用于生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7,7和聚酯的生物轉(zhuǎn)化工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明實(shí)施方案涉及用于在存在分離的酶或存在表達(dá)那些酶的重組宿主細(xì)胞的情況下生物合成雙官能或三官能C7鏈烷的方法。所述雙官能或三官能C7鏈烷可用作生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7,x、尼龍-x,7和聚酯的中間物。
【專利說明】用于生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7, 7和聚酯的生物轉(zhuǎn)化工藝
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2011年6月30日提交的美國臨時(shí)申請流水號61/503, 043和均為2011 年12月21日提交的美國臨時(shí)申請流水號61/578, 265 ;61/578, 272 ;和61/578, 289 ;以及 2012年6月29日提交的國際申請PCT/US2012/44984的權(quán)益，其完整內(nèi)容均通過提述并入 本文,如在本文中完整列出一樣。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于在存在一種或多種分離的酶或存在表達(dá)一種或多種 酶的重組宿主細(xì)胞的情況下生物合成產(chǎn)生雙官能或三官能C7鏈烷的方法。所述雙官能或 三官能C7鏈烷可用作生產(chǎn)例如尼龍-7、尼龍-7, X和/或尼龍-X，7的中間物。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 化學(xué)工業(yè)對可持續(xù)實(shí)踐的推動(dòng)聚焦于降低能量使用、再生原材料和減少貨物生產(chǎn) 期間產(chǎn)生的副產(chǎn)物。然而，化學(xué)工業(yè)極其依賴于將石油和天然氣作為基礎(chǔ)給料。鑒于與主要 石油化學(xué)品工藝有關(guān)的優(yōu)化狀態(tài)，將需要在給料使用和制造設(shè)計(jì)中的重大轉(zhuǎn)變以將能量、 散發(fā)和成本降低至其目前水平之下。生物技術(shù)提供了一種用于從可再生糖類如植物源的糖 或其他可再生給料如脂肪酸生產(chǎn)工業(yè)化學(xué)中間物和終產(chǎn)物的新辦法。另外，生物技術(shù)還提 供了一種利用廢物或低價(jià)值流如來自生物柴油生產(chǎn)的甘油，或在比現(xiàn)有化學(xué)工藝更有益于 環(huán)境的生物工藝中將基于石油化學(xué)品的給料如苯、甲苯和多環(huán)芳香烴（PAH)轉(zhuǎn)化成可用產(chǎn) 物的方式。
[0006] US2010/0203600和W02011/031147通過提述完整并入本文。本領(lǐng)域中需要對尼 龍-7、尼龍-7, X、尼龍-X, 7和聚酯的化學(xué)中間物和終產(chǎn)物尼龍-7、尼龍-7, X、尼龍-X, 7和 聚酯的經(jīng)濟(jì)的生物合成途徑，尤其是從多種可再生和不可再生給料進(jìn)行。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本公開至少部分基于用于生物合成二或三官能C7鏈烷（alkanes)的酶系統(tǒng)和 重組宿主的開發(fā)，所述二或三官能C7鏈烷是用于生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-X，7、尼龍-7, X和聚 酯的可用中間物（單體）。具體地，如本文中描述的，可用于生產(chǎn)尼龍-7和尼龍-7，x、尼 龍-X，7和聚酯的中間物可從可再生給料如植物源的糖和甘油，或從基于石油化學(xué)品的給 料如苯或環(huán)己烷羧酸酯生物合成產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，二官能或三官能C7鏈烷的產(chǎn)生 最終經(jīng)由一種常見的中間體庚二酸半醒（pimelic acid semialdehyde)(亦稱為7-氧庚酸 (7-oxoheptanoate))進(jìn)行，盡管有許多可使用的不同給料和許多產(chǎn)生庚二酸半醛的方式。 圖1是描繪了庚二酸半醛到各種雙官能C7鏈烷的生物轉(zhuǎn)化的示意圖。
[0009] 例如，庚二酸半醒可源自庚二酰-輔酶A(pimeloyl-coenzyme A, CoA)、庚二 酰-[?；d體蛋白（acp)](pimeloyl_[acyl carrier protein(acp)])、庚二酸（亦稱為庚 燒 1,7-二酸（heptane 1,7-dioate))、或 α-酮辛二酸酯（α-ketosuberate)。如本文中 描述的，庚二酰-CoA、庚二酰_[acp]和庚二酸半醛可源自許多來源，包括許多不同的天然 存在的代謝途徑，其形成庚二酰-CoA、庚二酰_[acp]或庚二酸半醛作為天然存在的代謝途 徑中的中間物。
[0010] 另外，庚二酰_CoA和庚二酸還可源自相應(yīng)的烯酸（enoate)2-庚烯-二元酸 (2-heptene-dioic acid)或其相應(yīng)的 CoA 酯 2_ 庚烯二兀基-CoA(2-heptenedioyl_CoA)。 在一些實(shí)施方案中，這些C72-烯酸源自D，L-二氨基庚二酸鹽（D，L-diaminopimelate)或 2_氧庚二酸（2-oxopimelate)。在一些實(shí)施方案中，雙官能C7鏈烷（例如7氨基庚酸）的 產(chǎn)生經(jīng)由α -酮辛二酸或α -氨基辛二酸（可源自D，L-二氨基庚二酸）進(jìn)行。在其他實(shí) 施方案中，α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸源自α-酮庚二酸。
[0011] 更具體地，本發(fā)明提供多種轉(zhuǎn)化化合物以產(chǎn)生可用于制造尼龍-7、尼龍-7, 7 和聚酯的中間物的方法。不需要實(shí)施任一種方法的所有可能步驟，且當(dāng)獲得期望 的化合物時(shí)，可終止任一種方法。如此，在產(chǎn)生例如庚二酸（pimelic acid)、7_氨 基-庚酸（7_amino_heptanoic acid)、庚內(nèi)醜胺（enantholactam)、1，7-二氨基庚燒 (1，7-diaminoheptane)、或 7_ 輕基-庚酸（7-hydroxy-heptanoic acid)后，可終止任一種 方法。
[0012] 轉(zhuǎn)化化合物的第一種方法可包括使選自2, 6二氨基庚二酸鹽 (2,6diaminopimelate，2,6DAP)和 α-氨基-庚二酸鹽（a-amino_pimelate，AAP)的化 合物與催化 2, 6DAP 到 6-氨基 _2_ 庚烯二酸（6-amin〇-2_heptenedioic acid, 6A2HA)的 還原性脫氨基化或AAP到2-庚烯二酸（2-heptene dioic acid，2HDA)的還原性脫氨基化 (reductive deamination)的酶接觸，從而產(chǎn)生 6A2HA 或 2HDA。
[0013] 所述化合物可以是2, 6DAP且所述第一種方法還可包括使6A2HA與催化6A2HA到 AAP的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生AAP。
[0014] 所述AAP可與催化AAP到2HDA的還原性脫氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA。
