用于增強(qiáng)雌性生殖細(xì)胞中生物能狀態(tài)的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了包含生物能劑的組合物和方法，所述生物能劑用于恢復(fù)衰老卵母細(xì)胞的品質(zhì)、增強(qiáng)卵原干細(xì)胞或改善其衍生物(例如，胞質(zhì)或分離的線粒體)以用于受精能力增強(qiáng)法。
【專利說(shuō)明】用于增強(qiáng)雌性生殖細(xì)胞中生物能狀態(tài)的組合物和方法
[0001]相關(guān)主題的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)依據(jù)35U.S.C.§ 119(e)要求2011年6月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61 / 502,840和2012年2月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61 / 600，529的權(quán)益，所述文獻(xiàn)的完整披露內(nèi)容通過(guò)引用的方式結(jié)合在此。
[0003]對(duì)聯(lián)邦資助的研究下所做出發(fā)明的擁有權(quán)利的聲明
[0004]本項(xiàng)工作部分地由美國(guó)國(guó)家健康研究所基金號(hào)NIH R37-AG012279支持。美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005]發(fā)明背景
[0006]自從二十世紀(jì)50年代早期，與卵巢功能不全和早衰(包括因衰老或損害所致的不育)相關(guān)的臨床管理問題已經(jīng)受以下認(rèn)識(shí)限制:出生時(shí)提到的卵母細(xì)胞池不可替換或更新(Zuckerman, Recent Prog Horm Resl9516:63-108)。換句話說(shuō)，任何治療性介入應(yīng)當(dāng)順應(yīng)于含有卵母細(xì)胞的現(xiàn)有卵泡儲(chǔ)備的操作以產(chǎn)生所需的臨床轉(zhuǎn)歸。然而，在2004年，采用小鼠的研究挑戰(zhàn)如下觀點(diǎn):卵母細(xì)胞的固定卵巢儲(chǔ)備在出生時(shí)賦予(Johnson(約翰遜)等人，Nature (自然)2004428:145-150)。基于來(lái)自幾種實(shí)驗(yàn)方案的結(jié)果，得出結(jié)論:成年雌性哺乳動(dòng)物的卵巢保留罕有的種系或卵原干細(xì)胞(OSC)，所述種系或卵原干細(xì)胞以類似于種系干細(xì)胞支持成年睪丸中精子產(chǎn)生的方式常規(guī)產(chǎn)生新卵母細(xì)胞(Spradling(斯普拉德林)，Nature (自然)2004428:133-134)。幾年后，從新生和成年小鼠卵巢成功地分離0SC(Zou (鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911:631-636 ;Pachiarotti (帕卡洛提)等人，Differentiation(分化)201079:159-170)?？傮w上，這些研究，連同來(lái)自小鼠研究的幾份其他報(bào)告(Johnson(約翰遜)等人，Cell (細(xì)胞)2005122:303-315 ;Wang (王)等人，Cell Cycle (細(xì)胞周期)20109 =339-349 ；Niikura(尼基塔)等人，Aging(老化)20102 =999-1003)已經(jīng)概念性驗(yàn)證了 OSC作為移植治療藥和作為調(diào)制卵巢功能和雌性受精能力(fertility)的新療法的祀標(biāo)的用途(Tilly (迪利)等人，BiolReprod(繁殖生物學(xué))200980:2-12 ;Tilly(迪利)等人，Mol Hum Reprod(人類繁殖分子學(xué))2009 ；15:393-398)。此外，在年老小鼠的萎縮卵巢中鑒定到休眠性0SC，表明卵巢衰老可能是可逆的，其中所述休眠性O(shè)SC在暴露于年輕成年卵巢環(huán)境時(shí)自發(fā)重新開始卵母細(xì)胞形成(Niikura (尼基塔)等人，Aging (老化)20091:971-978 ;Massasa (瑪莎莎)等人，Aging(老化)2010 ；2:1_2)。OSC的臨床應(yīng)用現(xiàn)在進(jìn)一步由本文中顯示的以下證據(jù)證實(shí):產(chǎn)生卵母細(xì)胞的干細(xì)胞的可比較的群體存在于健康育齡女性的卵巢中并且可以從中純化。
[0007]雖然這些新研究表明通過(guò)基于OSC的技術(shù)，成年卵巢中的卵母細(xì)胞數(shù)目對(duì)治療性擴(kuò)充是可行的，但是卵巢衰老和早衰由卵母細(xì)胞數(shù)目下降以及巢中存在的卵母細(xì)胞的品質(zhì)下降決定。因此，確定用于改善卵母細(xì)胞品質(zhì)、尤其在大齡女性中改善卵母細(xì)胞品質(zhì)的方法是迫切的。在過(guò)去的數(shù)十年期間，由于文化和社會(huì)變動(dòng)，發(fā)達(dá)國(guó)家的女性已顯著推遲分娩。例如，在過(guò)去的40 年，年齡35-44歲的女性的初育率在美國(guó)已增加超過(guò)8倍(VenturaVital Health Stat (凡吐拉市病毒與健康數(shù)據(jù))200947: 1-27 ；Matthews (馬修斯)，NCHSData Brief (NCHS數(shù)據(jù)簡(jiǎn)報(bào))200921:1-8)。眾所周知的是，35歲或更大年齡女性中的妊娠速率天然地以及在輔助生殖的情況下均顯著較低。活產(chǎn)率的下降反映了卵巢對(duì)促性腺激素激素(促卵泡激素或FSH和促黃體激素或LH)刺激作用的反應(yīng)下降、降低的卵母細(xì)胞及胚胎品質(zhì)以及妊娠率，和增加的流產(chǎn)及胎兒非整倍性的出現(xiàn)率。實(shí)際上，認(rèn)為卵子中衰老相關(guān)的染色體和減數(shù)分裂紡錘體異常是造成高生育年齡的女性中不育、胎兒丟失(流產(chǎn))以及造成出生缺陷(最值得注意的是21三體或唐氏綜合征)的受孕的發(fā)生率增加的主要因素(Henderson(亨德森)等人，Nature (自然)1968218:22-28 ；Hassold(哈索德)等人,Hum Genet (人類遺傳學(xué))198570:11-17 ；Battaglia(巴塔利亞)等人,Hum Reprod(人類繁殖)199611:2217-2222 ;Hunt(亨特)等人，Trends Genet (趨勢(shì)遺傳學(xué))200824:86-93)。雖然已經(jīng)廣泛地研究人和動(dòng)物模型的卵母細(xì)胞中衰老相關(guān)的非整倍性的發(fā)生和后果(Tari η (塔林)等人，Biol R印rod (繁殖生物學(xué))200165:141-150 ;Pan (潘)等人，Dev Biol (發(fā)育生物學(xué))2008316:397-407 ;Duncan (鄧肯)等人，Biol Reprod (繁殖生物學(xué))200981:768-776)，但是仍難以找到隨年齡增加維持細(xì)胞減數(shù)分裂期間染色體分離精確度的方法。目前，不存在改善年老女性患者的妊娠結(jié)局的已知介入治療。在動(dòng)物研究中，已經(jīng)報(bào)道在青少年期間并且在成年育齡期間自始至終長(zhǎng)期施用藥理劑量的抗氧化劑在衰老雌性小鼠中改善卵母細(xì)胞品質(zhì)(Tarin(塔林)等人，Mol Reprod Dev(分子生殖發(fā)育)200261 =385-397) 0然而，這種方案對(duì)卵巢和子宮功能具有明顯長(zhǎng)期負(fù)面作用，在治療的動(dòng)物中導(dǎo)致較高的胎兒死亡和吸收率以及減少的產(chǎn)仔頻率和大小(Tarin (塔林)等人，Theriogenology (獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué))200257 =1539-1550)。因而，在育齡期間自始至終長(zhǎng)期抗氧化療法以便維持或改善衰老女性中卵母細(xì)胞品質(zhì)的臨床轉(zhuǎn)換是不切實(shí)際的。
[0008]線粒體功能障礙在生殖衰老中具有主要作用，并且因此，可能通過(guò)使用線粒體營(yíng)養(yǎng)物改善年老女性中的生殖功能(Bentov(本托福)等人，F(xiàn)ertil Steril (生育與不孕)201093 =272-275)。衰老和年齡相關(guān)性病理學(xué)往往與因線粒體數(shù)目減少(生物生成和自噬)、線粒體聚集增加、線粒體活性(產(chǎn)生作為細(xì)胞主要能量來(lái)源的ATP)削弱和線粒體膜電位和/或線粒體DNA (mtDNA)突變和缺失積累所致的線粒體功能喪失相關(guān)。隨著卵母細(xì)胞衰老以及卵母細(xì)胞線粒體能量產(chǎn)生減少，為產(chǎn)生有活力卵子所需的卵母細(xì)胞成熟的許多關(guān)鍵過(guò)程(尤其胞核紡錘體活性和染色體分`離)變得受損(Bartmann (巴特曼)等人，JAssist Reprod Genet (輔助生殖與遺傳學(xué)雜志)200421:79-83 ;Wilding (懷爾丁)等人,Zygote (合子)200513:317-23)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是許多其他過(guò)程的小分子調(diào)節(jié)物，所述過(guò)程包括信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞-細(xì)胞通訊和表觀遺傳變化。一旦認(rèn)為非常穩(wěn)定的，NAD+的水平響應(yīng)于膳食和鍛煉而增高。增加的NAD+水平也與膳食相關(guān)，稱作熱量限制(CR)，已知它延遲衰老和疾病(包括不育)的許多方面(Sinclair (辛克萊)Mech AgeingDev (衰老與發(fā)育機(jī)制)200526:987 ;Selesniemi (斯萊斯尼米)等人，AgingCell (細(xì)胞老化)7 =622-629,2008)。
[0009]NAD+水平對(duì)含有它們的線粒體和細(xì)胞的正常功能是重要的。線粒體NAD+低的細(xì)胞傾向于出現(xiàn)細(xì)胞功能障礙和死亡(Yang(楊)等人，Cell (細(xì)胞)2008)。肥胖癥和衰老均降低線粒體NAD+水平，導(dǎo)致線粒體功能降低、細(xì)胞死亡增加和年齡相關(guān)性疾病的加速(Hafner (哈夫納)等人，Aging(老化)20102:1_10)。隨著卵母細(xì)胞衰老以及卵母細(xì)胞線粒體能量產(chǎn)生減少，卵母細(xì)胞成熟的許多過(guò)程(尤其是減數(shù)分裂的紡錘體活性和染色體分離)變得受損(Bartmann(巴特曼)等人，J Assist Reprod Genet (輔助生殖與遺傳學(xué)雜志)200421:79-83 ;Wilding(懷爾丁)等人，Zygote (合子)200513:317-23)。升高NAD+水平是增加細(xì)胞、器官、組織和胚胎發(fā)育的生物能學(xué)和生存力的有效選項(xiàng)。下游介體包括sirtuin去乙?；?SIRT1-7)和聚ADP核糖聚合酶(PARPs)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知增加NAD+水平并加強(qiáng)線粒體功能可以模擬熱量限制的健康益處(Yang(楊)等人，ExpGerontol (實(shí)驗(yàn)老年學(xué))200641:718-726)。
[0010]在維持高育齡女性中卵母細(xì)胞品質(zhì)的長(zhǎng)期抗氧化療法之間建立聯(lián)系(Tarin(塔林)等人，Hum Reprod(人類繁殖)199510:1563-1565)，并且可獲得支持卵子中線粒體功能障礙作為年齡相關(guān)性受精能力問題背后之推動(dòng)力的關(guān)鍵作用的數(shù)據(jù)。例如，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在分離的小鼠卵母細(xì)胞中降低ATP水平，這增加減數(shù)分裂紡錘體異常，導(dǎo)致染色體錯(cuò)排列(Zhang (張)等人，CellRes (細(xì)胞研究)200616:841-850)。另外，盡管人卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟可以在一定的ATP濃度范圍內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行，但是具有較高ATP含量的卵母細(xì)胞顯示大得多的成功胚胎發(fā)生、植入和發(fā)育潛力(Van Blerkom(凡布萊克姆)等人，HumReprod (人類繁殖)199510:415-424)。
