0063]本文提供的任何方法可包括向受試者給予至少一種選自以下項的治療劑:抗炎劑、免疫抑制劑、抗糖尿病劑、地高辛(digoxin)、血管舒張藥、血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)、鈣通道阻滯劑、異山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪(hydralazine)、硝酸酯、肼屈嗪、β -阻滯劑、利鈉肽、類肝素以及結(jié)締組織生長因子抑制劑。在某些實施例中，抗炎劑是非類固醇抗炎劑，其中該非類固醇抗炎劑可任選地選自布洛芬(ibupiOfen)、C0X-1抑制劑或C0X-2抑制劑。在某些實施例中，免疫抑制劑選自皮質(zhì)類固醇、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)以及霉酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)。在某些實施例中，抗炎劑是皮質(zhì)類固醇，其中該皮質(zhì)類固醇可任選地為強的松(prednisone)。在某些實施例中，血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑選自卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴諾普利(Iisinopril)、貝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)以及雷米普利(ramipril)。在某些實施例中，血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)選自坎地沙坦(candesartan)、伊貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(1sartan)、繳沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)以及依普沙坦(eprosartan)。
[0064]在某些實施例中，疾病為癌癥。在某些實施例中，癌癥是肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腦癌、血液性癌癥、胰臟癌、頭頸癌、舌癌、胃癌、皮膚癌或甲狀腺癌。在某些實施例中，肝癌是肝細(xì)胞癌。在某些實施例中，腦癌是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在某些實施例中，血液性癌癥是急性骨髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin’ s lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin，s lymphoma)。
[0065]在某些實施例中，本文提供的方法包括向受試者給予至少一種其他抗癌療法。在某些實施例中，抗癌療法為DNA損傷劑、增殖抑制劑、抗葉酸劑、生長因子受體抑制劑、抗血管生成劑、受體酪氨酸激酶抑制劑、激酶抑制劑、生長因子抑制劑、細(xì)胞毒性劑、放射療法或手術(shù)切除腫瘤。在某些實施例中，DNA損傷劑是1，3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安(busulfan)、卡鉬(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉬(cisplatin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、道諾霉素(daunorubicin)、小紅毒(doxorubicin)、表柔t(yī)匕星(epirubicin)、依托泊音(etoposide)、伊達(dá)比星(idarubicin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(1mustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素 C (mitomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、替莫唑胺(temozolomide)或拓?fù)涮婵?topotecan)。在某些實施例中，抗葉酸劑是甲氨蝶呤(methotrexate)、氨基蝶呤(aminopterin)、胸苷酸合成酶、絲氨酸輕甲基轉(zhuǎn)移酶、葉酰聚谷氨酰基合成酶、g_谷氨?；饷?、甘氨酰胺-核糖核苷酸轉(zhuǎn)甲?；?、甲酰四氫葉酸、氨基-咪唑-甲酰胺-核糖核苷酸轉(zhuǎn)甲?；浮?-氟尿嘧啶或葉酸轉(zhuǎn)運體。在某些實施例中，生長因子受體抑制劑為埃羅替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。在某些實施例中，血管生成抑制劑是貝伐單抗(bevacizumab)、沙利度胺(thalidomide)、羧酰氨基三唑、TNP-470、CMlOUIFN-α、血小板因子-4、蘇拉明(suramin)、SU5416、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)、VEGFR拮抗劑、軟骨源性血管生成抑制因子、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、血管生成抑制素(angiostatin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、2_ 甲氧基雌二醇、替可加蘭(tecogalan)、四硫鉬酸鹽、催乳激素或利諾胺(linomide)。在某些實施例中，激酶抑制劑是貝伐單抗、BIBW2992、西妥昔單抗(cetuximab)、伊馬替尼(imatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉非替尼、蘭尼單抗(ranibizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、索拉菲尼(sorafenib)、達(dá)沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、尼羅替尼(nilotinib)、拉帕替尼(Iapatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)、莫立替尼(mubritinib)或福馬替尼(fostamatinib)。 [0066]在某些實施例中，向患有癌癥的受試者給予使得腫瘤尺寸和/或腫瘤數(shù)減小。在某些實施例中，向患有癌癥的受試者給予預(yù)防或延遲腫瘤尺寸和/或腫瘤數(shù)增加。在某些實施例中，向患有癌癥的受試者給予預(yù)防或減緩轉(zhuǎn)移性進(jìn)展。在某些實施例中，向患有癌癥的受試者給予延長受試者的總體存活時間和/或無進(jìn)展存活期。在某些實施例中，本文提供的方法包括選擇血清α -胎蛋白升高和/或血清脫-Y -羧基凝血酶原升高的受試者。在某些實施例中，本文提供的方法包括使血清α -胎蛋白和/或血清脫-Υ -羧基凝血酶原降低。在某些實施例中，本文提供的方法包括選擇肝功能異常的動物。
[0067]在本文提供的任何方法中，受試者是人。
[0068]在本文提供的任何方法中，化合物作為藥物組合物形式存在。
[0069]本文提供的任何化合物可用于療法中。本文提供的任何化合物可用于治療纖維化。本文提供的任何化合物可用于促進(jìn)傷口愈合。本文提供的任何化合物可用于治療癌癥。本文提供的任何化合物可用于預(yù)防和/或延遲轉(zhuǎn)移發(fā)作。
[0070]本文提供的任何化合物可用于治療心臟病。
[0071]本文提供的任何化合物可用于制備藥物。本文提供的任何化合物可用于制備治療纖維化的藥物。本文提供的任何化合物可用于制備促進(jìn)傷口愈合的藥物。本文提供的任何化合物可用于制備治療癌癥的藥物。本文提供的任何化合物可用于制備預(yù)防和/或延遲轉(zhuǎn)移發(fā)作的藥物。
[0072]附圖簡要說明
[0073]圖1展示如實例5中所述，給予抗miR21化合物的缺血再灌注/腎切除術(shù)(IR/Nx)模型小鼠的尿白蛋白:肌酐比率(ACR, μ gAlb/mgCr) 0
[0074]圖2展示如實例6中所述，在被給予抗miR21化合物的UUO模型小鼠腎中的(A)膠原蛋白IAl和⑶膠原蛋白3A1表達(dá)。
[0075]詳細(xì)說明
[0076]除非另外規(guī)定，否則本文中所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所了解的相同的意義。除非提供特定定義，否則結(jié)合本文所述的分析化學(xué)、合成有機化學(xué)以及醫(yī)療及藥物化學(xué)使用的命名法以及這些領(lǐng)域的程序及技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的和通常所使用的。在本文中的術(shù)語存在復(fù)數(shù)個定義的情況下，以本部分中的定義為準(zhǔn)?？墒褂没瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、調(diào)配和遞送以及治療受試者的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。某些此類技術(shù)和程序可見于例如以下文獻(xiàn)中:“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”(“在反義研究中碳水化合物修飾”)，Sangvi及Cook編，American Chemical Society (《美國化學(xué)學(xué)會》),Washington D.C.(華盛頓)，1994 ；及 “Remington’s PharmaceuticalSciences”(《雷明頓藥物科學(xué)》)，Mack Publishing C0.(Mack出版公司)，Easton (伊斯頓)，Pa.(賓夕法尼亞州)，第18版，1990;且其出于任何目的通過引用結(jié)合在此。除非另外說明，否則本文整篇披露中提及的所有專利、專利申請、公開申請及公開案、GENBANK序列、網(wǎng)站及其他公開材料在允許時均通過引用以其全文結(jié)合在此。在提及URL或其他類似識別符或地址的情況下，應(yīng)了解這種識別符可改變并且因特網(wǎng)上的特定信息可改變，但可通過搜尋因特網(wǎng)找到等效信息。對其的提及證明這種信息的可用性及公開傳播。