[0015] 所述2HDA可與催化2HDA到庚二酸（PA)的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0016] 所述PA可與催化PA到庚二酸半醛（PAS)的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0017] 所述 PAS 可與催化 PAS 到 7_ 氨基-庚酸（7_amin〇-heptanoic acid, 7AHA)的半 醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0018] 所述7AHA可與催化7AHA到庚內(nèi)酰胺（enantholactam, ENTL)的酰胺水解的酶接 觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0019] 轉(zhuǎn)化化合物的第二種方法可包括，在實(shí)施第一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA 后，使7AHA與催化7AHA到7-氨基-庚醛（7-amino-h印tanal，7AHT)的醛脫氫的酶接觸， 從而產(chǎn)生AHT。
[0020] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7_二氨基庚烷 (1，7-diaminoh印tane，1，7DAH)的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0021] 轉(zhuǎn)化化合物的第三種方法可包括，在實(shí)施第一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生2HDA 后，使所述2HDA與催化輔酶A (CoA)到2HDA轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2-庚烯二酸-CoA (2-h印tene diacid-CoA, 2HDA-CoA)的酶接觸，從而產(chǎn)生 2HDA-CoA。
[0022] 所述2HDA-CoA可與催化2HDA-CoA到庚二酰-CoA (PCoA)的烯酸還原的酶接觸，從 而產(chǎn)生PCoA。
[0023] 所述PcoA可與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0024] 所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0025] 所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0026] 所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0027] 轉(zhuǎn)化化合物的第四種方法可包括，在實(shí)施第三種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA 后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0028] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0029] 轉(zhuǎn)化化合物的第五種方法可包括，在實(shí)施第一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生AAP 后，使所述AAP與催化氨基基團(tuán)到AAP轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α-酮-庚二酸鹽（AKP)的酶接觸，從而 產(chǎn)生ΑΚΡ。
[0030] 所述ΑΚΡ可與催化ΑΚΡ到α -羥基-庚二酸鹽（ΑΗΡ)的酮還原的一種或多種酶接 觸，從而產(chǎn)生ΑΗΡ。
[0031] 所述ΑΗΡ可與催化CoA到ΑΗΡ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α -羥基-庚二酸鹽-CoA (AHP-CoA)的 酶接觸，從而產(chǎn)生AHP-CoA。
[0032] 所述AHP-CoA可與催化AHP-CoA到2HDA-CoA的脫水的酶接觸，從而產(chǎn)生 2HDA-CoA。
[0033] 所述2HDA-CoA可與催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PCoA。
[0034] 所述PcoA可與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0035] 所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0036] 所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0037] 所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0038] 轉(zhuǎn)化化合物的第六種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA 后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0039] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0040] 轉(zhuǎn)化化合物的第七種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生ΑΗΡ 后，使ΑΗΡ與催化ΑΗΡ到2HDA的脫水的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA。
[0041] 所述2HDA可與催化2HDA到庚二酸（ΡΑ)的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生ΡΑ。
[0042] 所述ΡΑ可與催化ΡΑ到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0043] 所述PAS可與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0044] 所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0045] 轉(zhuǎn)化化合物的第八種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA 后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0046] 所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0047] 轉(zhuǎn)化化合物的第九種方法可包括，在實(shí)施第七種方法的所有步驟直至產(chǎn)生2HDA 后，使2HDA與催化CoA到2HDA轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2HDA-CoA的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA-CoA。
[0048] 所述2HDA-CoA與催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PCoA。
[0049] 所述PcoA可與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0050] 所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0051 ] 所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0052] 所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0053] 轉(zhuǎn)化化合物的第十種方法可包括，在實(shí)施第九種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA 后，使7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0054] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0055] 轉(zhuǎn)化化合物的第i^一種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生AKP 后，使AKP與催化AKP到α-酮-辛二酸鹽（AKS)的α-酮酸鏈延伸的酶接觸，從而產(chǎn)生 AKS。