[0011]與此同時(shí)，異源轉(zhuǎn)移來(lái)自年輕供體卵母細(xì)胞(即，從不同女性獲得)的胞質(zhì)提取物至中具有生殖失敗病史的較年長(zhǎng)女性的卵母細(xì)胞(稱作卵胞質(zhì)移植或卵胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法)展示出改善的胚胎發(fā)育和活后代分娩。然而不幸地，按這種方法出生的兒童顯示出線粒體異質(zhì)性或存在來(lái)自兩個(gè)不同來(lái)源的線粒體(Cohen(科亨)等人，Mol Hum Reprod(人類繁殖分子學(xué))19984:269-280 ；Barritt(巴里特)等人，Hum R印rod (人類繁殖)200116:513-516 ;Muggleton-Harris (馬格頓-哈里斯)等人，Nature (自然)1982299:460-462 ;Harvey (哈維)等人，Curr Top Dev Biol (發(fā)育生物學(xué)當(dāng)前主題)200777:229-249)。這與以下事實(shí)一致:卵子中存在的母源線粒體被用來(lái)向胚胎“播種”線粒體，因?yàn)閬?lái)自精子的父源線粒體在受精之后不久被摧毀(Sutovsky (所托威斯克)等人，Biol Reprod (繁殖生物學(xué))200063 =582-590)。雖然該方法涉及轉(zhuǎn)移來(lái)自供體卵子的細(xì)胞質(zhì)和未純化的線粒體，但是普遍認(rèn)為供體線粒體在轉(zhuǎn)移的細(xì)胞質(zhì)中的存在(由“外來(lái)”線粒體傳遞至后代所證實(shí))是異源卵胞質(zhì)轉(zhuǎn)移為何提`供受精能力益處的原因(Harvey (哈維)等人，Curr Top DevBiol (發(fā)育生物學(xué)當(dāng)前主題)200777:229-249)。無(wú)論如何，這些兒童中所引起的線粒體異質(zhì)性的健康影響仍是未知的；然而，已經(jīng)展示一種線粒體異質(zhì)性小鼠模型產(chǎn)生與代謝綜合征一致的表型(Acton (阿克頓)等人，Biol R印rod (繁殖生物學(xué))200777:569-576)。可商榷地，伴隨異源卵胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的最明顯問題與如下事實(shí)有關(guān):線粒體還含有與生物學(xué)母親和生物學(xué)父親所提供的核基因不同的遺傳物質(zhì)。因此，按照這種方法孕育的兒童具有三個(gè)遺傳親本(生物學(xué)母親、生物學(xué)父親、卵子供體)，并且因此代表遺傳操作人種系以產(chǎn)生胚胎的實(shí)例。導(dǎo)致線粒體異質(zhì)性的卵胞質(zhì)移植方法因此現(xiàn)在受到管制并且大多被FDA禁止。關(guān)于細(xì)節(jié)，參見CBER2002會(huì)議文件(CBER2002Meeting Documents)，2002年5月9日的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑咨詢委員會(huì)(Biological Response Modifiers Advisory Committee)紀(jì)要，這些文件從FDA可公開獲得，以及“致資助者/研究者的信-涉及在通過(guò)除配子核結(jié)合以外的手段轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的療法中使用的人類細(xì)胞(Letter to Sponsors / Researchers-HumanCells Used in Therapy Involving the Transfer of Genetic Material By MeansOther Than the Union of Gamete Nuclei) ”，它同樣可從 FDAhttp: / / www.fda.gov /BiologicsBloodVaccines / SafetyAvailability / ucml05852.htm 公開獲得。盡管使用來(lái)自體細(xì)胞的自體線粒體將避免線粒體異質(zhì)性，然而體細(xì)胞線粒體是不充分的，因?yàn)樗鼈円壮霈F(xiàn)導(dǎo)線粒體DNA損傷和缺失，導(dǎo)致可遺傳的突變。在卵胞質(zhì)移植方法中，女性生殖細(xì)胞的自體來(lái)源，即OSC及其獲得的組合物(例如，OSC細(xì)胞質(zhì)或分離的線粒體)將防止線粒體異質(zhì)性并且降低目前與該方法相關(guān)的倫理和安全顧慮。重要地，易于出現(xiàn)衰老相關(guān)性缺陷的卵母細(xì)胞在數(shù)量或品質(zhì)上并沒有高到足以可靠地用于這類方法中。
[0012]因此，需要恢復(fù)衰老卵母細(xì)胞的品質(zhì)以及進(jìn)一步增強(qiáng)OSC或改善其衍生物(例如，細(xì)胞質(zhì)或分離的線粒體)以便用于實(shí)施一系列輔助生殖技術(shù)。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明提供多種藥劑在卵母細(xì)胞、出生后雌性種系干細(xì)胞(在本文中也稱作0SC)和/或植入前胚胎中，在實(shí)施體外受精方法之前和/或在體外受精方法后或在卵巢、卵母細(xì)胞、OSC和/或植入前胚胎體內(nèi)暴露后增強(qiáng)線粒體數(shù)目、線粒體活性、細(xì)胞能量水平或細(xì)胞產(chǎn)能潛力(統(tǒng)稱為“生物能狀態(tài)”)的用途。在某些實(shí)施例中，用于此類用途的藥劑包括NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、Sirtl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物。這些藥劑將在本文統(tǒng)稱為“生物能劑(bioenergetic agent)”。
[0015]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物含有卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC后代中的一種或多種和生物能劑(例如，NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一種或多種)。
[0016]在另一個(gè)方面，本 發(fā)明提供一種具有增強(qiáng)的線粒體功能的分離細(xì)胞，其中該細(xì)胞是卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC后代中的一種或多種，其中該細(xì)胞已經(jīng)與生物能劑(NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷(nicotinamide riboside)和煙酸)、漆樹黃酮(fisetin)、槲皮素(quercetin)、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、批咯并喹啉醌、二甲雙胍、療菜素(apigenin)、木犀草素(Iuteolin)、酪氨酸磷酸化抑制劑8(tryphostin8)、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一種或多種)接觸。
[0017]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種含有OSC線粒體或卵母細(xì)胞線粒體和生物能劑的組合物，所述生物能劑是NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一種或多種。
[0018]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的線粒體，其中所述線粒體已經(jīng)與生物能劑接觸，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。[0019]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種含有OSC線粒體或卵母細(xì)胞線粒體和生物能劑的分離的無(wú)細(xì)胞組合物，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0020]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制備卵母細(xì)胞以用于體外受精(IVF)的方法，所述方法涉及將含有OSC線粒體和生物能劑的組合物轉(zhuǎn)移至自體卵母細(xì)胞中，因而制備該卵母細(xì)胞以用于體外受精，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，含有OSC線粒體的組合物是從OSC獲得的線粒體的純化制備物。
[0021]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供根據(jù)前述方面或本文描述的本發(fā)明的任何其他方面的方法制備的卵母細(xì)胞。
[0022]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種體外受精的方法，所述方法涉及的步驟(a)將來(lái)自雌性受試者的OSC與生物能劑孵育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種；(b)獲得含有來(lái)自該OSC的OSC線粒體的組合物；(c)將該組合物轉(zhuǎn)移至分離的自體卵母細(xì)胞中；并且(d)使該自體卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步 涉及將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。在一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)是任選的并且步驟b)進(jìn)一步涉及將含有OSC線粒體與生物能劑的組合物孵育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、批咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0023]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制備卵母細(xì)胞以用于體外受精的方法，所述方法涉及將含有卵母細(xì)胞線粒體和生物能劑的組合物轉(zhuǎn)移至自體卵母細(xì)胞中，因而制備該卵母細(xì)胞以用于體外受精，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，含有卵母細(xì)胞線粒體的組合物是無(wú)胞核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，含有卵母細(xì)胞線粒體的組合物是從卵母細(xì)胞獲得的線粒體的純化制備物。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步涉及使卵母細(xì)胞體外受精以形成合子并將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。在另一個(gè)實(shí)施例中，將合子和植入前期胚胎與生物能劑孵育，所述生物能劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、批咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、SIRTl激活物、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
[0024]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供根據(jù)前述方面或本文描述的本發(fā)明的任何其他方面的方法制備的卵母細(xì)胞。
[0025]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種體外受精的方法，所述方法涉及的步驟(a)將來(lái)自雌性受試者的卵母細(xì)胞與生物能劑孵育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑
8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種；(b)獲得含有來(lái)自該卵母細(xì)胞的線粒體的組合物；(c)將該組合物轉(zhuǎn)移至分離的自體卵母細(xì)胞中；并且(d)使該自體卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步涉及將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。在另一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)是任選的并且步驟b)進(jìn)一步涉及將含有卵母細(xì)胞線粒體與生物能劑的組合物孵育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0026]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種體外受精的方法，所述方法涉及的步驟(a)將來(lái)自雌性受試者的卵母細(xì)胞與生物能劑孵育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑
`8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種；并且使該卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。
[0027]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種含有溶液和生物能劑的組合物，所述溶液選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、胚胎培養(yǎng)基、卵裂培養(yǎng)基、玻璃化溶液、冷凍保存溶液和胚胎解凍培養(yǎng)基，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0028]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種改善雌性受試者中受精能力的方法，所述方法包括將生物能劑以有效改善卵母細(xì)胞和/或OSC品質(zhì)、從頭產(chǎn)生和/或排卵的卵母細(xì)胞產(chǎn)率的量施用至所述受試者，因而改善所述雌性受試者中的受精能力，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑全身性施用至雌性受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑局部施用至雌性受試者的卵巢。在又一個(gè)實(shí)施例中，與參比標(biāo)準(zhǔn)物相比，雌性受試者的妊娠結(jié)局改善。
[0029]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種體外受精的方法，所述方法包括以下步驟:
[0030](a)將生物能劑以有效改善卵母細(xì)胞和/或OSC從頭產(chǎn)生、品質(zhì)和/或排卵的卵母細(xì)胞產(chǎn)率的量施用至女性受試者，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種；
[0031](b)從該雌性受試者獲得卵母細(xì)胞；并且
[0032](C)使該卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。在一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑全身性施用至雌性受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑局部施用至雌性受試者的卵巢。在另一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)在步驟b)和c)之前和/或在步驟b)和c)后實(shí)施。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步涉及步驟d):將源自該合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中并且繼續(xù)向該雌性受試者施用所述生物能劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，步驟b)和/或步驟c)進(jìn)一步包括將卵母細(xì)胞與生物能劑孵育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0033]在另一個(gè)實(shí)施例中，與參比標(biāo)準(zhǔn)物相比，雌性受試者的妊娠結(jié)局改善。
[0034]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種維持對(duì)其有需求的懷孕雌性受試者中胚胎發(fā)育的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的生物能劑，因而維持懷孕雌性受試者中的胚胎發(fā)育，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、批咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑全身性施用至雌性受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑局部施用至雌性受試者的卵巢。
[0035]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種恢復(fù)對(duì)其有需求的雌性受試者中卵巢功能的方法，所述方法包括施用治療有效量的生物能劑，因而恢復(fù)雌性受試者中的卵巢功能，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0036]在一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑全身性施用至雌性受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，將生物能劑局部施用至雌性受試者的卵巢。在另一個(gè)實(shí)施例中，雌性受試者具有卵巢功能早衰。[0037]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種從雌性受試者制備用于收獲的組織或其細(xì)胞的方法，所述方法包括施用有效量的生物能劑至雌性受試者，因而從雌性受試者制備該用于收獲的組織或其細(xì)胞，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，該組織是卵巢、卵泡、骨髓或外周血。
[0038]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生卵母細(xì)胞的方法，所述方法包括將干細(xì)胞在生物能劑存在的情況下、在足以使干細(xì)胞分化成卵母細(xì)胞的條件下培養(yǎng)，所述干細(xì)胞是0SC、胚胎干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，所述生物能劑是一種或多種NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、SRT-1720、SIRTl激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一種或多種。
[0039]在另一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于一種含有分離的細(xì)胞和用于體外受精的生物能劑的組合物，所述分離的細(xì)胞是卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC后代。
[0040]在另一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于一種相對(duì)于參比具有增強(qiáng)的線粒體功能的分離的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC后代,并且其中該細(xì)胞已經(jīng)與用于體外受精的生物能劑接觸。
[0041]在另一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于一種生物能劑，所述生物能劑是色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物，用于以下一項(xiàng)或多項(xiàng)中:改善女性的受精能力、維持懷孕女性中的胚胎發(fā)育、恢復(fù)或增加女性中的卵巢功能、從女性制備用于收獲的組織或其細(xì)胞或制備卵母細(xì)胞。`
[0042]在前述任一方面或本文描述的本發(fā)明任何方面的多種實(shí)施例中，生物能劑是NAD+的可溶性前體(例如，色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷和煙酸)、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、⑶38抑制劑、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式1-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一種或多種。在前述任一方面或本文描述的任何方面的多種實(shí)施例中，生物能劑是圖29中顯示的化合物。
[0043]在前述任一方面或本文描述的任何方面的多種實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步含有選自細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、玻璃化溶液和冷凍保存溶液中一種或多種的溶液。在多種實(shí)施例中，該組合物含有卵巢組織、卵泡、骨髓、臍帶血或外周血。在其他實(shí)施例中，OSC是一種分離的非胚胎干細(xì)胞，所述分離的非胚胎干細(xì)胞能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、0Ct-4、Dazl、Stella和任選地階段特異性胚胎抗原中的一種或多種。在其他實(shí)施例中，OSC從卵巢組織獲得。在多種實(shí)施例中，OSC從非卵巢組織獲得。在具體的實(shí)施例中，非卵巢組織是血液或骨髓。在多種實(shí)施例中，細(xì)胞是卵巢干細(xì)胞，其中細(xì)胞已經(jīng)與生物能劑接觸。在其他實(shí)施例中，接觸的細(xì)胞具有增加的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或增加的ATP生成能力。在另外的實(shí)施例中，線粒體的數(shù)目是增加約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %或60 %。在前述任一方面或本文描述的任何方面的多種實(shí)施例中，增加的線粒體功能通過(guò)驗(yàn)定mtDNA含量、ATP、NAD+ / NADH、線粒體質(zhì)量、膜電位、和已知的線粒體質(zhì)量(mitochondrial mass)調(diào)節(jié)物和電子傳遞鏈組分的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
[0044]在前述任一方面或本文描述的任何方面的多種實(shí)施例中，細(xì)胞處于溶液中，所述溶液是細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、玻璃化溶液和冷凍保存溶液中的任一種或多種。在其他實(shí)施方例中，線粒體處于細(xì)胞中，所述細(xì)胞是卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC后代中的一種或多種。在具體的實(shí)施例中，細(xì)胞處于含有卵巢組織、卵泡、骨髓、臍帶血或外周血的混合物中。
[0045]在前述任一方面或本文描述的任何方面的多種實(shí)施例中，含有OSC線粒體的組合物是無(wú)胞核的OSC細(xì)胞質(zhì)。在多種實(shí)施例中，含有卵母細(xì)胞線粒體的組合物是無(wú)胞核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)。在多種實(shí)施例中，含有OSC線粒體的組合物是從OSC獲得的線粒體的純化制備物。在其他實(shí)施例中，含有卵母細(xì)胞線粒體的組合物是從卵母細(xì)胞獲得的線粒體的純化制備物。
[0046]在前述任一方面或本文描述的任何方面的其他實(shí)施例中，線粒體處于細(xì)胞和生物能劑中，所述細(xì)胞是卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC后代中的一種或多種。在前述任一方面或本文描述的任何方面的多種實(shí)施例中，細(xì)胞處于含有卵巢組織、卵泡、骨髓、臍帶血或外周血的混合物中。在另外的實(shí)施例中，與參比標(biāo)準(zhǔn)物相比，雌性受試者的妊娠結(jié)局改善。在另外的實(shí)施例中，將生物能劑全身性施用至雌性受試者或局部施用至雌性受試者的卵巢。
[0047]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將從詳細(xì)描述并且從權(quán)利要求書中顯而易見。因而，本發(fā)明的其他方面在以下披露內(nèi)容中描述并且處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0048]附圖簡(jiǎn)述
[0049]以下詳細(xì)說(shuō)明可以結(jié)合通過(guò)引用方式結(jié)合在此的后續(xù)附圖一起來(lái)理解，所述詳細(xì)說(shuō)明通過(guò)舉例給出但不意在將本發(fā)明限于所描述的具體實(shí)施例。