[0077]在披露和描述本發(fā)明的組合物和方法之前，應(yīng)了解本文所用的術(shù)語僅出于描述特定實施例的目的而不欲具有限制性。須注意，除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(a)”、“一種(an)”以及“該(the) ”包括復(fù)數(shù)個指示物。
[0078]定義
[0079]“纖維化”意指在器官或組織中形成或產(chǎn)生過量纖維結(jié)締組織。在某些實施例中，纖維化作為修復(fù)或反應(yīng)性過程出現(xiàn)。在某些實施例中，纖維化響應(yīng)于損害或損傷而出現(xiàn)。術(shù)語“纖維化”應(yīng)理解為在器官或組織中作為修復(fù)或反應(yīng)性過程形成或產(chǎn)生過量纖維結(jié)締組織，而非形成纖維組織作為器官或組織的正常組分。
[0080]“懷疑患有……的受試者”意指展現(xiàn)疾病的一種或多種臨床指標(biāo)的受試者。
[0081]“懷疑患有纖維化的受試者”意指展現(xiàn)纖維化的一種或多種臨床指標(biāo)的受試者。
[0082]“成纖維細(xì)胞”意指產(chǎn)生結(jié)締組織的細(xì)胞。
[0083]“纖維增生性病癥”意指特征在于成纖維細(xì)胞的過度增殖和/或活化的病癥。
[0084]“肝癌”意指肝臟的惡性腫瘤，為原發(fā)癌或轉(zhuǎn)移癌。在某些實施例中，肝癌包括(但不限于)起因于肝細(xì)胞的癌癥，諸如肝細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌；纖維板層癌；及膽管細(xì)胞癌(或膽管癌)。
[0085]“轉(zhuǎn)移”意指癌癥自其首先產(chǎn)生為原發(fā)性腫瘤的位置擴(kuò)散至體內(nèi)其他位置的過程。原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移性進(jìn)展反映多個階段，包括自相鄰原發(fā)性腫瘤細(xì)胞解離、在循環(huán)中存活以及在繼發(fā)位置生長。
[0086]“總體存活時間”意指受試者在診斷出疾病或針對疾病進(jìn)行治療后存活的時間。在某些實施例中，疾病是癌癥。在一些實施例中，總體存活時間是診斷后的存活期。在一些實施例中，總體存活時間是治療開始后的存活期。
[0087]“無進(jìn)展存活期”意指患有疾病的受試者在疾病不發(fā)生惡化的情況下存活的時間。在某些實施例中，無進(jìn)展存活期系是通過對疾病進(jìn)行分期或評分來評定。在某些實施例中，患有肝癌之受試者的無進(jìn)展存活期系通過評估腫瘤尺寸、腫瘤數(shù)和/或轉(zhuǎn)移來評定。
[0088]“抗miR劑”意指具有與微RNA互補的核苷堿基序列的寡核苷酸。在某些實施例中，抗HiiR劑為經(jīng)修飾的寡核苷酸。
[0089]當(dāng)“miR-X”表示特定微RNA時，“抗miR-X劑”意指具有與miR-X互補的核苷堿基序列的寡核苷酸。在某些實施例中，抗miR-X劑與miR-X完全互補。在某些實施例中，抗miR-X劑與miR-X至少80%、至少85%、至少90%或至少95%互補。在某些實施例中，抗miR-X劑是經(jīng)修飾的寡核苷酸。
[0090]“miR-21”意指具有核苷堿基序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO:1)的成熟miRNA。
[0091 ] “miR-21 莖-環(huán)序列”意指具有核苷堿基序列 UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO:2)的莖-環(huán)序列。
[0092]“靶標(biāo)核酸”意指這樣一種核酸:寡聚化合物被設(shè)計為與該核酸雜交。
[0093]“靶向”意指設(shè)計并且選擇將與靶標(biāo)核酸雜交的核苷堿基序列的過程。
[0094]“靶向于”意指具有允許與靶標(biāo)核酸雜交的核苷堿基序列。
[0095]“祀標(biāo)卩齒合(target engagement) ”意指寡核苷酸同與其互補的微RNA以改變該微RNA的活性、表達(dá)或含量的方式相互作用。在某些實施例中，靶標(biāo)嚙合意指抗miR劑同與其互補的微RNA相互作用，使得該微RNA的活性受到抑制。
[0096]“調(diào)節(jié)”意指擾動功能、量或活性。在某些實施例中，調(diào)節(jié)意指功能、量或活性增加。在某些實施例中，調(diào)節(jié)意指功能、量或活性降低。
[0097]“表達(dá)”意指基因所編碼的信息借以轉(zhuǎn)化為細(xì)胞中存在和運轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)的任何功能和步驟。
[0098]“5’靶標(biāo)位點”意指靶標(biāo)核酸中與特定寡核苷酸的3’最末端核苷堿基互補的核苷喊基。
[0099]“3’靶標(biāo)位點”意指靶標(biāo)核酸中與特定寡核苷酸的5’最末端核苷堿基互補的核苷喊基。
[0100]“區(qū)”意指核酸內(nèi)一部分連接的核苷。在某些實施例中，寡核苷酸具有與靶標(biāo)核酸的區(qū)互補的核苷堿基序列。例如，在某些此類實施例中，寡核苷酸與微RNA莖-環(huán)序列的區(qū)互補。在某些此類實施例中，寡核苷酸與微RNA莖-環(huán)序列的區(qū)完全互補。
[0101]“區(qū)段”意指區(qū)的較小部分或子部分。
[0102]“核苷堿基序列”意指寡聚化合物或核酸中連續(xù)核苷堿基的次序，通常按5’至3’方向列出，而與任何糖、鍵和/或核苷堿基修飾無關(guān)。
[0103]“連續(xù)核苷堿基”意指核酸中彼此緊鄰的核苷堿基。
[0104]“核苷堿基互補 性”意指兩個核苷堿基經(jīng)由氫鍵連結(jié)非共價配對的能力。
[0105]“互補”意指一個核酸能夠與另一核酸或寡核苷酸雜交。在某些實施例中，互補指寡核苷酸能夠與靶標(biāo)核酸雜交。
[0106]“完全互補”意指寡核苷酸的每個核苷堿基均能夠與靶標(biāo)核酸中每個相應(yīng)位置處的核苷堿基配對。在某些實施例中，寡核苷酸與微RNA完全互補，亦即寡核苷酸的每個核苷堿基與微RNA中相應(yīng)位置處的核苷堿基均互補。在某些實施例中，每個核苷堿基與微RNA莖-環(huán)序列的區(qū)內(nèi)的核苷堿基均具有互補性的寡核苷酸與該微RNA莖-環(huán)序列完全互補。
[0107]“互補性百分比”意指寡核苷酸中與靶標(biāo)核酸的等長部分互補的核苷堿基的百分率?；パa性百分比通過將寡核苷酸中與靶標(biāo)核酸中相應(yīng)位置處的核苷堿基互補的核苷堿基的數(shù)目除以寡核苷酸中核苷堿基的總數(shù)來計算。
[0108]“一致性百分比”意指第一核酸中與第二核酸中相應(yīng)位置處的核苷堿基一致的核苷堿基的數(shù)目除以第一核酸中核苷堿基的總數(shù)。在某些實施例中，第一核酸為微RNA且第二核酸為微RNA。在某些實施例中，第一核酸為寡核苷酸且第二核酸為寡核苷酸。
[0109]“雜交”意指通過核苷堿基互補性而發(fā)生的互補核酸的退火。
[0110]“錯配”意指第一核酸中的核苷堿基不能與第二核酸中相應(yīng)位置處的核苷堿基配對。
[0111]“一致”在核苷堿基序列的情況下意指具有相同核苷堿基序列，而與糖、鍵和/或核苷堿基修飾無關(guān)且與所存在的任何嘧啶的甲基狀態(tài)無關(guān)。
[0112]“微RNA”意指長度在18與25個核苷堿基之間的內(nèi)源性非編碼RNA，它是由酶Dicer裂解微RNA前體的產(chǎn)物。成熟微RNA的實例可見于稱為miRBase的微RNA數(shù)據(jù)庫中(http://microrna.sanger.ac.uk/)。在某些實施例中，微 RNA 縮寫為“微 RNA” 或“miR”。
[0113]“微RNA前體”或“miR前體”意指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其為由稱為Drosha的雙鏈RNA特異性核糖核酸酶裂解初級miR的產(chǎn)物。
[0114]“莖-環(huán)序列”意指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)且含有成熟微RNA序列的RNA。微RNA前體序列及莖-環(huán)序列可能重疊。莖-環(huán)序列的實例可見于稱為miRBase的微RNA數(shù)據(jù)庫中(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
[0115]“初級微RNA”或“初級miR”意指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其為雙鏈RNA特異性核糖核酸酶Drosha的底物。
[0116]“微RNA前體”意指來源于基因組DNA且包含含一個或多個微RNA序列的非編碼結(jié)構(gòu)化RNA的轉(zhuǎn)錄物。例如，在某些實施例中，微RNA前體是微RNA前體。在某些實施例中，微RNA前體是初級微RNA。
[0117]“微RNA調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物”意指受微RNA調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物。
[0118]“單順反子轉(zhuǎn)錄物”意指含有單一微RNA序列的微RNA前體。
[0119]“多順反子轉(zhuǎn)錄物”意指含有兩個或兩個以上微RNA序列的微RNA前體。[0120]“種子序列”意指包含成熟微RNA序列的5’端的核苷堿基I至9中6至8個連續(xù)核苷堿基的核苷堿基序列。
[0121]“種子匹配序列”意指與種子序列互補并且長度與種子序列相同的核苷堿基序列。
[0122]“寡聚化合物”意指包含復(fù)數(shù)個連接的單體亞基的化合物。寡聚化合物包括寡核苷酸。
[0123]“寡核苷酸”意指包含復(fù)數(shù)個連接的核苷的化合物，其中各核苷可彼此獨立地經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾。