[0056] 所述AKS可與催化氨基基團(tuán)到AKS轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α -氨基辛二酸鹽（AAS)的酶接觸， 從而產(chǎn)生AAS。所述AAS可與催化AAS到7ΑΗΑ的α -氨基酸脫羧的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0057] 所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0058] 轉(zhuǎn)化化合物的第十二種方法可包括，在實(shí)施第十一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生 7ΑΗΑ后，使7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΤ。
[0059] 所述7ΑΗΤ可與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0060] 轉(zhuǎn)化化合物的第十三種方法可包括，在實(shí)施第十一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生 AKS后，使AKS與催化AKS到PAS的α -酮酸脫羧的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0061] 所述PAS可與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0062] 所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0063] 轉(zhuǎn)化化合物的第十四種方法可包括，在實(shí)施第十三種方法的所有步驟直至產(chǎn)生 7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0064] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0065] 轉(zhuǎn)化化合物的第十五種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生PCoA 后，使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0066] 所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0067] 所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0068] 轉(zhuǎn)化化合物的第十六種方法可包括，在實(shí)施第十五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生 7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0069] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0070] 轉(zhuǎn)化化合物的第十七種方法可包括，在實(shí)施第九種方法的所有步驟直至產(chǎn)生PCoA 后，使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0071] 所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0072] 所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0073] 轉(zhuǎn)化化合物的第十八種方法可包括，在實(shí)施第十七種方法的所有步驟直至產(chǎn)生 7AHA后，使所述7AHT與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0074] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0075] 轉(zhuǎn)化化合物的第十九種方法可包括使選自6A2HA和2HDA的化合物與催化6A2HA 到AAP的烯酸還原或2HDA到PA的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生AAP或PA。應(yīng)當(dāng)理解，在產(chǎn) 生AAP或PA后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生AAP或PA之后的任意步 驟。
[0076] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十種方法可包括使選自PCoA和庚二酰[acp] (PACP)的化合物 與催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0077] 所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0078] 所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0079] 所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0080] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十一種方法可包括，在實(shí)施第二十種方法的所有步驟直至產(chǎn)生 7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0081] 所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生 1，7DAH。
[0082] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十二種方法可包括，使AKP與催化AKP到ΑΗΡ的酮還原的一種 或多種酶接觸，從而產(chǎn)生ΑΗΡ。ΑΚΡ可通過α-酮己二酸或α-酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn)生。然 后，ΑΗΡ可轉(zhuǎn)化成ΡΑ或PcoA。理解在產(chǎn)生ΡΑ或PCoA后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方 法中描述的產(chǎn)生PA或PCoA之后的任意步驟。
[0083] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十三種方法可包括通過α -酮酸鏈延伸將AKP轉(zhuǎn)化成AKS。AKP 可通過α-酮己二酸或α-酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn)生。理解在產(chǎn)生AKS后，可實(shí)施在上文第 一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生AKS之后的任意步驟。
[0084] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十四種方法可包括使PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的 酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。PAS可通過從2, 6DAP、AKG、PCoA、或PACP轉(zhuǎn)化獲得。理解在產(chǎn)生 AHA后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生AHA之后的任意步驟。
[0085] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十五種方法可包括使選自PCoA和PACP的化合物與催化該化合 物到PAS還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。理解在產(chǎn)生PAS后，可實(shí)施在上文第一至第十八種 方法中描述的產(chǎn)生PAS之后的任意步驟。此外，上文第一至第十八種方法和第二十二種方 法中描述的導(dǎo)致PcoA產(chǎn)生的任意步驟可在第二十五種方法之前實(shí)施。