[0050]圖1描述了用于OSC分離的、基于突光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)的驗(yàn)證方案。在圖1a中，顯示使用針對(duì)VASA的NH2或COOH端的抗體時(shí)，成年小鼠卵巢中VASA表達(dá)的免疫熒光分析(用藍(lán)色DAPI復(fù)染情況下的綠色)(比例尺,50 μ m)。在圖1b中，顯示使用針對(duì)VASA的NH2或COOH端的抗體時(shí)，分散的小鼠卵巢或分離的卵母細(xì)胞的免疫磁性分選。部分I含有分離之前的細(xì)胞加珠，部分2是洗滌或通流部分(無(wú)免疫反應(yīng)性)并且部分3是珠部分(VASA陽(yáng)性細(xì)胞，由白色箭頭突出顯示)。在圖1c中，顯示使用針對(duì)VASA的NH2或COOH端的抗體時(shí)，來(lái)自分散的小鼠卵巢的活細(xì)胞或透化細(xì)胞的FACS分析。VASA陽(yáng)性活細(xì)胞是僅用COOH抗體(紅色虛線框)檢測(cè)到，而透化使得利用NH2抗體(藍(lán)色虛線框)分離VASA陽(yáng)性細(xì)胞成為可能。在圖1d中，透化用COOH抗體所獲得的VASA陽(yáng)性活細(xì)胞(紅色虛線框)使得利用冊(cè)12抗體(藍(lán)色虛線框)，通過(guò)FACS再分離相同的細(xì)胞成為可能。在圖1e中，顯示了使用VASA-C00H抗體分離活的OSC時(shí)，所用的FACS方案的示意圖。圖1f描述了使用VASA-C00H抗體(+ve，F(xiàn)ACS后VASA陽(yáng)性活細(xì)胞部分；_ve，F(xiàn)ACS后VASA陰性活細(xì)胞部分；無(wú)RT，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄情況下RNA樣品的PCR ; β -肌動(dòng)蛋白，樣品內(nèi)參對(duì)照)，在卵巢分散過(guò)程期間為獲得細(xì)胞以便基于FACS分離OSC而產(chǎn)生的每個(gè)細(xì)胞部分中種系標(biāo)記Blimpl (也稱作具有ZNF結(jié)構(gòu)域的含有PR結(jié)構(gòu)域I或Prdml)、Stella、Fragilis (也稱作干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3或Ifitm3)、Tert(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)、Vasa、Dazl (無(wú)精子癥樣中缺失)和卵母細(xì)胞標(biāo)記Nobox (新生兒卵巢同源框)、Zp3 (透明帶糖蛋白3)、Gdf9 (生長(zhǎng)分化因子9)的基因表達(dá)分析。
[0051]圖2描述了通過(guò)免疫磁珠分選從含有摻雜性卵母細(xì)胞的成年小鼠卵巢分離的OSC部分。顯示了種系標(biāo)記(Blimpl、Stella、Fragilis、Tert、Vasa、Dazl)和卵母細(xì)胞特異性標(biāo)記(Nobox、Zp3、Gdf9)在年輕成年小鼠卵巢(陽(yáng)性對(duì)照)或基于VASA-C00H抗體的免疫磁珠分選分散的年輕成年小鼠卵巢后所獲得的最終細(xì)胞部分中的基因表達(dá)分析(無(wú)RT，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄情況下分選細(xì)胞的RNA樣品的PCR ； β -肌動(dòng)蛋白，樣品內(nèi)參對(duì)照)。
[0052]圖3描述使用FACS從成年小鼠和人卵巢分離VASA陽(yáng)性細(xì)胞。在圖3a和3b中，顯示用于分離人(a)和小鼠(b)OSC的成年卵巢組織的代表性組織學(xué)外觀。比例尺，ΙΟΟμπι。在圖3c和3c!中，顯示基于VASA的細(xì)胞表面表達(dá)，通過(guò)FACS分離的活細(xì)胞的形態(tài)。比例尺，IOum0圖3e提供起始卵巢材料和新鮮分離的OSC的基因表達(dá)譜，顯示3位不同患者作為人組織分析的實(shí)例的評(píng)估結(jié)果(無(wú)RT，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄情況下RNA樣品的PCR ; β -肌動(dòng)蛋白，樣品內(nèi)參對(duì)照)。在圖3f至圖3k中，顯示畸胎瘤形成測(cè)定法，所述測(cè)定法顯示與注射小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)后3周的小鼠中腫瘤的發(fā)展相比，在接受小鼠OSC注射后24周的小鼠中不存在腫瘤(3f)，(圖3g至圖3j ;小圖3h至3j顯示來(lái)自全部三個(gè)胚層的細(xì)胞的實(shí)例，小圖3h插圖中突出顯示神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)(neural rosette)),連同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的概述(3k)。
[0053]圖4描述在卵巢內(nèi)移植后從小鼠OSC獲得的功能性卵子。在圖4a和4b中，顯示在5-6個(gè)月之前注射過(guò)表達(dá)GFP的OSC的野生型小鼠的卵巢中含有GFP陰性和GFP陽(yáng)性(棕色，對(duì)比藍(lán)色蘇木精 復(fù)染)卵母細(xì)胞的正在生長(zhǎng)的卵泡的實(shí)例。在圖4c中，顯示在5-6個(gè)月之前接受卵巢內(nèi)移植表達(dá)GFP的OSC的野生型雌性小鼠的誘導(dǎo)排卵后，通過(guò)IVF產(chǎn)生的排卵的GFP陰性卵子(在卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中)和所得到的胚胎(作為實(shí)例，顯示2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、致密桑葚胚(CM)期和早期胚泡(EB)期胚胎)的實(shí)例。在圖4d和4e中，顯示在5-6個(gè)月之前接受卵巢內(nèi)移植表達(dá)GFP的OSC的野生型雌性小鼠的誘導(dǎo)排卵后，從輸卵管獲得的GFP陽(yáng)性卵子(在卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中)的實(shí)例。使用野生型精子使這些卵子體外受精，產(chǎn)生2細(xì)胞胚胎，所述2細(xì)胞胚胎經(jīng)歷植入前發(fā)育推進(jìn)(顯示處于2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、致密桑葚胚(CM)期、擴(kuò)張桑葚胚(EM)期、胚泡(B)期和孵化胚泡(HB)期的GFP陽(yáng)性胚胎的實(shí)例)以在受精后5-6日形成孵化胚泡。
[0054]圖5描述小鼠和人OSC體外生殖細(xì)胞集落形成。在圖5b和5d中顯示在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上體外建立后，由小鼠0SC(5a、5b)和人0SC(5c，5d)形成的典型生殖細(xì)胞集落中基于免疫熒光的VASA表達(dá)分析(綠色伴以藍(lán)色DAPI復(fù)染)(典型集落由白色虛線突出顯示)。
[0055]圖6描述特定培養(yǎng)物中源自小鼠卵巢和人卵巢的VASA陽(yáng)性細(xì)胞的評(píng)價(jià)。圖6a至圖6d顯示通過(guò)在無(wú)MEF培養(yǎng)物內(nèi)維持的小鼠0SC(6a、6b)和人0SC(6c、6d)中對(duì)VASA表達(dá)(綠色)和BrdU摻入(紅色)的雙重檢測(cè)，評(píng)估OSC增殖。圖6e顯示在24孔培養(yǎng)板中傳代和接種2.5 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔后，小鼠OSC的無(wú)MEF培養(yǎng)物的常見生長(zhǎng)曲線。圖6f顯示使用COOH抗體檢測(cè)增殖數(shù)月后的小鼠OSC中VASA的細(xì)胞表面表達(dá)的FACS分析(顯示的實(shí)例，第45代)。圖6g顯示起始卵巢材料和在4個(gè)月或更多個(gè)月的體外增殖后培養(yǎng)的小鼠OSC和人OSC的基因表達(dá)譜(無(wú)RT，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄情況下RNA樣品的PCR ; β -肌動(dòng)蛋白，樣品內(nèi)參對(duì)照)。顯示從兩位不同患者建立的兩個(gè)不同的人OSC系(0SC1和0SC2)作為實(shí)例。圖6h和圖6i顯示無(wú)MEF培養(yǎng)物中小鼠OSC(h)和人OSC(i)的BUMP1、STELLA和FRAGILIS表達(dá)(綠色)的代表性免疫熒光分析。細(xì)胞用DAPI (藍(lán)色)和羅丹明-鬼筆環(huán)肽(紅色)復(fù)染以分別顯現(xiàn)核DNA和胞質(zhì)F-肌動(dòng)蛋白。
[0056]圖7描述來(lái)自培養(yǎng)的小鼠OSC和人OSC的自發(fā)卵子發(fā)生。圖7a至7c提供由培養(yǎng)下的小鼠OSC形成的不成熟卵母細(xì)胞的實(shí)例，如通過(guò)形態(tài)(7a)、卵母細(xì)胞標(biāo)記蛋白VASA和KIT表達(dá)(7b ;注意VASA的胞質(zhì)定位)和編碼卵母細(xì)胞標(biāo)記基因Vasa、KIT、Msy2 (也稱作Y 盒蛋白 2或Ybx2)、Nobox、Lhx8、Gdf9、Zpl、Zp2和 Zp3 (7c ;無(wú) RT、無(wú)逆轉(zhuǎn)錄情況下 RNA 樣品的PCR;i3-肌動(dòng)蛋白、樣品內(nèi)參對(duì)照)的mRNA的存在進(jìn)行評(píng)估。比例尺，25μπι。圖7d顯示在24孔培養(yǎng)板中傳代和接種2.5X IO4個(gè)細(xì)胞/孔后24、48和72小時(shí)，由小鼠OSC形成的不成熟卵母細(xì)胞的數(shù)目(在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)上清液以用于測(cè)定，并且因此，這些值代表每個(gè)24小時(shí)時(shí)間段內(nèi)生成的數(shù)目，而非累積數(shù)目；均值土SEM，n=3份獨(dú)立培養(yǎng)物)。圖7e至7g顯示來(lái)自人OSC的體外卵子發(fā)生，顯示了由培養(yǎng)下的人OSC形成的不成熟卵母細(xì)胞(7f，形態(tài)；7g，卵母細(xì)胞標(biāo)記蛋白VASA、KIT、MSY2和LHX8的表達(dá))和在24孔培養(yǎng)板中傳代并接種2.5 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔后所形成的數(shù)目(7e ;均值土 SEM，n=3份獨(dú)立培養(yǎng)物)的實(shí)例。在小圖C中顯示人OSC衍生的卵母細(xì)胞中編碼卵母細(xì)胞標(biāo)記基因(Vasa、Kit、Msy2、Nobox、Lhx8、Gdf9, ZpU Zp2、Zp3)的mRNA的存在、連同小鼠OSC衍生的卵母細(xì)胞的結(jié)果。比例尺，25 μ m。在圖7h中，在培養(yǎng)的人OSC的胞核中顯示基于免疫熒光對(duì)減數(shù)分裂重組標(biāo)記DMCl (mckl同源物的劑量阻抑蛋白)和SYCP3 (聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白質(zhì)3)(對(duì)比藍(lán)色DAPI復(fù)染的紅色)的檢測(cè)；人卵巢基質(zhì)細(xì)胞充當(dāng)陰性對(duì)照。在圖7i中，在傳代后72小時(shí)顯示基于FACS對(duì)培養(yǎng)的人OSC的倍性分析。在圖9中展示來(lái)自培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞(陰性對(duì)照)和培養(yǎng)的小鼠OSC的倍性分析結(jié)果。
[0057]圖8描述對(duì)成年 人類卵巢中卵母細(xì)胞特異性標(biāo)記的檢測(cè)。顯示了成年人類卵巢皮層組織中的卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的VASA(8a，紅色)、KIT(8b，綠色)、MSY2(8c，紅色)和LHX8 (8d，綠色)的免疫熒光分析(也見圖1Oh)。切片用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染以便顯現(xiàn)胞核。比例尺，25 μ m。
[0058]圖9描述培養(yǎng)下的人成纖維細(xì)胞和小鼠OSC的倍性分析。圖9a和圖9b顯示基于FACS的對(duì)分裂活躍的人胎腎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中(9a)和傳代后48小時(shí)收集的小鼠OSC中(9b)倍性狀態(tài)的代表性評(píng)估。僅在種系培養(yǎng)物中檢測(cè)到單倍體(In)細(xì)胞，與來(lái)自體外維持的人OSC的分析的結(jié)果一致(見圖7i)，而全部培養(yǎng)物均含有二倍體(2n)和四倍體(4n)細(xì)胞群。