[0124]“天然存在的核苷間鍵”意指核苷之間的3’至5’磷酸二酯鍵。
[0125]“天然糖”意指DNA (2’ -H)或RNA (2’ -0H)中存在的糖。
[0126]“核苷間鍵”意指相鄰核苷之間的共價鍵。
[0127]“連接的核苷”意指由共價鍵連接的核苷。
[0128]“核苷堿基”意指能夠與另一核苷堿基非共價配對的雜環(huán)部分。
[0129]“核苷”意指連接于糖部分的核苷堿基。
[0130]“核苷酸”意指具有共價連接于核苷的糖部分的磷酸酯基的核苷。
[0131]“包含由多個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物”意指包括具有指定數(shù)目的連接核苷的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物。因此，該化合物可包括另外的取代基或結(jié)合物。除非另外說明，否則該化合物不包括除寡核苷酸的那些核苷以外的任何其他核苷。
[0132]“包含由多個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物”意指包括具有指定數(shù)目的連接核苷的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物。因此，該化合物可包括另外的取代基或結(jié)合物。除非另外說明，否則該化合物不包括除經(jīng)修飾寡核苷酸的那些核苷以外的任何其他核苷。
[0133]“經(jīng)修飾的寡核苷酸”意指相對于天然存在的末端、糖、核苷堿基和/或核苷間鍵具有一種或多種修飾的寡核苷酸。經(jīng)修飾的寡核苷酸可包含未經(jīng)修飾的核苷。
[0134]“單鏈經(jīng)修飾寡核苷酸”意指未與互補鏈雜交的經(jīng)修飾寡核苷酸。
[0135]“經(jīng)修飾的核苷”意指與天然存在的核苷相比具有任何變化的核苷。經(jīng)修飾的核苷可具有經(jīng)修飾的糖及未經(jīng)修飾的核苷堿基。經(jīng)修飾的核苷可具有經(jīng)修飾的糖及經(jīng)修飾的核苷堿基。經(jīng)修飾的核苷可具有天然糖以及經(jīng)修飾的核苷堿基。在某些實施例中，經(jīng)修飾的核苷是雙環(huán)核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的核苷是非雙環(huán)核苷。
[0136]“經(jīng)修飾的核苷間鍵”意指與天然存在的核苷間鍵相比存在任何變化。
[0137]“硫代磷酸酯核苷間鍵”意指核苷間一個非橋連原子是硫原子的鍵。
[0138]“經(jīng)修飾的糖部分”意指與天然糖相比的取代和/或任何變化。[0139]“未經(jīng)修飾的核苷堿基”意指RNA或DNA的天然存在的雜環(huán)堿基:嘌呤堿基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)及尿嘧啶⑶。
[0140]“5-甲基胞嘧啶”意指包含連接于5位的甲基的胞嘧啶。
[0141]“非甲基化胞嘧啶”意指不具有連接于5位的甲基的胞嘧啶。
[0142]“經(jīng)修飾的核苷堿基”意指不為未經(jīng)修飾的核苷堿基的任何核苷堿基。
[0143]“呋喃醣基”意指包含由四個碳原子及一個氧原子組成的5員環(huán)的結(jié)構(gòu)。
[0144]“天然存在的呋喃醣基”意指如在天然存在的RNA中所發(fā)現(xiàn)的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中所發(fā)現(xiàn)的脫氧呋喃核糖基。
[0145]“糖部分”意指天然存在的呋喃醣基或經(jīng)修飾的糖部分。
[0146]“經(jīng)修飾的糖部分”意指經(jīng)取代的糖部分或糖替代物。
[0147]“經(jīng)取代的糖部分”意指不為天然存在的呋喃醣基的呋喃醣基。經(jīng)取代的糖部分包括(但不限于)在天然存在的呋喃醣基的2’位、5’位和/或4’位包含修飾的糖部分。某些經(jīng)取代的糖部分是雙環(huán)糖部分。
[0148]“糖替代物”意指不 包含呋喃醣基且能夠置換核苷中天然存在的呋喃醣基的結(jié)構(gòu)，所述置換使得所得核苷能夠(I)并入寡核苷酸中及(2)與互補核苷雜交。此類結(jié)構(gòu)包括呋喃醣基的相對簡單的變化，諸如包含不同數(shù)目的原子的環(huán)(例如4員、6員或7員環(huán))；呋喃醣基的氧置換為非氧原子(例如碳、硫或氮)；或原子數(shù)變化及置換氧兩者。此類結(jié)構(gòu)還可包含對應(yīng)于針對經(jīng)取代的糖部分所述的取代的取代(例如可任選地包含其他取代基的6員碳環(huán)雙環(huán)糖替代物)。糖替代物還包括更復(fù)雜的糖置換(例如肽核酸的非環(huán)系統(tǒng))。糖替代物包括(但不限于)嗎啉基、環(huán)己烯基及環(huán)己醣醇(cyclohexitol)。
[0149]“2’ -O-甲基糖”或“2’ -OMe糖”意指在2’位具有O-甲基修飾的糖。
[0150]“2’ -O-甲氧基乙基糖”或“2’ -MOE糖”意指在2’位具有O-甲氧基乙基修飾的糖。
[0151]“2’-O-氟”或“2’-F”意指在2’位具有氟修飾的糖。
[0152]“雙環(huán)糖部分”意指包含4至7員環(huán)的經(jīng)修飾糖部分(包括(但不限于)呋喃醣基)，其包含連接該4至7員環(huán)的兩個原子的橋鍵以形成第二環(huán)，從而產(chǎn)生雙環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實施例中，4至7員環(huán)是糖環(huán)。在某些實施例中,4至7員環(huán)是呋喃醣基。在某些此類實施例中，橋鍵連接呋喃醣基的2’碳與4’碳。
[0153]“鎖核酸(LNA)糖部分”意指在4’與2’呋喃醣環(huán)原子之間包含(CH2)-O橋的經(jīng)取代的糖部分。
[0154]“ΕΝΑ糖部分”意指在4’與2’呋喃醣環(huán)原子之間包含(CH2)2-O橋的經(jīng)取代的糖部分。
[0155]“約束乙基(cEt)糖部分”意指在4’與2’呋喃醣環(huán)原子之間包含CH(CH3)-O橋的經(jīng)取代的糖部分。在某些實施例中，CH(CH3)-O橋約束呈S型取向。在某些實施例中，(CH2)2-O約束呈R型取向。
[0156]“S-cEt糖部分”意指在4’與2’呋喃醣環(huán)原子之間包含S型限制性CH(CH3) -O橋的經(jīng)取代的糖部分。
[0157]“R-cEt糖部分”意指在4’與2’呋喃醣環(huán)原子之間包含R型限制性CH(CH3) -O橋的經(jīng)取代的糖部分。[0158]“2’ -O-甲基”核苷意指具有2’ -O-甲基糖修飾的2’位上經(jīng)修飾的核苷。
[0159]“2’-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2’-O-甲氧基乙基糖修飾的2’位上經(jīng)修飾的核苷。2’-O-甲氧基乙基核苷可包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的核苷堿基。
[0160]“2’ -氟核苷”意指具有2’ -氟糖修飾的2’位上經(jīng)修飾的核苷。2’ -氟核苷可包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的核苷堿基。
[0161]“雙環(huán)核苷”意指具有雙環(huán)糖部分的2’位上經(jīng)修飾的核苷。雙環(huán)核苷可具有經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的核苷堿基。
[0162]“cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的核昔喊基。
[0163]“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分的核苷。
[0164]“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分的核苷。
[0165]“非雙環(huán)核苷”意指具有除雙環(huán)糖以外的糖的核苷。在某些實施例中，非雙環(huán)核苷包含天然存在的糖。在某些實施例中，非雙環(huán)核苷包含經(jīng)修飾的糖。在某些實施例中，非雙環(huán)核苷是β-D-脫氧核糖核苷。在某些實施例中，非雙環(huán)核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷。
[0166]“ β -D-脫氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。β -D-脫氧核糖核苷可包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的核苷堿基。 [0167]“ β -D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。β -D-核糖核苷可包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的核苷堿基。
[0168]“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
[0169]“ΕΝΑ核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
[0170]“基序”意指寡核苷酸中經(jīng)修飾和/或未經(jīng)修飾的核苷堿基、糖和/或核苷間鍵的型態(tài)。在某些實施例中，基序為核苷型態(tài)。
[0171]“核苷型態(tài)”意指經(jīng)修飾的寡核苷酸或其區(qū)中核苷修飾的型態(tài)。核苷型態(tài)是描述寡核苷酸中核苷修飾的排列的基序。
[0172]“完全修飾的寡核苷酸”意指每個核苷堿基、每個糖和/或每個核苷間鍵均經(jīng)修飾。
[0173]“均一修飾的寡核苷酸”意指在整個經(jīng)修飾的寡核苷酸中每個核苷堿基、每個糖和/或每個核苷間鍵均具有相同修飾。
[0174]“穩(wěn)定化修飾”意指使經(jīng)修飾的寡核苷酸在核酸酶存在下的穩(wěn)定性相對于由磷酸二酯核苷間鍵連接的2’ -脫氧核苷所提供的穩(wěn)定性有所增強的核苷修飾。例如，在某些實施例中，穩(wěn)定化修飾為穩(wěn)定化核苷修飾。在某些實施例中，穩(wěn)定化修飾為核苷間鍵修飾。