[0086] 轉(zhuǎn)化化合物的第二十六種方法可包括使PAS與催化PAS到7-羥基-庚酸（7HHA) 的醇脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7HHA。理解上文第一至第十八種方法和第二十、二十二、 二十三和二十五種方法中描述的導(dǎo)致PAS產(chǎn)生的任意步驟可在第二十六種方法之前實(shí)施。 [0087] 在所述任一種方法中，所述酶可以純化形式使用?；蛘?，所述酶可以細(xì)胞裂解物或 部分純化的細(xì)胞裂解物的形式使用。另外，所述酶可在重組表達(dá)其的細(xì)胞中。
[0088] 在所述方法中，催化還原性脫氨基化的酶可包括氨裂合酶。所述氨裂合酶可以是 EC 4. 3. 1 中的，例如 EC 4. 3. 1. 1 ;EC 4. 3. 1. 2 ;EC 4. 3. 1. 3 ;EC 4. 3. 1. 9 ;EC 4. 3. 1. 12 ;EC 4. 3. 1. 13 ;EC 4. 3. 1. 14、EC 4. 3. 1. 23 或 EC 4. 3. 1. 24。
[0089] 在所述方法中，催化2-烯酸還原的酶可包括烯酸還原酶。所述烯酸還原酶 可以是 EC L 3. 1 中的，例如 EC L 3. L 8 ;EC L 3. L 9 ;EC L 3. L 10,如 FabI 的基因 產(chǎn)物；EC 1. 3. 1. 31 ;EC 1. 3. 1. 38 ;EC 1. 3. 1. 39 ;EC 1. 3. 1. 44 如 ter 或 tdter 的基 因產(chǎn)物（Nishimaki 等，J.Biochem·，1984, 95, 1315 - 1321 ;Shen 等，ΑρρΙ. Environ. Microbiol.，2011，77(9)，2905-2915 ;Bond-Watts 等，Biochemistry, 2012, 51，6827-683 7);或EC 1.3. 1.62中的庚二酰-CoA脫氫酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK。所述烯酸還 原酶還可以在 EC 1.3 中，如 EC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10*Syntrophus 3(^(1;[1：1'(^11；[(3118 2,3-二脫氫庚二酰-(：04還原酶及其同源物。所述烯酸還原酶可以作用 于反式-2_烯酰-二羧酸，或二羧酸的硫酯如2-庚烯二元酸-CoA (反式-2, 3-二脫氫庚二 酰-CoA)或2-庚烯二元酸-[acp](反式-2, 3-二脫氫庚二酰_[acp])。
[0090] 在所述方法中，催化羧酸還原的酶可包括羧酸還原酶。所述羧酸還原酶可以是EC 1. 2. 99中的，例如EC 1. 2. 99. 6。所述羧酸還原酶還可以屬于NAD依賴性非?；┟摎涿?， 如鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas)或貪銅菌屬（Cupriavidus)物種中的ThnG。
[0091] 在所述方法中，催化半醛氨基化的酶可包括ω轉(zhuǎn)氨酶。所述ω-轉(zhuǎn)氨酶可以是EC 2. 6. 1 中的，例如 EC 2. 6. 1. 18 ;EC 2. 6. 1. 19 ;EC 2. 6. 1. 11EC 2. 6. 1. 13 ;EC 2. 6. 1. 39 ;EC 2. 6. 1. 48 ;或 EC 2. 6. 1. 62。
[0092] 在所述方法中，催化CoA硫酯的硫酯水解的酶可包括硫酯酶、酸-硫醇連接酶或 CoA轉(zhuǎn)移酶。所述硫酯酶可以是EC 3. 1.2中的，例如如YciA、tesB或Acotl3的基因產(chǎn)物； EC 3. 1. 2. 2 ;EC 3. 1. 2. 18 ;EC 3. 1. 2. 19 ;或 EC 3. 1. 2. 20。所述酸-硫醇連接酶/CoA 合成 酶可以是 EC 6. 2. 1 中的，例如 EC 6. 2. L 3 ;EC6. 2. L 5、EC 6. 2. L 14 ;或 EC 6. 2. L 23。所 述 CoA 轉(zhuǎn)移酶可以是 EC 2. 8.3 中的，例如 EC 2. 8. 3.12 ;EC 2. 8. 3.13 或 EC 2. 8. 3. 14,或 催化CoA到庚二酸的可逆轉(zhuǎn)移的ThnH的基因產(chǎn)物。
[0093] 在所述方法中，催化?；?載體-蛋白（[ACP])硫酯的硫酯水解的酶可以包括來 自EC 3. L 2,例如EC 3. L 2. 14或EC 3. L 2. 21的酰基-[ACP]硫酯酶，來自EC6. 2. 1，例如 EC 6·2· 1. 14 的?；?[ACP]-合成酶（synthtase)，如 BioW;和 EC6.2. 1.20。
[0094] 在所述方法中，催化α-氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶可包括氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶。所述氨基 酸氨基轉(zhuǎn)移酶可以是EC 2. 6. 1，例如EC 2. 6. 1. 39 ;EC 2. 6. 1. 42或EC2. 6. 1. 21中的L-或 D-選擇性氨基轉(zhuǎn)移酶，或來自EC 2. 6. 1. 67的2-氨基己酸氨基轉(zhuǎn)移酶。催化α -氨基基團(tuán) 轉(zhuǎn)移的酶還可以是來自EC 1. 4. 1.-類的脫氫酶，如谷氨酸脫氫酶，其根據(jù)使用的輔因子屬 于 EC 1. 4. 1. 2 ;EC 1. 4. 1. 3 ;或 EC1. 4. 1. 4,或來自 EC 1. 4. 1. 16 的二氨基庚二酸脫氫酶。
[0095] 在所述方法中，催化酮還原的酶可以是EC 1. 1. 1.-或1. 1.99中的羰基還原酶。 所述羰基還原酶可包括 EC 1. 1. 1. 184 ;EC 1. 1. 1. 79 ;EC 1. 1. 1. B3 ;EC1. 1. 1. B4 或來自 EC 1. 1. 99. 2.或EC 1. 1. 99. 6的2-羥基戊二酰脫氫酶/alpha酮戊二酸還原酶。
[0096] 在所述方法中，催化α-酮酸脫羧的酶可以是EC 4. 1. 1，例如4. 1. 1. 1 ;4. 1. 1.7 ; 4. 1. 1.72中的α-酮酸脫羧酶，或EC 2. 2. 1.6或EC 2. 2. 2. 6類中的乙酰乳酸合酶。
[0097] 在所述方法中，催化α-氨基酸脫羧的酶可以使來自EC 4. 1. 1.-類的α-氨基 酸脫羧酶。所述α -氨基酸脫羧酶可報(bào)考EC 4. 1. 1. 11 ;EC 4. 1. 1. 15 ;EC 4. 1. 1. 16 ;EC 4· 1· 1· 18 ;EC 4· 1· 1· 20、EC 4· 1· 1· 45 ;和 EC 4· 1· 1· 86。
[0098] 在所述方法中，催化二羧酸的CoA酯到相應(yīng)半醛的還原（例如，PcoA到PAS)的酶 可以是脂肪 -醜基-CoA還原酶。所述脂肪-醜基-CoA還原酶可以是EC 1.2. 1.-，例如EC 1. 2. 1. 3 ;EC 1. 2. 1. 10 ;EC 1. 2. 1. 22 ;EC 1. 2. 1. 50 ;EC 1. 2. 1. 57 和 EC 1. 2. 1. 76 中的。
[0099] 在所述方法中，催化[ACP]硫酯的CoA酯到相應(yīng)半醛的還原（例如，PACP到PAS) 的酶可以是作用于上文描述的CoA酯和[ACP]酯的脂肪-?；?CoA還原酶，或來自例如EC 1. 2. 1. 80的?；?酰基-載體蛋白還原酶。
[0100] 在所述方法中，催化醛脫氫到羧酸的酶可以是醛脫氫酶或醛氧化酶。所述醛脫氫 酶可以是EC 1.2. 1中的，例如EC 1.2. 1.3 ;EC 1.2. 1.4或EC 1.2. 1.63。所述醛脫氫酶/ 羧酸還原酶還可以是EC 1.2. 99,例如EC 1.2. 99. 6中的。所述羧酸還原酶還可以屬于NAD 依賴性非?；┟摎涿福缜拾贝紗伟鷮俸拓濄~菌屬物種中的ThnG。所述醛氧化酶可以 是EC L 2. 3,例如L 2. 3. 1中的。