[0059]圖10描述從來(lái)自人卵巢組織中的人OSC產(chǎn)生卵母細(xì)胞。顯示在分散、與GFP-hOSC(IOa)再聚集和體外培養(yǎng)24-72小時(shí)(IObUOc)后人卵巢皮層組織的直接(活細(xì)胞)GFP熒光分析。注意在類似于卵泡的致密結(jié)構(gòu)中由較小GFP陰性細(xì)胞包圍的巨大單一GFP陽(yáng)性細(xì)胞的形成(圖1Ob和圖1Oc ;比例尺，50 μ m)。顯示成年人類卵巢皮層組織中含有GFP陽(yáng)性卵母細(xì)胞的不成熟卵泡(棕色，由黑色箭頭突出顯示，對(duì)比藍(lán)色蘇木精復(fù)染)的實(shí)例，所述成年人類卵巢皮層組織用GFP-hOSC注射并且異體移植至NOD / SCID雌性小鼠中(圖10d，移植后I周；圖1Of，移植后2周)。注意相同移植體中具有GFP陰性卵母細(xì)胞的可比較卵泡。作為陰性對(duì)照，在隨上文顯示的樣品一起平行處理以便進(jìn)行GFP檢測(cè)后，在GFP-hOSC注射并異體移植之前(IOe)或在異體移植之前接受溶媒注射(無(wú)GFP-hOSC)(IOg)的人卵巢皮層組織中的全部不成熟卵泡均含有GFP陰性卵母細(xì)胞。圖1Oh顯示接受GFP-hOSC注射的異體移植物中GFP表達(dá)(綠色)和雙線期卵母細(xì)胞特異性標(biāo)記MSY2 (紅色)或卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子LHX8(紅色)的雙重免疫熒光分析。注意，在GFP-hOSC注射之前，在移植體中檢測(cè)不到GFP，而在全部卵母細(xì)胞中檢測(cè)到MSY2和LHX8。切片用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染以便顯現(xiàn)胞核。比例尺，25tm。
[0060]圖11描述了基于形態(tài)測(cè)量對(duì)GFP-hOSC移植后人卵巢異體移植物中卵母細(xì)胞形成的評(píng)估。顯示在注射GFP-hOSC并異體移植到NOD / SCID小鼠中7日后，3份隨機(jī)選擇的人卵巢皮層組織樣品(標(biāo)記為1、2和3)中原始卵泡和初級(jí)卵泡的總數(shù)，所述樣品含有GFP陰性(宿主衍生的)或GFP陽(yáng)性(0SC衍生的)卵母細(xì)胞(例如，見圖1Od至IOg)。
[0061]圖12描述人卵巢皮層組織和新鮮分離的人OSC的冷凍保存和解凍。圖12a和12b顯示成年人類卵巢皮層組織在玻璃化之前和之后的組織學(xué)外觀，突出顯示維持組織完整性和幸存于凍融方法的大量卵母細(xì)胞(黑色箭頭)。在圖12c中，顯示在新鮮分離的人OSC凍融后的細(xì)胞損失百分比(來(lái)自兩位不同患者的結(jié)果)。
[0062]圖13描述在2011年4月14日提交的名為“用于自體種系線粒體能量轉(zhuǎn)移的組合物和方法”的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61 / 475，561中描述的自體種系線粒體能量轉(zhuǎn)移方法的概述。注意，用作線粒體來(lái)源以便轉(zhuǎn)移的OSC和將接受線粒體的待受精的卵子獲得自相同的受試者。
[0063]圖14描述了 在雌性生殖周期的動(dòng)情期期間，利用Vasa的細(xì)胞表面表達(dá)來(lái)分離細(xì)胞，基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)從成年雌性小鼠的骨髓制備物純化的生殖細(xì)胞。
[0064]圖15描述了在雌性生殖周期的動(dòng)情期期間，利用Vasa的細(xì)胞表面表達(dá)來(lái)分離細(xì)胞，基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)從成年雌性小鼠的外周血制備物純化的生殖細(xì)胞。
[0065]圖16描述作為限制熱量攝入量(“CR”)的結(jié)果，防止衰老相關(guān)的排卵的卵母細(xì)胞數(shù)目下降。㈧在誘導(dǎo)3月齡(3M)隨意(AL)膳食(AL)采食(n=6)、12月齡(12M)隨意采食(n=12)和12M CR-隨意采食(n=6)的小鼠排卵后獲得的卵母細(xì)胞的產(chǎn)率和形態(tài)(均值土SEM ;*，P〈0.05，相對(duì)于3M隨意采食的雌小鼠)。(B)每個(gè)雌性每個(gè)誘導(dǎo)排卵周期，發(fā)育至胚泡的體外受精中期II (MII)的卵母細(xì)胞的數(shù)目(n=ll-16只小鼠組；均值土SEM;*，P〈0.05，相對(duì)于3M隨意采食的雌小鼠)。(C)在3M隨意采食、12M隨意采食和12M AL-CR采食的小鼠中每個(gè)卵巢的非閉鎖不成熟卵泡的數(shù)目(均值土SEM，n=9-14只小鼠/組；*，P〈0.05，相對(duì)于3M隨意采食的雌小鼠；**，P〈0.05)。
[0066]圖17描述在IVF后對(duì)植入前胚胎發(fā)育缺少CR影響。(A和B)從3M隨意采食、12M隨意采食和12M CR-隨意采食的雌小鼠小鼠采集的在體外受精后發(fā)育成至2細(xì)胞期胚(2CE)的去卵丘細(xì)胞的MII卵母細(xì)胞㈧或卵丘包圍的卵母細(xì)胞⑶的百分比，和分別發(fā)育成胚泡期⑶胚的2CE或授精的總卵母細(xì)胞(TIO)的百分比[分別是B(2CE)和Β(ΤΙ0)]。數(shù)據(jù)是以下項(xiàng)的均值土SEM = (A)使用每組總計(jì)6-9只小鼠，η=來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的55-140個(gè)無(wú)卵丘MII卵母細(xì)胞；(B)使用每組總計(jì)5-7只小鼠，η=來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的38-144個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。
[0067]圖18描述卵母細(xì)胞產(chǎn)率和體重之間的關(guān)系。(A和B)在3M隨意采食(A)、12M隨意采食⑶和12M CR-隨意采食(C)的雌小鼠中基于逐只小鼠，相對(duì)于超數(shù)排卵的卵母細(xì)胞產(chǎn)率評(píng)估體重。
[0068]圖19描述通過(guò)CR防止MII卵母細(xì)胞中衰老相關(guān)的非整倍性。(A)含有21條染色體的超倍體MII卵母細(xì)胞的實(shí)例(DNA的DAPI染色以藍(lán)色顯示)的實(shí)例。(B)在3M隨意采食、12M隨意采食和12M CR-隨意采食的雌小鼠的MII卵母細(xì)胞中超倍性、亞倍性和姐妹染色單體過(guò)早分離(和來(lái)自全部3個(gè)合并終點(diǎn)的總?cè)旧w缺陷)的發(fā)生率(均值土 SEM，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，η=每組分析的18-23個(gè)成熟卵母細(xì)胞，重復(fù)4次，使用總計(jì)20-34只小鼠/組；*，Ρ〈0.05，相對(duì)于3Μ隨意采食的雌小鼠；nd，未檢測(cè)到)。
[0069]圖20描述通過(guò)CR防止衰老女性的卵母細(xì)胞中的紡錘體和染色體排列缺陷。(A和B)在3M隨意采食、12M隨意采食和12M CR-隨意采食的小鼠的MII卵母細(xì)胞中紡錘體異常㈧和赤道板上染色體錯(cuò)排列⑶的發(fā)生率(均值土SEM，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，η=每組分析的3-20個(gè)卵母細(xì)胞，重復(fù)4-7次，使用總計(jì)4-8只小鼠/組；*，Ρ〈0.05，相對(duì)于3Μ隨意采食的雌小鼠)。(C)在用α-微管蛋白抗體(綠色)標(biāo)記并用PI(紅色)復(fù)染DNA后，來(lái)自所示小鼠的MII卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂紡錘體的代表性實(shí)例(η=每組分析的22-72個(gè)卵母細(xì)胞)。
[0070]圖21描述通過(guò)CR在衰老雌性的卵母細(xì)胞中維持正常線粒體動(dòng)力學(xué)。(A)來(lái)自3Μ隨意采食、12Μ隨意采食和12Μ CR-隨意采食的小鼠的MII卵母細(xì)胞中的代表性線粒體分布(Mito Tracker染色以紅色顯示)。(B)在來(lái)自3M隨意采食、12M隨意采食和12M CR-隨意采食的小鼠的MII卵母細(xì)胞中異常線粒體聚集的發(fā)生率(均值土SEM，η=來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的每組分析的23-46個(gè)卵母細(xì)胞，使用4-11只小鼠/組；*，Ρ〈0.05，相對(duì)于3Μ隨意采食的雌小鼠)。(C)在來(lái)自3Μ隨意采食、12Μ隨意采食和12Μ CR-隨意采食的小鼠的各個(gè)MII卵母細(xì)胞中的胞質(zhì)ATP水平(均值`土 SEM，n=來(lái)自5_7個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的每組分析的總計(jì)38-145個(gè)卵母細(xì)胞，使用總計(jì)5-21只小鼠/組；*，P〈0.05，相對(duì)于3M隨意采食的雌小鼠)。
[0071]圖22描述衰老雌性中卵母細(xì)胞產(chǎn)率和品質(zhì)因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體Y輔激活物I a (PGC-1 α )丟失導(dǎo)致的改善。(A) 3M隨意采食野生型(wt)小鼠、12M隨意采食或CR-隨意采食野生型小鼠或12M隨意采食或CR-隨意采食Pgc-1 α -無(wú)效小鼠的分離的MII卵母細(xì)胞中Pgc-1 α和Pgc-1 β mRNA水平的RT-PCR分析(肌動(dòng)蛋白，樣品載量的對(duì)照基因；大小，分子大小標(biāo)記；0v，用作陽(yáng)性對(duì)照的成年卵巢RNA ;_RT，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶作為陰性對(duì)照的情況下對(duì)卵巢RNA的RT-PCR分析)。(B-E)顯示了隨意采食和CR-隨意采食的雌小鼠中PGC-1 α缺乏對(duì)超數(shù)排卵后卵母細(xì)胞產(chǎn)率(B)、減數(shù)分裂紡錘體形成(C)、赤道板上的染色體排列(D)和線粒體分布(E)的影響。(D)和(E)的圖注與(C)相同。數(shù)據(jù)是均值+SEM(η=對(duì)每個(gè)終點(diǎn)而言來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的每組分析的20-117個(gè)卵母細(xì)胞，使用總計(jì)3-14只小鼠/組；*，Ρ〈0.05，相對(duì)于全部其他組)。
[0072]圖23描述PGC-1在卵母細(xì)胞中的表達(dá)。年輕成年小鼠卵巢中對(duì)PGC-1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)(對(duì)比藍(lán)色蘇木精復(fù)染的棕色反應(yīng)產(chǎn)物)。插圖顯示典型陽(yáng)性卵母細(xì)胞的放大圖像。
[0073]圖24描述在缺少PGC-1 α的小鼠中隨年齡而削弱的卵巢儲(chǔ)備。在3Μ隨意采食、12Μ隨意采食或12Μ AL-CR采食的野生型(wt)或PGC-1 α缺陷(無(wú)效)雌性小鼠中每個(gè)卵巢的非閉鎖靜息(原始)和早期生長(zhǎng)(初級(jí)、竇前期)不成熟卵泡數(shù)目。數(shù)據(jù)是均值土SEM(n=4-12只小鼠/組；*，P〈0.05，相對(duì)于任一種基因型的3M隨意采食的雌小鼠)。
[0074]圖25描述年輕和衰老雌性小鼠的卵巢中PGC-1的可比較水平。(A)年輕(3M)隨意采食、衰老(12M)的隨意采食和衰老(12M)的CR-隨意采食的雌小鼠的卵巢中內(nèi)源PGC-1蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析(每個(gè)組顯示從3只不同小鼠制備的樣品)。使用泛肌動(dòng)蛋白(肌動(dòng)蛋白)作為內(nèi)參對(duì)照。(B)在用來(lái)獲得PGC-1蛋白質(zhì)印跡法(A)的樣品的相同雌小鼠的卵巢中PGC-1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)(對(duì)比藍(lán)色蘇木精復(fù)染的棕色反應(yīng)產(chǎn)物)的實(shí)例。
[0075]圖26描述飲食操控對(duì)體重的影響。就在啟動(dòng)CR膳食(3M)之前、當(dāng)完成CR方案(IlM)時(shí)和恢復(fù)隨意采食(12M)后I個(gè)月的雌性小鼠體重。所示的數(shù)據(jù)是來(lái)自分析5-23只小鼠/組的均值土SEM(*，P〈0.05，相對(duì)于每個(gè)相應(yīng)組中3M隨意采食的雌小鼠)。JAX，C57BL / 6 小鼠來(lái)自 Jackson Laboratories ；NIA, C57BL / 6 小鼠來(lái)自 NIA ;Pgc_l α ,突變小鼠品系從 Β.Μ 獲得。Spiegelman(Lin(林)等人，Cell (細(xì)胞)2004119 =121-135) ?