[0175]“穩(wěn)定化核苷”意指經(jīng)修飾以使寡核苷酸的核酸酶穩(wěn)定性相對于由2’ -脫氧核苷提供的穩(wěn)定性有所增強的核苷。在一個實施例中，穩(wěn)定化核苷是2’位上經(jīng)修飾的核苷。
[0176]“穩(wěn)定化核苷間鍵”意指使寡核苷酸的核酸酶穩(wěn)定性相對于由磷酸二酯核苷間鍵提供的穩(wěn)定性有所改良的核苷間鍵。在一個實施例中，穩(wěn)定化核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。
[0177]“受試者”意指選用于治療或療法的人類或非人類動物。
[0178]“有需要的受試者”意指受試者被鑒別為需要療法或治療的狀態(tài)。
[0179]“懷疑患有……的受試者”意指展現(xiàn)疾病的一種或多種臨床指標(biāo)的受試者。
[0180]“給予”意指向受試者提供醫(yī)藥藥劑或組合物，且包括(但不限于)由醫(yī)學(xué)專業(yè)人員給予以及自給予。
[0181 ] “腸胃外給予”意指經(jīng)由注射或輸注給予。
[0182]腸胃外給予包括(但不限于)皮下給予、靜脈內(nèi)給予或肌肉內(nèi)給予。
[0183]“皮下給予”意指恰給予于皮膚下方。
[0184]“靜脈內(nèi)給予”意指給予至靜脈中。
[0185]“心臟內(nèi)給予”意指給予至心臟中。在某些實施例中，心臟內(nèi)給予借助于導(dǎo)管進(jìn)行。在某些實施例中，心臟內(nèi)給予借助于開心手術(shù)進(jìn)行。
[0186]“肺部給予”意指給予至肺部。
[0187]“并行給予”系指兩種藥劑以其兩者的藥理學(xué)作用在患者體內(nèi)同時表現(xiàn)的任何方式共同給予。并行給予不需要該兩種藥劑于單一藥物組合物中、以相同劑型或通過相同給藥途徑給予。兩種藥劑的作用本身無需同時表現(xiàn)。這些作用僅需重疊一段時間而無需共同延長。
[0188]“持續(xù)時間”意指活性或事件持續(xù)的時段。在某些實施例中，治療的持續(xù)時間是給予醫(yī)藥藥劑或藥物組合物的劑量的時段。
[0189]“療法”意指疾病治療方法。在某些實施例中，療法包括(但不限于)化學(xué)療法、放射療法或給予醫(yī)藥藥劑。
[0190]“治療”意指 施用一種或多種用于治愈或改善疾病的特定程序。在某些實施例中，特定程序為給予一種或多種醫(yī)藥藥劑。
[0191]“改善”意指減輕病狀或疾病的至少一種指標(biāo)的嚴(yán)重性。在某些實施例中，改善包括延遲或減緩病狀或疾病的一種或多種指標(biāo)的進(jìn)展。指標(biāo)的嚴(yán)重性可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的主觀或客觀量度來確定。
[0192]“有產(chǎn)生……的風(fēng)險”意指受試者易于產(chǎn)生病狀或疾病的狀態(tài)。在某些實施例中，有產(chǎn)生病狀或疾病的風(fēng)險的受試者展現(xiàn)該病狀或疾病的一種或多種癥狀，但并不展現(xiàn)足以診斷為患有該病狀或疾病的數(shù)目的癥狀。在某些實施例中，有產(chǎn)生病狀或疾病的風(fēng)險的受試者展現(xiàn)該病狀或疾病的一種或多種癥狀，但程度輕于診斷為患有該病狀或疾病所需的程度。
[0193]“預(yù)防……發(fā)作”意指預(yù)防有產(chǎn)生疾病或病狀的風(fēng)險的受試者產(chǎn)生該病狀或疾病。在某些實施例中，有產(chǎn)生疾病或病狀的風(fēng)險的受試者接受與已患該疾病或病狀的受試者所接受的治療類似的治療。
[0194]“延遲……發(fā)作”意指延遲有產(chǎn)生疾病或病狀的風(fēng)險的受試者產(chǎn)生該病狀或疾病。在某些實施例中，有產(chǎn)生疾病或病狀的風(fēng)險的受試者接受與已患該疾病或病狀的受試者所接受的治療類似的治療。
[0195]“治療劑”意指用于治愈、改善或預(yù)防疾病的醫(yī)藥藥劑。
[0196]“劑量”意指單次給藥中所提供的醫(yī)藥藥劑的指定量。在某些實施例中，劑量可以兩次或兩次以上快速注射(bolus)、片劑或注射來給予。例如，在需要皮下給予的某些實施例中，所要劑量所需的體積不易通過單次注射提供。在此類實施例中，可使用兩次或兩次以上注射來達(dá)成所要劑量。在某些實施例中，劑量可以兩次或兩次以上注射給予以使受試者的注射部位反應(yīng)最小。在某些實施例中，劑量是以緩慢輸注形式給予。
[0197]“劑量單位”意指提供醫(yī)藥藥劑時所采用的形式。在某些實施例中，劑量單位為容納凍干寡核苷酸的小瓶。在某些實施例中，劑量單位為容納復(fù)原寡核苷酸的小瓶。
[0198]“治療有效量”是指醫(yī)藥藥劑向動物提供治療益處的量。
[0199]“藥物組合物”意指包括醫(yī)藥藥劑的適于給予受試者的物質(zhì)的混合物。例如，藥物組合物可包含無菌水溶液。
[0200]“醫(yī)藥藥劑”意指在給予受試者時提供治療作用的物質(zhì)。
[0201]“活性醫(yī)藥成分”意指藥物組合物中提供所要作用的物質(zhì)。
[0202]“器官功能改善”意指器官功能朝向正常限度變化。在某些實施例中，通過測量受試者血液中存在的分子來評定器官功能。例如，在某些實施例中，肝功能改善是通過血液肝轉(zhuǎn)氨酶含量降低來測量。
[0203]“可接受的安全性概況”意指臨床上可接受的限度內(nèi)的副作用型態(tài)。
[0204]“副作用”意指除所要作用以外的歸因于治療的生理反應(yīng)。在某些實施例中，副作用包括(但不限于)注射部位反應(yīng)、肝功能測試異常、腎功能異常、肝中毒、腎中毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常以及肌病。此類副作用可直接或間接檢測。例如，血清中的轉(zhuǎn)氨酶含量升高可指示肝中毒或肝功能異常。例如，膽紅素增加可指示肝中毒或肝功能異常。
[0205]“注射部位反應(yīng)”意指受試者的注射部位處皮膚的炎癥或異常發(fā)紅。
[0206]“受試者依從性”意指受試者遵循推薦或規(guī)定的療法。
[0207]“依從”意指受試者遵循推薦的療法。
[0208]“推薦的療法”意指醫(yī)學(xué)專業(yè)人員關(guān)于治療、改善、延遲或預(yù)防疾病所推薦的治療。
[0209]概論
[0210]miR-21是廣泛表達(dá)的微RNA，其與多種細(xì)胞過程有關(guān)，包括細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞凋亡以及基質(zhì)周轉(zhuǎn)。另外，miR-21與多種疾病相關(guān)。miR-21在癌癥中常常上調(diào)，且抑制miR-21已在若干癌癥動物模型中展現(xiàn)出腫瘤生長抑制作用。在心臟肥大動物模型中抑制miR-21表明miR-21在心臟病中的作用。已在心臟纖維化、腎纖維化及肺纖維化的動物模型中表明在纖維化中的作用。在組織外植體模型中抑制miR-21的研究說明抑制miR-21會促進(jìn)傷口愈合。因此，miR-21的抑制劑適用于多種研究及臨床配置中。
[0211]為鑒別miR-21的有效抑制劑，設(shè)計了大量抗miR-21化合物。這些化合物在長度以及雙環(huán)核苷和非雙環(huán)核苷的數(shù)目、位置及身份方面不同。將最初的一系列化合物在活體外熒光素酶分析中進(jìn)行測試，鑒別出一個化合物子集為活性化合物的活體外活性化合物。接著在活體內(nèi)分析中測試這些活體外活性化合物以鑒別在活體內(nèi)作為miR-21的有效抑制劑的那些化合物。根據(jù)最初的活體外及活體內(nèi)篩選，選擇某些化合物作為設(shè)計其他化合物的基礎(chǔ)。使用結(jié)構(gòu)與活性(活體外活性和活體內(nèi)活性兩者)之間根據(jù)實驗觀測到的相關(guān)性來預(yù)測這些其他化合物的設(shè)計，這些其他化合物在長度以及雙環(huán)和非雙環(huán)核苷的選擇和排列方面具有進(jìn)一步的變化。接著對這些其他化合物重復(fù)活體外及活體內(nèi)篩選分析。還測試某些化合物的其他性質(zhì)，例如對核酸外切酶活性的敏感性。觀察到在活體外最具活性的化合物在活體外最具活性并不一定為在活體內(nèi)最具活性的化合物在活體內(nèi)最具活性者，且還觀測到一些在活體外具中等活性的化合物在活體外具中等活性為在活體內(nèi)具高度活性的化合物。在此過程中活體外篩選的178種化合物中，60種被鑒別為在熒光素酶分析中具活性。在這些60種活性活體外化合物中，鑒別出一個子集在活體內(nèi)具活性。經(jīng)由設(shè)計和篩選化合物的此重復(fù)過程， 觀察到具有特定雙環(huán)和非雙環(huán)型態(tài)的化合物在活體內(nèi)為miR-21的有效抑制劑。因此，這些化合物適用于調(diào)節(jié)由miR-21活性促進(jìn)的細(xì)胞過程。此外，此類化合物適用于治療與miR-21相關(guān)的疾病、預(yù)防和/或延遲該等疾病發(fā)作。此類疾病的特征可在于相對于無病樣品異常高的miR-21表達(dá)。此類疾病包括(但不限于)纖維化、急性腎損傷、心臟肥大、心肌梗塞以及癌癥。另外，本文提供的組合物和方法可用于促進(jìn)傷口愈合。
[0212]靶向miR-21的某些經(jīng)修飾寡核苷酸
[0213]本文提供具有某些雙環(huán)及非雙環(huán)核苷型態(tài)的經(jīng)修飾寡核苷酸。具有本文鑒別的型態(tài)的經(jīng)修飾寡核苷酸是miR-21活性的有效抑制劑。
[0214]本文說明的各核苷型態(tài)按5’至3’方向展示。
[0215]在某些實施例中，本文提供包含由8至22個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)I的至少8個連續(xù)核苷:
[0216](R) x-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Nq_Nz
[0217]其中每個R是非雙環(huán)核苷；X是I至4 ; [0218]每個Nb是雙環(huán)核苷；
[0219]每個Nq是非雙環(huán)核苷；且