[0101] 在所述方法中，催化7-氨基庚酸到庚內(nèi)酰胺（enantholactam)的環(huán)閉合的酶可以 是EC 3. 5. 2,例如3. 5. 2. 11的酰胺水解酶。
[0102] 在所述方法中，催化脫水（例如，ΑΗΡ或AHP-CoA)的酶可以是水裂合酶 (hydro-lyase)。所述水裂合酶可以是 EC 4. 2.1 中的，例如 EC 4. 2.1.2 ;EC4. 2. 1.59; 4. 2. 1. 61 ;4. 2. 1. 17或4. 2. 1. 18。脫水酶還可以是梭菌（Clostridia)和梭桿菌 (fusobacteria)中描述的與其激活劑（HgdCAB) -起表達(dá)的2-輕基戊二酰-CoA脫水酶，尚 未對其分配EC號，或厭氧性細(xì)菌的2-羥基?；鵆oA脫水酶。
[0103] 在所述方法中，催化α-酮酸鏈延伸的酶可包括包含以下的酶組中的一種或多 種：AksA、AksD、AksE 和 AksF。所述 AksA 可以是 EC 2. 3. 3 中的，例如 EC 2. 3. 3. 13 或 2. 3. 3. 14。所述AksD可以是EC 4. 2. 1 中的，例如EC 4. 2. 1. 36。所述AksF可以是EC 1. 1. 1 中的，例如EC 1.1. 1.87。1種或多種（例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5 種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、12 種或更多種、14種或更多種、18種或更多種、或20種或更多種）α -酮酸鏈延伸酶可來自產(chǎn) 甲烷菌細(xì)菌。
[0104] 在所述方法中，催化醇脫氫的酶可包括醇脫氫酶。所述醇脫氫酶可包括 EC. 1. 1. 1. 1或EC 1. 1. 1. 2或1. 1. 1. 21。它還可以是例如，來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)的丁醇脫氧酶、酵母屬ADHIV、和來自釀酒酵母（S.cerevisiae)的ADH6。 在所述方法中，催化醇脫氫的酶可以是醇氧化酶。所述醇氧化酶可以是在EC 1.1.3. 13類 中。
[0105] 用在本文方法中的PCoA或PACP可源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA，或任何代謝途徑 如生物素生物合成、苯甲酸降解、環(huán)己烷羧酸酯途徑、或丙二酰-CoA的縮合或脂肪酸ω-氧 化。乙酰-CoA可源自可再生給料，其包括纖維素給料、糖、甘油或脂肪酸。此外，乙酰-CoA 可源自合成氣、甲烷或甲醇。苯甲酰-CoA可源自多環(huán)芳香烴。除了源自PCoA或PACP或PA 夕卜，PAS還可源自萘滿降解途徑。
[0106] 用在本文方法中的2, 6DAP可由缺乏二氨基庚二酸脫羧酶的產(chǎn)賴氨酸生物體產(chǎn) 生。2, 6DAP源自任何可發(fā)酵碳源，包括糖、甘油、脂肪酸、合成氣、甲烷或甲醇。
[0107] 本文特征為生物衍生的尼龍_7、尼龍-7, X、尼龍-X，7和聚酯。它還包括通過包括 聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍-7,其中所述7AHA源自PAS或AAS。本文還提供通過包括聚 合PA和1，7DHA的工藝產(chǎn)生的尼龍-7, 7,其中所述PA源自PCoA ;PACP ;或2HDA而1，7DHA 源自7AHA。本文還包括通過包括聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍-7,其中7AHA由上述任一種 導(dǎo)致7AHA產(chǎn)生的方法制備。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過包括聚合1，7DHA和PA的工藝產(chǎn) 生的尼龍7, 7,其中1，7DHA由上述任一種導(dǎo)致1，7DHA產(chǎn)生的方法制備，而PA由上述任一種 導(dǎo)致PA產(chǎn)生的方法制備。
[0108] 本文還提供一種基本純的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，大量所述宿主細(xì)胞包含并表達(dá)一種或 多種編碼涉及生物合成選自以下的一種或多種聚合物單體的一種或多種酶的外源核酸： 7AHA ;PA ;1，7DAH ;ENTL ;和7HHA。這些酶包括脂肪-?；?CoA還原酶、酰基_[acp]還 原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、酸-硫醇連接 酶、水裂合酶、羰基還原酶、羧酸還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、α-酮酸脫羧酶、醛脫氫酶、脫氨基脫 氫酶、醇脫氫酶、醛氧化酶、醇氧化酶、酰胺水解酶、脫羧乙酰乳酸合酶（fatty-acyl-CoA reductases, acyl-[acp]reductases, thioester hydrolases, ammonia lyases, enoate reductases,amino acid aminotransferases,CoA transferases,, acid-thiol ligases, hydro-lyases,carbonyl reductases,carboxylic acid reductases，ω-tra nsaminases，a -keto acid decarboxylases, aldehyde dehydrogenases, deaminating dehydrogenases, alcohol dehydrogenases, aldehyde oxidases, alcohol oxidases, ami dohydrolases，decarboxylating acetolactate synthases)和催化 a-酮酸鏈延伸的酶 如AksA、AksD、AksE和AksF。如本文中使用的，"大量"為培養(yǎng)物中至少10% (例如至少： 20% ;30% ;40% ;50% ;60% ;70% ;75% ;80% ;85% ;90% ;95% ;97% ;98% ;99% ;或甚 至100% )的細(xì)胞。
[0109] 所述培養(yǎng)物的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如且無限制地，埃希氏菌屬（Escherichia) 如物種大腸桿菌（Escherichia coli);梭菌屬（Clostridia)如物種楊氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)、自產(chǎn)乙酉享梭菌（Clostridium autoethanogenum)或克氏 梭菌（Clostridium kluyveri);棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如物種谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum);貪銅菌屬如物種鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator)或 耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metallidurans);假單胞菌屬（Pseudomonas)如物種焚光假 單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)或食油假單胞 菌（Pseudomonas oleavorans);代爾夫特菌屬（Delftia)如物種食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans);芽抱桿菌屬（Bacillus)如物種枯草芽抱桿菌（Bacillus subtillis);乳 桿菌屬（Lactobacillus)如物種德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii);和乳球菌屬 (Lactococcus)如物種乳酸乳球菌（Lactococcus lactis) ?