[0076]圖27描述通過(guò)CR防止衰老相關(guān)的雌性生殖周期破壞。顯示典型4-5日動(dòng)情周期或持續(xù)超過(guò)5日的非典型動(dòng)情周期的衰老(12M)的隨意采食和CR-隨意采食的雌小鼠的比例。數(shù)據(jù)來(lái)自30天時(shí)間內(nèi)通過(guò)每日陰道抹片平行分析的10-15只小鼠/組。
[0077]圖28描述線粒體DNA拷貝數(shù)(相對(duì)于核基因組)。在培養(yǎng)下維持的小鼠0SC(Zou (鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估線粒體DNA(mtDNA)含量。
[0078]圖29描述線粒體膜電位。在培養(yǎng)下維持的小鼠OSC (Zou (鄒)等人，Nat CellBiol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估線粒體膜電位(MMP)。
[0079]圖30描述線粒體DNA拷貝數(shù)(相對(duì)于核基因組)。在培養(yǎng)下維持的小鼠0SC(Zou (鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估線粒體DNA拷貝數(shù)。
[0080]圖31描述作為線粒體活性量度的ATP水平。在培養(yǎng)下維持的小鼠0SC(Zou(鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911:631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估線粒體活性。
[0081]圖32描述如染料NAO所計(jì)量的線粒體密度增加百分比。在培養(yǎng)下維持的小鼠0SC(Zou (鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估線粒體密度。
[0082]圖33描述已知驅(qū)動(dòng)線粒體生物生成和能量學(xué)的基因的mRNA水平。在培養(yǎng)下維持的小鼠0SC(Zou (鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估已知驅(qū)動(dòng)線粒體生物生成的基因的表達(dá)水平。
[0083]圖34描述編碼線粒體電子傳遞鏈組分的基因的mRNA水平。在培養(yǎng)下維持的小鼠0SC(Zou (鄒)等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估編碼線粒體電子傳遞鏈組分的基因的表達(dá)水平。
[0084]圖35描述用線粒體增強(qiáng)劑處理的OSC中NAD+(A)和NADH(B)的水平。在培養(yǎng)下維持的小鼠OSC (Zou (鄒 )等人，Nat Cell Biol (天然細(xì)胞生物學(xué))200911 =631-636)暴露于所指明的測(cè)試化合物24小時(shí)并且隨后評(píng)估NAD+和NADH的水平。[0085]圖36描述用線粒體示蹤劑(mitotracker)M7514染色和裂解細(xì)胞后的線粒體。將人OSC與M7514孵育并隨后使用滲透休克法裂解以釋放染色的線粒體。通過(guò)FACS分析整個(gè)群體(來(lái)自裂解細(xì)胞和殘余的未裂解的染色細(xì)胞的線粒體)。左小圖顯示來(lái)自裂解細(xì)胞的線粒體，所示線粒體基于大小可容易地與包含于殘余的未裂解的細(xì)胞中的線粒體區(qū)分(前向散射；FSC-A)。熒光強(qiáng)度(FITC-A)揭示來(lái)自裂解細(xì)胞的兩個(gè)不同線粒體群體，一者具有高強(qiáng)度(Mito MT高)并且另一個(gè)具有低強(qiáng)度(Mito MIMS)。已知功能性線粒體具有較大的染料攝取和停留，并且因此在更高強(qiáng)度時(shí)發(fā)熒光(InvitiOgen(英杰公司)技術(shù)人員)。
[0086]圖37是描述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NAD+合成和降解的途徑的示意圖(Hassa，P.(哈薩，P.)等人，Microbiol.Mol.Biol.Rev.(微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論)2006年，第70卷，第3期，789-829)。
[0087]圖38顯示示例性NAD+的可溶性前體的結(jié)構(gòu)。這些藥劑可以用來(lái)在受損和/或衰老的細(xì)胞中升高細(xì)胞NAD+水平并且增強(qiáng)細(xì)胞能量學(xué)。
[0088]圖39A-39C是顯示煙酰胺單核苷酸升高鼠卵原干細(xì)胞(OSC)中細(xì)胞NAD+和NAD+ / NADH的圖?；诩兓缓蠐诫s性卵母細(xì)胞的OSC的分選方案，使用FACS從解離的卵巢分離卵原干細(xì)胞(見實(shí)例I)。在培養(yǎng)基中維持細(xì)胞，所述培養(yǎng)基由極限基本培養(yǎng)基a (MEMa)、10% FBS、lmM丙酮酸鈉、ImM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.ΙπιΜβ-巰基乙醇(Sigma(西格瑪公司))，IOng / ml-lLIF(Millipore (密理博公司))、IX N-2MAX 培養(yǎng)基補(bǔ)充物(R&D)、10ng / mL EGF(人重組表皮生長(zhǎng)因子；Gibco(吉博科公司))，40ng / mL人⑶NF(源自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；R&D Systems (R&D系統(tǒng)公司))、lng / mL人bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Gibco(吉博科公司))組成。
[0089]圖40是顯示煙酰胺單核苷酸增加鼠OSC中線粒體DNA含量的圖。在指示的時(shí)間點(diǎn)使用DNeasy血液及組織試劑盒(Qiagen (凱杰公司))，根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞分離細(xì)胞總 DNA。使用 LightCycler480SYBR Green I Master (Roche Applied Science(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司))，使用Roche480PCR儀，將`Mt DNA拷貝數(shù)定量。
[0090]圖41是顯示煙酰胺單核苷酸增加培養(yǎng)的鼠卵原干細(xì)胞中自發(fā)性卵母細(xì)胞形成的圖。為評(píng)估自發(fā)性卵母細(xì)胞形成，將24孔平板的每個(gè)孔用25，000個(gè)OSC接種，并且在接種后第二日以及NMN處理后的指定時(shí)間點(diǎn)評(píng)估每孔形成并釋放入培養(yǎng)基的卵母細(xì)胞的數(shù)目。
[0091]圖42是顯示NAD+前體NMN升高年輕和年老小鼠中體內(nèi)NAD+水平的圖。心[MD+]隨年齡而下降并且被NMN處理逆轉(zhuǎn)(n=3 ；200mg.kg.d.腹內(nèi)，持續(xù)I周)。
[0092]圖43A-D是顯示NAD+前體(NMN)對(duì)體內(nèi)線粒體功能的恢復(fù)作用的圖。在僅I周處理后，24月齡小鼠的骨骼肌中線粒體功能的下降被NMN(煙酰胺單核苷酸)徹底逆轉(zhuǎn)(圖43A、B)。NMN通過(guò)腹膜內(nèi)(1.P.)注射遞送并且升高腦、心臟和骨骼肌中的NAD+水平約30-100%。NMN以SIRTl依賴性方式增加C2C12細(xì)胞中的線粒體功能(圖43C，D)，sh Ctl=亂序 shRNA，ShSIRTl=針對(duì) SIRTl 的 shRNA。
[0093]圖44是顯示芹菜素、木犀草素和SRT-1720影響來(lái)自衰老雌性小鼠的卵母細(xì)胞產(chǎn)率的柱狀圖。
[0094]圖45是與衰老的雌性小鼠相比，顯示芹菜素、木犀草素和SRT-1720影響超數(shù)排卵后采集的成熟、中期II卵母細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0095]圖46是與衰老的雌性小鼠相比，顯示芹菜素、木犀草素和SRT-1720改善衰老小鼠中的卵母細(xì)胞品質(zhì)的柱狀圖。
[0096]本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
[0097]定義
[0098]除非另外限定，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在矛盾的情況下，本申請(qǐng)(包括定義)將居主導(dǎo)。
[0099]術(shù)語(yǔ)“施用(administration) ”或“施用(administering) ”包括向受試者引入一種或多種化合物以執(zhí)行其預(yù)期功能的途徑?？梢允褂玫氖┯猛緩降膶?shí)例包括注射(皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹內(nèi)、鞘內(nèi))、口服和經(jīng)皮。當(dāng)然，通過(guò)合適每種施用途徑的形式給予藥物制品。例如，將這些制品以片劑或膠囊劑形式、通過(guò)注射或吸入施用。優(yōu)選口服施用。注射可以是快速濃注(bolus)或可以是連續(xù)輸注。取決于施用途徑，化合物可以用選擇的材料包衣或分布在選擇的材料中，以便保護(hù)它免受天然條件影響，所述天然條件可能有害地影響它執(zhí)行其預(yù)期功能的能力。
[0100]該藥劑可以單獨(dú)施用，或結(jié)合另一種如上文所述的藥劑(例如另一種生物能劑)或藥學(xué)上可接受的載體或這二者一起施用?；衔锟梢栽谑┯昧硪环N藥劑之前、與之同時(shí)或在施用該藥劑之后施用。另外，化合物也可以按原形式(proform)施用，所述原形式在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成其有活性的代謝物或更有活性的代謝物。
[0101]如本文所用，在涉及人類時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高育齡”指年齡34歲或更大的女性。如本文所用，在涉及人類時(shí)，術(shù)語(yǔ)“卵母細(xì)胞相關(guān)的不育”指無(wú)保護(hù)的性交I年后不能受孕，所述不能受孕不由解剖畸形 (例如，阻塞的輸卵管)或病理狀況(例如，子宮纖維瘤、嚴(yán)重子宮內(nèi)膜異位癥、II型糖尿病、多囊性卵巢疾病)引起。
[0102]術(shù)語(yǔ)“烷基”指飽和脂族基團(tuán)的原子團(tuán)，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)基團(tuán))、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。該術(shù)語(yǔ)坑基進(jìn)一步包括這些烷基，所述烷基還可以包括替換烴主鏈的一個(gè)或多個(gè)碳的氧、氮、硫或磷原子，例如，氧、氮、硫或磷原子。在優(yōu)選的實(shí)施例中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈中具有30個(gè)或更少的碳原子(例如，對(duì)于直鏈，C1-C30 ;對(duì)于支鏈，C3-C3tl)、優(yōu)選地26個(gè)或更少的并且更優(yōu)選地20個(gè)或更少的碳原子。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在它們的環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-10個(gè)碳原子并且更優(yōu)選地在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3、4、5、6或7個(gè)碳。
[0103]另外，如本說(shuō)明書和權(quán)利要求書通篇范圍所用的術(shù)語(yǔ)烷基意在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者指在烴主鏈的一個(gè)或多個(gè)碳上具有替換氫的取代基的烷基部分。這類取代基可以包括，例如鹵素、羥基、烷基擬基氧基、芳基擬基氧基、烷氧基擬基氧基、芳氧基擬基氧基、竣化物、烷基擬基、燒氧擬基、氣基擬基、燒硫基擬基、烷氧基、憐酸酷、勝酸基(phosphonato)、次膦酰基(phosphinato)、氰基、氨基(包括燒氨基、二燒氨基、芳氨基、二芳?xì)饣蜔蓟鶜饣?、酸氣基(包括烷基擬氣基、芳基擬氣基、氣甲酸基和服基)、脈基、亞氨基、硫氫基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯(sulfonato)、氨磺酰基、亞磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳族或雜芳族部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，烴鏈上取代的部分可以根據(jù)需要本身被取代。環(huán)烷基可以進(jìn)一步例如用上文描述的取代基取代?！巴榛蓟辈糠质怯梅蓟?例如，苯基甲基(芐基))取代的烷基。術(shù)語(yǔ)“烷基”也包括在長(zhǎng)度上類似并且可能取代上述烷基，但分別含有至少一個(gè)雙鍵或叁鍵的不飽和脂族基團(tuán)。[0104]除非另外指定碳的數(shù)目，否則如本文所用的“低級(jí)烷基”意指如上文定義，但是在其主鏈結(jié)構(gòu)中具有從I至10個(gè)碳原子、更優(yōu)選地從I個(gè)至10個(gè)和最優(yōu)選地從I個(gè)至4個(gè)碳原子的烷基，所述烷基可以是直鏈或支鏈的。低級(jí)烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、己基、庚基、辛基等。在優(yōu)選的實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”包括在其主鏈中具有4個(gè)或更少碳原子的直鏈烷基，例如，C1-C4烷基。
[0105]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷氧基”指經(jīng)氧原子與另一個(gè)部分連接的烷基或環(huán)烷基。烷氧基可以任選地由一個(gè)或多個(gè)取代基取代。
[0106]術(shù)語(yǔ)“烷氧基烷基”、“聚氣基烷基”和“硫代烷氧基烷基”指如上文所述的烷基，所述烷基還包括替換烴主鏈的一個(gè)或多個(gè)碳的氧、氮或硫原子，例如，氧、氮或硫原子。
[0107]術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”和“炔基”指在長(zhǎng)度上類似并且可能取代上述烷基，但分別含有至少一個(gè)雙鍵或叁鍵的不飽和脂族基團(tuán)。例如，本發(fā)明構(gòu)思氰基和炔丙基。