[0220]每個Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0221 ] 在核苷型態(tài)I的某些實施例中，X是I。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，X是2。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，X是3。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，X是4。
[0222]在某些實施例中，本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)II的至少8個連續(xù)核苷:
[0223]Nm-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Nq_Nz
[0224]其中Nm是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；
[0225]每個Nb是雙環(huán)核苷；
[0226]每個Nq是非雙環(huán)核苷；且
[0227]Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0228]在某些實施例中，本文提供包含由8至22個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)III的至少8個連續(xù)核苷:
[0229](R) x-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Ny_Nz
[0230]其中每個R是非雙環(huán)核苷；X是I至4 ;
[0231]每個Nb是雙環(huán)核苷；
[0232]每個Nq是非雙環(huán)核苷；
[0233]Ny是經(jīng)修飾的核苷或未經(jīng)修飾的核苷；且
[0234]每個Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0235]在核苷型態(tài)111的某些實施例中，X是I。在核苷型態(tài)I的某些實施例中，X是2。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，X是3。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，X是4。
[0236]在某些實施例中，本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)IV的至少8個連續(xù)核苷:
[0237]Nm-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Ny_Nz
[0238]其中Nm是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；
[0239]每個Nb是雙環(huán)核苷；
[0240]每個Nq是非雙環(huán)核苷；
[0241]Ny是經(jīng)修飾的核苷或未經(jīng)修飾的核苷；且
[0242]Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0243]在某些實施例中，本文提供包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸的化合物，其中經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)互補且其中經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)V的至少8個連續(xù)核苷:
[0244]Nm-Nb- (Nq-Nq-Nb-Nb) 4_Nz
[0245]其中Nm是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；
[0246]每個Nb是雙環(huán)核苷；
[0247]每個Nq是非雙環(huán)核苷；且
[0248]Nz是經(jīng)修飾的核苷。
[0249]以下實施例適用于本文所述的任何核苷型態(tài)，包括核苷型態(tài)I至V。
[0250]在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸包含本文所述核苷型態(tài)的至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續(xù)核苷。
[0251]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 (SEQ ID NO:1)至少90%互補。在某些實施例中，經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與(SEQ ID NO:1)至少95%互補。在某些實施例中，經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與(SEQID NO:1) 100% 互補。
[0252]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21互補以使得微RNA的位置I與該寡核苷酸的3’端核苷堿基配對。例如:
[0253]5， -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ (miR-21;SEQ ID NO:1)
[0254]I I I I I I I I I I I I I I I I I I
[0255]3，-ATCGAATAGTCTGACTACA-5，(抗 miR-21; SEQ ID NO: 3);
[0256]5， -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ (miR-21;SEQ ID NO:1)
[0257]I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
[0258]3，-ATCGAATAGTCTGACTACAACT-5’(抗 miR-21; SEQ ID NO: 4)。
[0259]應(yīng)理解的是在SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4中序列中的每個“T個可以獨立地是“T”核苷堿基亦或“U”核苷堿基，并且具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4序列的化合物可以包含所述核苷堿基全部是T的、全部是U的、或者U和T的任意組合的核苷堿基。因此，在整個本披露中和在所附序列表中，在SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4中不同位置處的“T”的存在沒有對具體核苷堿基是“T”還是“U”的方面造成限制。
[0260]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，每個雙環(huán)核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。在某些實施例中，至少兩個雙環(huán)核苷的糖部分彼此不同。在某些實施例中，所有雙環(huán)核苷均具有彼此相同的糖部分。在某些實施例中，每個雙環(huán)核苷是cEt核苷。在某些實施例中，每個雙環(huán)核苷是LNA核苷。
[0261]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，cEt核苷是S-cEt核苷。在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，cEt核苷是R-cEt核苷。
[0262]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷獨立地選自β -D-脫氧核糖核苷、β -D-核糖核苷、2’ -O-甲基核苷、2’ -O-甲氧基乙基核苷以及2’ -氟核苷。
[0263]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷獨立地選自β -D-脫氧核糖核苷以及2’ -O-甲氧基乙基核苷。
[0264]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，至少兩個非雙環(huán)核苷包含彼此不同的糖部分且獨立地選自β-D-脫氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷及2’-氟核苷。
[0265]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，至少兩個非雙環(huán)核苷包含彼此不同的糖部分且獨立地選自β -D-脫氧核糖核苷以及2’ -O-甲氧基乙基核苷。
[0266]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷具有相同類型的糖部分且選自β-D-脫氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。
[0267]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷是β -D-脫氧核糖核苷。在某些實施例中，每個非雙環(huán)核苷是2’-O-甲基核苷。
[0268]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，不超過3個非雙環(huán)核苷是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，不超過2個非雙環(huán)核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，不超過1個非雙環(huán)核苷是2’ -O-甲氧基乙基核苷。
[0269]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，一個非雙環(huán)核苷是2’ -MOE核苷且其他每個非雙環(huán)核苷是β -D-脫氧核糖核苷。在某些實施例中，兩個非雙環(huán)核苷是2’ -O-甲氧基乙基核苷且其他每個非雙環(huán)核苷是β-D-脫氧核糖核苷。在某些實施例中，三個非雙環(huán)核苷是2’ -O-甲氧基乙基核苷且其他每個非雙環(huán)核苷是β -D-脫氧核糖核苷。