[oho] 或者，所述培養(yǎng)物的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞 可以是酵母或真菌的，如且無限制地，曲霉屬（Aspergillus)如物種黑曲霉（Aspergillus niger);酵母屬（Saccharomyces)如物種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);假絲 酵母屬（Candida)如物種熱帶假絲酵母（C.tropicalis)、白色假絲酵母（C. albicans)、 C. cloacae、C. guillermondii、中型假絲酵母（C. intermedia)、麥芽糖假絲酵母 (C. maltosa)、近平滑假絲酵母（C. parapsilosis)或C. zeylenoides ;畢赤酵母屬（Pichia) 如物種巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris);耶氏酵母屬（Yarrowia)如物種解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica);伊薩酵母屬（Issatchenka)如物種 Issathenkia orientalis ; 德巴利酵母屬（Debaryomyces)如物種漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii); Arxula屬如物種Arxula adenoinivorans;克魯維酵母屬（Kluyveromyces)如物種乳酸 克魯維酵母（Kluyveromyces lactis);外瓶霉屬（Exophiala);毛霉屬（Mucor);木霉屬 (Trichoderma);枝抱屬（Cladosporium);平革菌屬（Phanerochaete) ;Cladophialophora 屬；擬青霉屬（Paecilomyces) ;Scedosporium 屬和 Ophiostoma 屬。
[0111] 可由所述細(xì)胞表達(dá)的外源酶如下。所述氨裂合酶可包括EC 4.3. 1中的氨裂合 酶，例如 EC 4. 3. 1. 1 ;EC 4. 3. 1. 2 ;EC 4. 3. 1. 3 ;EC 4. 3. 1. 9 ;EC 4. 3. 1. 12 ;EC 4. 3. 1. 13 ; EC 4. 3. 1.14、EC 4. 3. 1.23 或 EC 4. 3. 1.24。所述烯酸還原酶可包括 EC 1.3. 1，例如 EC 1.3.1. 8 ;EC 1.3.1. 9 ;EC 1.3.1. 10、EC 1.3.1. 31 ;EC 1.3.1. 38 ;EC 1.3.1. 39 ;EC 1. 3. 1. 44中的烯酸還原酶，或EC 1. 3. 1. 62中的庚二酰-CoA脫氫酶如PimC/PimD或ThnJ/ ThnK。所述烯酸還原酶還可以是在 EC 1.3,如 EC1. 3. 8.1 或 EC 1.3. 99.3 ;EC 1·3· 99. B10 中，或 Syntrophus aciditrophicus 2,3-二脫氫口;[1116171-(>^還原酶及其同源物。所述 羧酸還原酶包括EC 1.2. 99中的羧酸還原酶，例如EC 1.2. 99. 6。所述羧酸還原酶還可 以屬于NAD依賴性非酰化醛脫氫酶，如鞘氨醇單胞菌屬或貪銅菌屬物種中的ThnG。所述 ω-轉(zhuǎn)氨酶可包括 EC 2. 6. 1 中的轉(zhuǎn)氨酶，例如 EC 2. 6. 1. 18;EC 2. 6. 1. 19;2. 6. 1. 11;EC 2. 6. 1. 13 ;EC 2. 6. 1. 39 ;EC 2. 6. 1. 48 或 EC 2. 6. 1. 62。所述硫酯酶可包括 EC 3. 1. 2 中的 硫酯酶，例如如 YciA、tesB 或 Acotl3 的基因產(chǎn)物；EC 3. 1. 2. 2 ;EC 3. 1. 2. 18 ;EC3. 1. 2. 19 ; 或EC 3. 1. 2. 20。作用于?；?[acp]硫酯的硫酯酶包括EC 3. 1. 2. 14,如FatA、FatB ;和EC 3. 1.2. 21。所述酸-硫醇連接酶或CoA synthtase可包括EC6. 2. 1中的酸-硫醇連接酶， 例如 EC 6. 2. 1. 3 ;EC 6. 2. 1. 5 ;EC 6. 2. 1. 14 ;或 EC6. 2. 1. 23。所述 CoA 轉(zhuǎn)移酶可包括 EC 2. 8. 3 中的 CoA 轉(zhuǎn)移酶，例如 EC 2. 8. 3. 12 ;EC 2. 8. 3. 13 或 EC 2. 8. 3. 14,或催化 CoA 到庚 二酸的可逆轉(zhuǎn)移的ThnH的基因產(chǎn)物。
[0112] 所述?；?[acp]-硫酯酶包括EC 3. 1.2,例如3. 1.2. 14和EC 3. 1.2. 21中的硫 酯酶。所述?；?[acp]合成酶可包括EC 6. 2. 1中的酸-硫醇連接酶，例如EC6. 2. 1. 14中 的，如BioW ;和EC 6. 2. 1. 20中的。所述氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶可包括EC 2. 6. 1中的氨基轉(zhuǎn)移 酶，例如 EC 2. 6. 1. 39 ;EC 2. 6. 1. 21 ;EC 2. 6. 1. 42 ;和 EC2. 6. 1. 67。所述脫氨基脫氫酶可 包括來自 EC 1. 4. 1 的脫氫酶，例如 1. 4. 1. 2 ;EC1. 4. 1. 3 ;EC 1. 4. 1. 4 ;和 EC 1. 4. 1. 16。所 述羰基還原酶可包括 EC. 1. 1. 1. 184EC1. 1. 1. 79、EC 1. 1. 1. B3 ;EC 1. 1. 1. B4 中的還原酶， 或來自EC 1. 1. 99. 2.或EC1. 1. 99. 6的2-羥基戊二酰脫氫酶/alpha酮戊二酸還原酶。