[0108]術(shù)語(yǔ)“芳基”指芳基原子團(tuán)，包括可以包含從O至4個(gè)雜原子的5元和6元單環(huán)芳基，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。芳基也包括多環(huán)稠合的芳基如萘基、喹啉基、吲哚基等。那些在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有雜原子的芳基也可以稱作“芳基雜環(huán)”、“雜芳基”或“雜芳族化合物”。芳環(huán)可以在一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置被如上文所述的這類取代基取代，例如鹵素、羥基、烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基擬基氧基、芳氧基擬基氧基、竣化物、烷基擬基、燒氧擬基、氣基擬基、燒硫基擬基、憐酸酷、勝酸基、次勝酸基、氰1基、氣基(包括燒氣基、二燒氣基、芳?xì)饣?、二芳?xì)饣蜔蓟鶜饣?、酸氣基(包括烷基擬氣基、芳基擬氣基、氣甲酸基和服基)、脈基、亞氣基、硫氧基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺?；喕酋０被?、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳族或雜芳族部分。芳基也可以與不是芳族的脂環(huán)或雜環(huán)稠合或橋接，從而形成多環(huán)(例如，四氫萘)。
[0109]術(shù)語(yǔ)“鹵素”或“鹵代”指-F、-Cl、-Br或-1。
[0110]術(shù)語(yǔ)“鹵代烷基”意在包括由鹵素單取代、雙取代或多取代的如上文定義的烷基，例如，氟甲基和三氟甲基。
[0111]術(shù)語(yǔ)“羥基”意指-0H。
[0112]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜原子”意指除碳或氫之外的任何元素的原子。優(yōu)選的雜原子是氮、氧、硫和磷。
[0113]術(shù)語(yǔ)“雜芳基”指芳族5-8元單環(huán)、8-12元雙環(huán)、或11-14元三環(huán)系統(tǒng)，所述環(huán)系統(tǒng)如果是單環(huán)則具有1-4個(gè)環(huán)雜原子，如果是雙環(huán)則具有1-6個(gè)雜原予，或如果是三環(huán)則具有1-9個(gè)雜原子，所述雜原子選自0，N，或S，并且剩余環(huán)原子是碳。雜芳基可以任選地由一個(gè)或多個(gè)取代基取代。雜芳基的實(shí)例包括但不限于吡啶基、呋喃基、苯并二氧雜環(huán)戊烯基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基噻唑基、異噁唑基、喹啉基、吡唑基、異噻唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、三唑基、噻二唑基、異喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、吲嗪基、咪唑并吡啶基、四唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、和Π引噪基。
[0114]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)的”指在環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有除碳之外的至少一個(gè)原子(例如，S，O, N)的有機(jī)化合物。這些有機(jī)化合物中的環(huán)結(jié)構(gòu)可以是芳族或非芳族的。雜環(huán)部分的一些實(shí)例包括，不限于吡啶、嘧啶、吡咯烷、呋喃、四氫呋喃、四氫噻吩和二噁烷。如本文所用，“生物能劑”指在卵母細(xì)胞、OSC和/或植入前胚胎中，在實(shí)施體外受精方法之前和/或在體外受精方法后或在卵巢、卵母細(xì)胞、OSC和/或植入前胚胎體內(nèi)暴露后增強(qiáng)線粒體數(shù)目、線粒體活性、細(xì)胞能量水平或細(xì)胞產(chǎn)能潛力(統(tǒng)稱為“生物能狀態(tài)”)的藥劑。具體而言，通過(guò)增強(qiáng)線粒體數(shù)目或活性，本發(fā)明的生物能劑改善卵母細(xì)胞或OSC產(chǎn)生和品質(zhì)，例如，通過(guò)防止或減少衰老相關(guān)的卵母細(xì)胞非整倍體增加、赤道板上染色體錯(cuò)排列、減數(shù)分裂紡錘體異常和/或線粒體功能障礙(聚集，受損的ATP產(chǎn)生)。生物能劑包括Sirtl激活物。表I中列出示例性Sirtl激活物(下文)。
[0115]表1 =Sirtl 激活物
【權(quán)利要求】
1.組合物，其包含分離的細(xì)胞和生物能劑，所述分離的細(xì)胞選自卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC的后代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿和CD38抑制劑及其功能衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述生物能劑是具有式1-XV中任一者的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其還包含溶液，所述溶液選自:細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌溶液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、玻璃化溶液和冷凍保存溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述OSC是能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任選的階段特異性胚胎抗原的分離的非胚胎干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述OSC從卵巢組織獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述OSC從非卵巢組織獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述非卵巢組織是血液。
9.根據(jù)權(quán)利要求 7所述的組合物，其中所述非卵巢組織是骨髓。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含卵巢組織、卵泡、骨髓、臍帶血或外周血。
11.相對(duì)于參比具有增強(qiáng)的線粒體功能的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC的后代，其中所述細(xì)胞已經(jīng)與生物能劑接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述生物能劑選自:漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿和CD38抑制劑及其功能衍生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述生物能劑選自具有式1-XV的化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有增加的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或增加的ATP生成能力。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞,其中線粒體數(shù)相對(duì)于參比細(xì)胞增加約10%、20%、30%、40%、50%或約 60%。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞,其中增加的線粒體功能通過(guò)測(cè)定mtDNA含量、ATP、NAD+ / NADH、線粒體質(zhì)量、膜電位、和已知的線粒體質(zhì)量調(diào)節(jié)因子和電子傳遞鏈組分的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在選自以下的溶液中:細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌溶液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、玻璃化溶液和冷凍保存溶液。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述OSC是能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任選的階段特異性胚胎抗原的分離的非胚胎干細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述OSC從卵巢組織獲得。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述OSC從非卵巢組織獲得。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述非卵巢組織是血液。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述非卵巢組織是骨髓。
23.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在具有卵巢組織、卵泡、骨髓、臍帶血或外周血的混合物中。
24.組合物，其包含OSC線粒體或卵母細(xì)胞線粒體以及生物能劑，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中包含OSC線粒體的所述組合物是無(wú)胞核的OSC胞質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中包含卵母細(xì)胞線粒體的所述組合物是無(wú)胞核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中包含OSC線粒體的所述組合物是從OSC獲得的線粒體的經(jīng)純化制備物。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中包含卵母細(xì)胞線粒體的所述組合物是從卵母細(xì)胞獲得的線粒體的經(jīng)純化制備物。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述OSC是能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任選的階段特異性胚胎抗原的分離的非胚胎干細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述OSC從卵巢組織獲得。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述OSC從非卵巢組織獲得。
32.根據(jù)權(quán)利要求31 所述的組合物，其中所述非卵巢組織是血液。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述非卵巢組織是骨髓。
34.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是卵巢干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)與生物能劑接觸。
35.分離的線粒體,其中所述分離的線粒體已經(jīng)與生物能劑接觸,所述生物能劑選自具有式1-XV的化合物。
36.分離的線粒體,其中所述分離的線粒體已經(jīng)與生物能劑接觸,所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿和CD38抑制劑及其功能衍生物。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的線粒體，其中所述線粒體相對(duì)于參比具有增加的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或增加的ATP生成能力。
38.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的線粒體，其中線粒體數(shù)增加約1O%、20 %、30 %、40%、50%或約 60%。
39.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的線粒體，其中增加的線粒體功能通過(guò)測(cè)定mtDNA含量、ATP、NAD+ / NADH、線粒體質(zhì)量、膜電位、和已知的線粒體質(zhì)量調(diào)節(jié)因子和電子傳遞鏈組分的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
40.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的線粒體，其中所述線粒體在細(xì)胞和生物能劑中，所述細(xì)胞選自卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC的后代。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的線粒體，其中所述細(xì)胞在選自以下的溶液中:細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌溶液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、玻璃化溶液和冷凍保存溶液。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的線粒體，其中所述OSC是能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任選的階段特異性胚胎抗原的分離的非胚胎干細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的線粒體，其中所述OSC從卵巢組織獲得。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的線粒體，其中所述OSC從非卵巢組織獲得。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的線粒體，其中所述非卵巢組織是血液。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的線粒體，其中所述非卵巢組織是骨髓。
47.根據(jù)權(quán)利要求40所述的線粒體，其中所述細(xì)胞在具有卵巢組織、卵泡、骨髓、臍帶血或外周血的混合物中。