[0270]在本文所述的任何核苷型態(tài)的某些實施例中，5’最末端非雙環(huán)核苷和3’最末端非雙環(huán)核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷且其他每個非雙環(huán)核苷是β-D-脫氧核糖核苷。
[0271]在X是4的任何核苷型態(tài)I的某些實施例中，每個核苷R是2’-O-甲氧基乙基核苷。在X是4的核苷型態(tài)1的某些實施例中，兩個核苷R是β -D-脫氧核糖核苷且兩個核苷R是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在X是4的核苷型態(tài)I的某些實施例中，三個核苷R是β -D-脫氧核糖核苷且一個核苷R是2’ -O-甲氧基乙基核苷。
[0272]在核苷型態(tài)I的某些實施例中，R是Nk1-Nk2-Nk3-Nk4,其中Nki是2’ -MOE核苷，Nk2是β -D-脫氧核糖核苷，Ne3是β -D-脫氧核糖核苷，且Nk4是β -D-脫氧核糖核苷。
[0273]在核苷型態(tài)1的某些實施例中，R由四個連接的核苷Nk1-Nk2-Nk3-Nk4組成，其中Nki是2’ -O-甲氧基乙基核苷且Nk2-Nk3-Nk4各自是β -D-脫氧核糖核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:4，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0274]在核苷型態(tài)1的某些實施例中，X是I且每個核苷R是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是2’ -O-甲氧基乙基核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID N0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0275]在核苷型態(tài)I的某些實施例中，X是4且每個核苷R是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S-cEt核苷；每個Nq是2’-O-甲氧基乙基核苷；且#是2’-0_甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID N0:4，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0276]在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S_cEt核苷；每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0277]在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S_cEt核苷；每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷；且Nz是S-cEt核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0278]在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是LNA核苷；每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0279]在核苷型態(tài)II的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是LNA核苷；每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷；且Nz是LNA核苷。在某些實施例中，經(jīng)修飾的寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。 [0280]在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；且X是I。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；x是I ;且每個Nq是未經(jīng)修飾的核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；Χ是I ;每個Nq是未經(jīng)修飾的核苷；每個Nb獨立地選自S-cEt核苷以及LNA核苷；且Ny選自β -D-脫氧核糖核苷、2’ -O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷以及LNA核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；X是I ;且每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；Χ是I ;每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；每個Nb獨立地選自S-cEt核苷以及LNA核苷；且Ny選自β -D-脫氧核糖核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷以及LNA核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；Χ是I ;每個Nq是未經(jīng)修飾的核苷；每個Nb是S-cEt核苷；且Ny選自β-D-脫氧核糖核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及S-cEt核苷。在核苷型態(tài)III的某些實施例中，R是不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；Χ是I ;每個#是β-D-脫氧核糖核苷；每個Nb是S-cEt核苷；且Ny選自β -D-脫氧核糖核苷、2’ -O-甲氧基乙基核苷以及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態(tài)III的經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0281]在核苷型態(tài)IV的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb選自S_cEt核苷以及LNA核苷；每個Nq選自β -D-脫氧核糖核苷以及2’ -O-甲氧基乙基核苷；ΝΥ選自2’-0_甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷、LNA核苷以及β-D-脫氧核糖核苷；且#選自2’_0_甲氧基乙基核苷、LNA核苷以及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態(tài)IV的經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0282]在核苷型態(tài)IV的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S_cEt核苷；各Nq選自β -D-脫氧核糖核苷以及2’ -O-甲氧基乙基核苷；ΝΥ選自2’ -O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷以及β-D-脫氧核糖核苷；且#選自2’ -O-甲氧基乙基核苷以及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態(tài)IV的經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0283]在核苷型態(tài)IV的某些實施例中，Nm是2’-O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S_cEt核苷；每個Nq是β -D-脫氧核糖核苷；ΝΥ是S-cEt核苷；且Nz是S-cEt核苷。在某些實施例中，型態(tài)IV的經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0284]在核苷型態(tài)V的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；各Nb選自S_cEt核苷以及LNA核苷；各Nq選自β-D-脫氧核糖核苷以及2’ -O-甲氧基乙基核苷；且Nz選自2’ -O-甲氧基乙基核苷、LNA核苷以及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態(tài)V的經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID NO: 3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0285]在核苷型態(tài)V的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S_cEt核苷；每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷；且Nz選自2’-O-甲氧基乙基核苷以及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態(tài)V的經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0286]在核苷型態(tài)V的某些實施例中，Nm是2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是S_cEt核苷；每個Nq是β-D-脫氧核糖核苷；且Nz是2’ -O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，型態(tài)V的經(jīng)修飾寡核苷酸具有 核苷堿基序列SEQ ID Ν0:3，其中序列中的每個T獨立地選自T和U。