[0113] 所述α-酮酸脫羧酶可包括EC 4. 1. 1，例如4. 1. 1. 1 ;4. 1. 1.7 ;4. 1. 1.72中的 α-酮酸脫羧酶；或EC 2.2. 1.6類中的乙酰乳酸合酶。所述α-氨基酸脫羧酶可包括EC 4. 1. 1. 11 ;EC 4. 1. 1. 15 ;EC 4. 1. 1. 16 ;EC 4. 1. 1. 18 ;EC 4. 1. 1. 20、EC 4. 1. 1. 45 ;和 EC 4. 1. 1. 86
[0114] 所述脂肪-?；?CoA還原酶可包括EC 1.2. 1中的脂肪-?；?CoA還原酶， 例如 EC 1.2. 1.3 ;EC 1.2. 1.10 ;EC 1.2. 1.22 ;EC 1.2. 1.50;和 EC 1.2.1.76。所述酰 基-[acp]-還原酶可包括來自例如EC 1.2. 1.80的?；?酰基-載體蛋白還原酶。
[0115] 所述醛脫氫酶可包括EC 1.2. 1中的醛脫氫酶，例如EC 1.2. 1.3 ;EC 1.2. 1.4或 EC 1.2. 1.63。所述醛脫氫酶/羧酸還原酶還可以是在EC 1.2. 99,例如EC1. 2. 99. 6中的。 所述羧酸還原酶還可以屬于NAD依賴性非?；┟摎涿福缜拾贝紗伟鷮倩蜇濄~菌屬物 種中的ThnG。所述醛脫氫酶/羧酸還原酶還可以屬于NAD依賴性非酰化醛脫氫酶，如鞘氨 醇單胞菌屬或貪銅菌屬物種中的ThnG。所述醛氧化酶可以是EC 1. 2. 3,例如1. 2. 3. 1中的。 所述酰胺水解酶可以是來自EC 3. 5. 2例如3. 5. 2. 11的酰胺水解酶。
[0116] 所述水裂合酶包括EC 4.2. 1中的水裂合酶，例如EC 4. 2. 1.2 ;EC 4. 2. 1.59 ; 4. 2. 1.61 ;4. 1.2. 17或4. 1.2. 18。脫水酶還可以是梭菌和梭桿菌中描述的與其激活劑 (HgdCAB) -起表達(dá)的2-羥基戊二酰-CoA脫水酶，尚未對其分配EC號，或厭氧性細(xì)菌的 2_羥基?；鵆oA脫水酶。
[0117] 所述催化α -酮酸鏈延伸的酶可包括包含AksA、AksD、AksE和AksF酶的組中的一 種或多種酶。所述AksA可包括EC 2. 3. 3中的AksA酶，例如EC2. 3. 3. 13或2. 3. 3. 14。所 述AksD可包括EC 4. 2. 1中的AksD酶，例如EC 4. 2. 1.36。所述AksF可包括EC 1. 1. 1中 的AksF酶，例如EC 1. 1. 1.87。所述醇脫氫酶可包括，例如EC. 1. 1. 1. 1或EC 1. 1. 1.2或EC 1. 1. 1.21。另外，所述醇脫氫酶可包括例如，來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單 胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌的丁醇脫氫酶、酵母屬ADHIV和來自釀酒酵母的ADH6。所 述醇氧化酶還可以是EC 1.1.3. 13類中的。
[0118] 本文的另一個(gè)方面是分離的宿主細(xì)胞，其包含并表達(dá)一種或多種編碼涉及選自 7AHA ;PA ;1，7DAH ;ENTL ;和7HHA的一種或多種聚合物單體的生物合成的一種或多種酶的 外源核酸。所述酶包括氨裂合酶、烯酸還原酶、羧酸還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、硫酯酶、酸-硫醇連 接酶或CoA合成酶（synthtase)、CoA轉(zhuǎn)移酶、?；鵢[acp]硫酯酶、酰基_[acp]合成酶、氨 基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、脫氨基脫氫酶、羰基還原酶、α-酮酸脫羧酶、乙酰乳酸合酶、α-氨基酸 脫羧酶、脂肪-酰基-CoA還原酶、?；?[acp]_還原酶、醛脫氫酶、醛氧化酶、酰胺水解酶、 水裂合酶、和催化α-酮酸鏈延伸的酶。。所述細(xì)胞和酶可以是上文對基本純的宿主細(xì)胞培 養(yǎng)物所描述的那些中的任一種。
[0119] 從本文中列出的下文詳細(xì)說明考慮，其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明 顯的。
[0120] 附圖簡述
[0121] 圖1是顯示庚二酸半醛到可用于尼龍7、尼龍7, 7和尼龍7, X生產(chǎn)以及聚酯的各種 雙官能C7鏈烷的生物轉(zhuǎn)化的示意圖。
[0122] 圖2是從庚二酰-CoA、庚二酰_[acp]或α -酮辛二酸（均為如指示的天然存在途 徑中的且來自萘滿降解的中間物）形成庚二酸半醛的示意圖。