48.分離的無(wú)細(xì)胞組合物，其包含OSC線粒體或卵母細(xì)胞線粒體以及生物能劑，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述OSC是能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任選的階段特異性胚胎抗原的分離的非胚胎干細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述OSC從卵巢組織獲得。`
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述OSC從非卵巢組織獲得。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述非卵巢組織是血液。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述非卵巢組織是骨髓。
54.制備用于體外受精(IVF)的卵母細(xì)胞的方法，所述方法包括將包含OSC線粒體和生物能劑的組合物轉(zhuǎn)移至自體卵母細(xì)胞中，從而制備所述用于體外受精的卵母細(xì)胞，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述OSC是能夠有絲分裂并且表達(dá)Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任選的階段特異性胚胎抗原的分離的非胚胎干細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述OSC從卵巢組織獲得。
57.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述OSC從非卵巢組織獲得。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述非卵巢組織是血液。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述非卵巢組織是骨髓。
60.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中包含OSC線粒體的所述組合物是無(wú)胞核的OSC胞質(zhì)。
61.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中包含OSC線粒體的所述組合物是從OSC獲得的線粒體的經(jīng)純化制備物。
62.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其還包括使所述卵母細(xì)胞體外受精以形成合子，以及將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中將所述合子和植入前期胚胎與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
64.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法制備的卵母細(xì)胞。
65.體外受精的方法，所述方法包括以下步驟: a)將來(lái)自雌性受試者的OSC與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物； b)獲得包含來(lái)自所述OSC的OSC線粒體的組合物； c)將所述組合物轉(zhuǎn)移至分離的自體卵母細(xì)胞中；以及 d)使所述自體卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其還包括將源自所述合予的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。
67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中步驟a)是任選的，并且步驟b和或步驟c)還包括將包含OSC線粒體的組合物與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿和CD38抑制劑及其功能衍生物。
68.制備用于體外受精的卵母細(xì)胞的方法，所述方法包括將包含卵母細(xì)胞線粒體和生物能劑的組合物轉(zhuǎn)移至自體卵母細(xì)胞中，從而制備用于體外受精的所述卵母細(xì)胞，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中包含卵母細(xì)胞線粒體的所述組合物是無(wú)胞核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)。
70.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中包含卵母細(xì)胞線粒體的所述組合物是從卵母細(xì)胞獲得的線粒體的經(jīng)純化制備物。
71.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法制備的卵母細(xì)胞。
72.體外受精的方法，所述方法包括以下步驟: a)將來(lái)自雌性受試者的卵母細(xì)胞與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-xv中任一者的化合物及其功能衍生物； b)獲得包含來(lái)自所述卵母細(xì)胞的卵母細(xì)胞線粒體的組合物； c)將所述組合物轉(zhuǎn)移至分離的自體卵母細(xì)胞中；以及 d)使所述自體卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其還包括將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。
74.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中步驟a)是任選的，并且步驟b)還包括將包含卵母細(xì)胞線粒體的組合物與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
75.體外受精的方法，所述方法包括以下步驟: a)將來(lái)自雌性受試者的卵母細(xì)胞與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-xv中任一者的化合物及其功能衍生物；以及 b)使所述卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。
76.組合物，其包含溶液和生物能劑，所述溶液選自:細(xì)胞培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞采集溶液、卵母細(xì)胞洗滌溶液、卵母細(xì)胞體外成熟介質(zhì)、卵泡體外成熟介質(zhì)、卵母細(xì)胞體外受精介質(zhì)、胚胎培養(yǎng)基、卵裂培養(yǎng)基、玻璃化溶液、冷凍保存溶液和胚胎解凍培養(yǎng)基，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
77.改善雌性受試者的受精能力的方法，所述方法包括將生物能劑以有效改善卵母細(xì)胞和/或OSC質(zhì)量、從頭產(chǎn)生 和/或排卵的卵母細(xì)胞產(chǎn)率的量施用至所述受試者,從而改善所述雌性受試者的受精能力，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中將所述生物能劑全身性施用至所述雌性受試者。
79.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中將所述生物能劑局部施用至所述雌性受試者的卵巢。
80.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中與參比標(biāo)準(zhǔn)物相比，所述雌性受試者的妊娠結(jié)果被改善。
81.體外受精的方法，所述方法包括以下步驟: a)將生物能劑以有效改善卵母細(xì)胞和/或OSC從頭產(chǎn)生、質(zhì)量和/或排卵的卵母細(xì)胞產(chǎn)率的量施用至雌性受試者，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物； b)從所述雌性受試者獲得卵母細(xì)胞；以及 c)使所述卵母細(xì)胞體外受精以形成合子。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中將所述生物能劑全身性施用至所述雌性受試者。
83.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中將所述生物能劑局部施用至所述雌性受試者的卵巢。
84.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中步驟a)在步驟b)和c)之前和/或在步驟b)和c)之后實(shí)施。
85.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其還包括步驟d)將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至所述雌性受試者的子宮中，并且繼續(xù)向所述雌性受試者施用所述生物能劑。
86.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中步驟b)和/或步驟c)還包括將所述卵母細(xì)胞與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
87.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中與參比標(biāo)準(zhǔn)物相比，所述雌性受試者的妊娠結(jié)果被改善。
88.維持有此需要的懷孕雌性受試者中的胚胎發(fā)育的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的生物能劑，從而維持所述懷孕雌性受試者中的胚胎發(fā)育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
89.根據(jù)權(quán)利要求88 所述的方法，其中將所述生物能劑全身性施用至所述雌性受試者。
90.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中將所述生物能劑局部施用至所述雌性受試者的卵巢。
91.恢復(fù)或增加有此需要的雌性受試者中的卵巢功能的方法，所述方法包括施用治療有效量的生物能劑，從而恢復(fù)所述雌性受試者中的卵巢功能，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-xv中任一者的化合物及其功能衍生物。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中將所述生物能劑全身性施用至所述雌性受試者。
93.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中將所述生物能劑局部施用至所述雌性受試者的卵巢。
94.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中所述雌性受試者具有卵巢功能早衰、因化療所致的不育或與衰老相關(guān)的降低的受精能力。
95.從雌性受試者制備用于收獲的組織或其細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述雌性受試者施用有效量的生物能劑，從而從所述雌性受試者制備用于收獲的所述組織或其細(xì)胞，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、DO1、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述組織選自:卵巢、卵泡、骨髓、臍帶血和外周血。
97.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述細(xì)胞選自卵母細(xì)胞、OSC和OSC的后代。
98.產(chǎn)生卵母細(xì)胞的方法，其包括在生物能劑的存在下，在足以使干細(xì)胞分化成卵母細(xì)胞的條件下培養(yǎng)選自0SC、胚胎干細(xì)胞、胰干細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的干細(xì)胞，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙瓜、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
99.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其還包括將源自所述合子的植入前期胚胎轉(zhuǎn)移至雌性受試者的子宮中。
100.根據(jù)權(quán)利要求66、72和98所述的方法，其中將所述植入前期胚胎與生物能劑一起孵育，所述生物能劑選自:色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、具有式1-XV中任一者的化合物、CD38抑制劑及其功能衍生物。
101.組合物，其包含分離的細(xì)胞和生物能劑，所述分離的細(xì)胞選自卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC的后代，所述組合物用于體外受精。
102.相對(duì)于參比具有增強(qiáng)的線粒體功能的分離的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞選自卵母細(xì)胞、卵原干細(xì)胞(OSC)或OSC的后代，其中所述細(xì)胞已經(jīng)與生物能劑接觸，所述分離的細(xì)胞用于體外受精。
103.生物能劑，其選自色氨酸、喹啉酸、煙酰胺單核苷酸、煙酰胺核糖核苷、煙酸、漆樹黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、D01、羥基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲雙胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制劑8、小檗堿、CD38抑制劑、具有式1-XV中任一者的化合物及其功能衍生物，所述生物能劑用于以下項(xiàng)組成的組中的一項(xiàng)或更多項(xiàng):改善雌性的受精能力、維持懷孕雌性中的胚胎發(fā)育、恢復(fù)或增加雌性中的卵巢功能、從雌性制備用于收獲的組織或其細(xì)胞以及制備卵母細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK103827293SQ201280040259
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月29日
【發(fā)明者】喬納森·李·蒂莉, 大衛(wèi)·A·辛克萊 申請(qǐng)人:通用醫(yī)療公司, 哈佛大學(xué)