[0287]在某些實施例中 ，本文提供的化合物具有如表1中所示的核苷堿基序列和修飾。核苷修飾如下指示:之后未接下標(biāo)的核苷指示β-D-脫氧核糖核苷；之后接有下標(biāo)“Ε”的核苷指示2’ -MOE核苷；之后接有下標(biāo)“L”的核苷為LNA核苷；之后接有下標(biāo)“S”的核苷指示S-cEt核苷。每個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。上標(biāo)“Me”指示核苷的堿基上的5-甲基。
[0288]表1:抗miR-21化合物
[0289]
【權(quán)利要求】
1.一種化合物，包含由8至22個連接的核苷組成的一種經(jīng)修飾寡核苷酸，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21(SEQ ID NO:1)互補，并且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)I的至少8個連續(xù)核苷:
(R) X-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Nq_Nz
其中每個R獨立地是一種非雙環(huán)核苷；X是I至4 ; 每個Nb獨立地是一種雙環(huán)核苷； 每個Nq獨立地是一種非雙環(huán)核苷；并且 每個Nz獨立地是一種經(jīng)修飾的核苷。
2.一種化合物，包含由8至19個連接的核苷組成的一種經(jīng)修飾寡核苷酸，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21(SEQ ID NO:1)互補，并且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)II的至少8個連續(xù)核苷:
Nm-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Nq_Nz 其中Nm獨立地是一種不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷； 每個Nb獨立地是一種雙環(huán)核苷； 每個Nq獨立地是一種非雙環(huán)核苷；并且 Nz獨立地是一種經(jīng)修飾的核苷。
3.一種化合物，包含由8至19個連接的核苷組成的經(jīng)修飾寡核苷酸，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21(SEQ ID NO:1)互補，并且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)III的至少8個連續(xù)核苷:`
(R) X-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Ny_Nz
其中每個R是一種非雙環(huán)核苷；X是I至4 ; 每個Nb是一種雙環(huán)核苷； 每個Nq是一種非雙環(huán)核苷； Ny是一種經(jīng)修飾的核苷或一種未經(jīng)修飾的核苷；并且 每個Nz是一種經(jīng)修飾的核苷。
4.一種化合物，包含由8至19個連接的核苷組成的一種經(jīng)修飾寡核苷酸，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21(SEQ ID NO:1)互補，并且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)IV的至少8個連續(xù)核苷:
Nm-Nb-Nq-Nq-Nb- (Nq-Nq-Nq-Nb) 3-Ny_Nz
其中Nm是一種不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷； 每個Nb是一種雙環(huán)核苷； 每個Nq是一種非雙環(huán)核苷； Ny是一種經(jīng)修飾的核苷或一種未經(jīng)修飾的核苷；并且 Nz是一種經(jīng)修飾的核苷。
5.一種化合物，包含由8至19個連接的核苷組成的一種經(jīng)修飾寡核苷酸，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21(SEQ ID NO:1)互補，并且其中該經(jīng)修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態(tài)V的至少8個連續(xù)核苷:
Nm-Nb- (Nq-Nq-Nb-Nb) 4-Nz 其中Nm是一種不為雙環(huán)核苷的經(jīng)修飾核苷；每個Nb是一種雙環(huán)核苷； 每個Nq是一種非雙環(huán)核苷；并且 Nz是一種經(jīng)修飾的核苷。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸包含核苷型態(tài)1、I1、II1、IV或V的至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續(xù)核苷。
7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21的核苷堿基序列(SEQ ID NO:1)至少90%互補、至少95%互補或100%互補。
8.如以上權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中每個雙環(huán)核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷以及ENA核苷。
9.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的化合物,其中每個雙環(huán)核苷是一種S-cEt核苷。
10.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的化合物，其中每個雙環(huán)核苷是一種LNA核苷。
11.如以上權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中每個非雙環(huán)核苷獨立地選自β -D-脫氧核糖核苷以及2’ -O-甲氧基乙基核苷。
12.如權(quán)利要求1至10中任一項所述的化合物，其中每個非雙環(huán)核苷是一種β-D-脫氧核糖核苷。
13.如權(quán)利要求1至10中任一項所述的化合物，其中每個非雙環(huán)核苷是一種2’-0_甲氧基乙基核苷。
14.如以上權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸由核苷型態(tài)1、I1、II1、IV 或 V 的 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個連接的核苷組成。
15.如以上權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中至少一個核苷間鍵是一種經(jīng)修飾核苷間鍵，或其中每個核苷間鍵是一種經(jīng)修飾核苷間鍵，并且其中該經(jīng)修飾核苷間鍵可任選地為一種硫代磷酸酯核苷間鍵。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項所述的化合物，其中至少一個胞嘧啶是一種5-甲基胞嘧啶，或其中每個胞嘧啶是一種5-甲基胞嘧啶。
17.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中: a.R由四個連接的核苷Nk1-Nk2-Nk3-Nk4組成，其中Nki是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷，并且的每一個是一種β _D-脫氧核糖核苷； 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且 Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； b.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核苷；X是I ; 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且 Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； c.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核苷；Χ是I ; 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；并且Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；d.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核昔；X是1 ;每個Nb是一種S-cEt核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種S-cEt核苷；e.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核昔；X是1 ;每個Nb是一種LNA核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；或f.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核昔；X是1 ;每個Nb是一種LNA核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種LNA核苷。
18.如權(quán)利要求2所 述的化合物，其中:a.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是一種S-cEt核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；b.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是一種S-cEt核苷；每個Nq是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；并且Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；c.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是一種S-cEt核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；每個N是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種S-cEt核苷；d.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是一種LNA核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；或e.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；每個Nb是一種LNA核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且Nz是一種LNA核苷。
19.如權(quán)利要求3所述的化合物，其中:a.每個R是一種2’ -O-甲氧基乙基核昔；X是1 ;每個Nb是一種S-cEt核苷；每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；Ny是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且 Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； b.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核苷；X是I ; 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷； Ny是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且 Nz是一種S-cEt核苷；或 c.每個R是一種2’-O-甲氧基乙基核苷；X是I ; 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷； Nz是一種S-cEt核苷；并且 Nz是一種S-cEt核苷。
20.如權(quán)利要求4所述的化合物，其中: a.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷； Ny是一種β -D-脫氧核糖核苷； Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷；并且 b.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷； Ny是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且 Nz是一種S-cEt核苷； c.Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷； Nz是一種S-cEt核苷；并且 Nz是一種S-cEt核苷。
21.如權(quán)利要求5所述的化合物，其中: Nm是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷； 每個Nb是一種S-cEt核苷； 每個Nq是一種β -D-脫氧核糖核苷；并且 Nz是一種2’ -O-甲氧基乙基核苷。
22.如以上權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中該經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID NO: 3，或其中該經(jīng)修飾寡核苷酸具有核苷堿基序列SEQ ID Ν0:4，并且其中在這種序列中的每個T獨立地選自T和U。
23.—種抑制miR-21的活性的方法，包括使一種細(xì)胞與如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物接觸。
24.如權(quán)利要求23所述的方法,其中該細(xì)胞在活體內(nèi)，或其中該細(xì)胞在活體外。
25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其中該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、過度增殖性細(xì)胞、角化細(xì)胞或乏氧細(xì)胞。
26.—種減少細(xì)胞中的膠原蛋白表達(dá)的方法，包括使一種細(xì)胞與如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物接觸。
27.一種治療與miR-21相關(guān)的疾病、預(yù)防或延遲與miR-21相關(guān)的疾病發(fā)作的方法，包括向患有與miR-21相關(guān)的一種疾病的一個受試者給予如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該疾病是纖維化。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該纖維化選自腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、皮膚纖維化、年齡相關(guān)性纖維化、脾纖維化、硬皮病以及移植后纖維化。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中: a.該腎纖維化存在于患有一種選自以下項的疾病的一個受試者中:腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化、IgA腎病、間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮；慢性腎損傷、腎小球疾病、腎小球腎炎、糖尿病、特發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化、膜性腎病、塌陷性腎小球病、慢性復(fù)發(fā)性腎臟感染以及終末期腎病； b.該腎纖維化由腎臟的急性或反復(fù)性創(chuàng)傷引起； c.該肝纖維化存在于患有一種選自以下項的疾病的一個受試者中:慢性肝損傷、肝炎感染、非酒精性脂肪變性肝炎以及肝硬化；該肺纖維化是特發(fā)性肺纖維化；和/或 d.該受試者患有慢性阻塞性肺病。
31.一種治療一個受試者中的纖維增生性病癥的方法，包括向該受試者給予如權(quán)利要求I至22中任一項所述的化合物。
32.如權(quán)利要求23至31中任一項所述的方法，包括選擇一種或多種組織中的miR-21表達(dá)升高的一個受試者。
33.如權(quán)利要求27至31中任一項所述的方法，其中該受試者需要改善的器官功能，其中該器官功能選自心臟功能、肺功能、肝功能以及腎功能。
34.如權(quán)利要求27至33中任一項所述的方法，其中該給予改善該受試者的器官功能，其中該器官功能選自心臟功能、肺功能、肝功能以及腎功能。
35.如權(quán)利要求27至34中任一項所述的方法，包括給予至少一種選自以下項的治療劑:抗炎劑、免疫抑制劑、抗糖尿病劑、地高辛、血管舒張藥、血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)、鈣通道阻滯劑、異山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪、硝酸酯、肼屈嗪、β -阻滯劑、利鈉肽、類肝素以及結(jié)締組織生長因子抑制劑。
36.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該疾病是癌癥。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中該癌癥為肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腦癌、血液性癌癥、胰臟癌、頭頸癌、舌癌、胃癌、皮膚癌或甲狀腺癌。
38.如權(quán)利要求36或37所述的方法，進(jìn)一步包含向該受試者給予至少一種其他抗癌療法。
39.如權(quán)利要求23至38中任一項所述的方法，其中該受試者是人。
40.如權(quán)利要求23至39中任一項所述的方法，其中該化合物以一種藥物組合物存在。
41.如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物，該化合物用于療法。
42. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物，該化合物用于治療纖維化。
43. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物，該化合物用于促進(jìn)傷口愈合。
44. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物，該化合物用于治療癌癥。
45. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物，該化合物用于預(yù)防和/或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)作。
46. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物，該化合物用于治療心臟病。
47. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物用于制備一種藥物的用途。
48. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物用于制備一種治療纖維化的藥物的用途。
49. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物用于制備一種促進(jìn)傷口愈合的藥物的用途。
50. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物用于制備一種治療癌癥的藥物的用途。
51. 如權(quán)利要求1至22中任一項所述的化合物用于制備一種預(yù)防和/或延遲轉(zhuǎn)移發(fā)作的藥物的用途。
【文檔編號】C12N15/113GK103620035SQ201280031285
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月25日
【發(fā)明者】B.巴特 申請人:萊古路斯治療法股份有限公司