[0123] 圖3是α-酮酸鏈延伸中的系列反應(yīng)的示意圖。鏈延伸牽涉3種基本反應(yīng)：α-酮 二酸與乙酰-CoA之間縮合以形成檸檬酸同源物，檸檬酸同源物異構(gòu)化為異檸檬酸同系物， 和異朽 1檬酸同系物氧化脫羧為ct-酮二酸，其含有另外的亞甲基基團(tuán)[Howell98:Howell DM, Harich K, Xu Η,White RH (1998). Alpha-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate) in methanogenic Archaea.''Biochemistry, 37 (28) ; 10108-17]。 從 ct _ 酮 戊二酸到α-酮辛二酸的連續(xù)輪的鏈延伸之后是α-酮酸脫羧為庚二酸半醛。這些反應(yīng) 類似于在TCA循環(huán)I (原核）循環(huán)中由朽1檬酸合酶、順烏頭酸酶（aconitase)和異朽1檬 酸脫氫酶催化的反應(yīng)，以及在賴氨酸生物合成V中由（R)-高檸檬酸合酶、高順烏頭酸酶 〇1011103〇011；^386)和（-)-蘇型-異高朽 1檬酸脫氫酶催化的反應(yīng)[!10￥611，1998，見上]。
[0124] 圖4是經(jīng)由3個(gè)丙二酰-CoA的縮合形成庚二酰-CoA的示意圖。
[0125] 圖5是庚二酸形成的示意圖，其通過由來自枯草芽孢桿菌的Biol對長鏈脂肪酸 的[acp]硫酯的氧化性切割。庚二酸或其CoA或[acp]硫酯是生物素生物合成途徑II中 7-酮-8-氨基壬酸酯生物合成中的前體。7-酮-8-氨基壬酸酯是生物素生物合成的關(guān) 鍵中間物。庚二酰-CoA在宿主生物中的降解可由BioF的缺失或失活阻止，該基因編碼 7_酮-8-氨基壬酸合成酶（E. C. 2. 3. 1. 47)。
[0126] 圖6是生物素生物合成途徑I中7-酮-8-氨基壬酸生物合成中庚二酰_[acp]或 其甲基酯形成的示意圖。生物素生物合成中的關(guān)鍵中間物。庚二酸或庚二酸半醛可從這些 前體制備，其通過aaaS (酰基ACP合成酶）、FatA (脂肪酰基ACP硫酯酶A)、FatB (脂肪?；?ACP硫酯酶B)或酰基_[acp]還原酶的作用，如粗體顯示的。
[0127] 圖7是顯示從苯甲酸形成庚二酰-CoA或環(huán)己烷羧酸降解的示意圖。
[0128] 圖8是顯示鞘氨醇單胞菌和棒狀桿菌物種中萘滿降解途徑中庚二選半醛形成的 示意圖。
[0129] 圖9是顯示通過產(chǎn)甲烷菌在環(huán)己烷羧酸途徑中從巴豆酸酯形成庚二酰-CoA的示 意圖。參見 Mouttaki 等，Applied and Environmental Microbiology, 930-938 頁（2001)。
[0130] 圖10A是顯示從作為起點(diǎn)的D，L-二氨基庚二酸經(jīng)由2-氨基庚二酸到庚二酸半醛 和7-氨基庚酸的工程化途徑例子的示意圖。從2-氨基庚二酸到庚二酸半醛有兩條路徑， 經(jīng)由通過氨裂合酶的還原性脫氨基化到2-庚烯二酸，或經(jīng)由α -酮酸的形成，其可隨后轉(zhuǎn) 化成庚二酸或其CoA酯?；蛘?，源自2-氨基庚二酸的α-酮-庚二酸可進(jìn)行一輪鏈延伸為 α-酮-辛二酸，其可脫羧以形成庚二酸半醛或轉(zhuǎn)化成α-氨基辛二酸，α-氨基辛二酸在 脫羧時(shí)直接產(chǎn)生7-氨基庚酸。α-酮-庚二酸還可源自α-酮-己二酸，其相應(yīng)地可源自 α-酮-戊二酸，經(jīng)由兩輪連續(xù)的α-酮酸鏈延伸。
[0131] 圖10Β是顯示α -羥基庚二酸或其CoA酯通過水裂合酶分別到2-庚烯二酸或其 相應(yīng)CoA酯α -羥基庚二酰-CoA的轉(zhuǎn)化的示意圖。類似地，2-庚烯二酸或其相應(yīng)CoA酯 可通過烯酸還原酶分別被還原為庚二酸或庚二酰-CoA，該烯酸還原酶作用于游離酸或CoA 活化的硫酯。以類似的方式，α-羥基庚二酸或2-庚烯二酸的活化可能不是對CoA硫酯， 而是通過?；?[acp]_合成酶對[acp]硫酯。所述水裂合酶可以催化水從α-羥基庚二 酰-[acp]的消除，而烯酸還原酶可以還原2-庚烯二酸-[acp]的雙鍵。庚二酰-CoA或庚 二酰-[acp]可隨后被轉(zhuǎn)移酶或酸-硫醇連接酶水解，以用于CoA或[acp]的循環(huán)，或通過 硫酯酶以產(chǎn)生庚二酸。
[0132] 圖11A顯示對來自無丙二酸朽1檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus)氨裂合酶 蛋白表達(dá)的可溶和不可溶級分的SDS-PAGE分析。
[0133] 圖11B顯不對來自假破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetanomorphum) (15)和米曲霉 (Aspergillus oryzae) (16)氨裂合酶蛋白表達(dá)的可溶和不可溶級分的SDS-PAGE分析。
[0134] 圖12顯示對來自諾卡氏菌屬物種羧酸還原酶基因表達(dá)的可溶和不可溶級分的 SDS-PAGE 分析。
[0135] 圖13顯示由于通過諾卡氏菌CAR還原酶活性庚二酸、己二酸和苯甲酸到庚二酸半 醛、己二酸半醛和苯醛的還原在吸光度中隨時(shí)間的變化。苯甲酸被用作陽性對照，而具有攜 帶空載體的生物催化劑的反應(yīng)混合物為陰性對照。
[0136] 圖14顯示對來自流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)YciA硫酯酶蛋白（18) 表達(dá)的可溶和不可溶級分的SDS-PAGE分析。
[0137] 圖15顯示對氨基轉(zhuǎn)移酶IlvE-Omega Vf融合物（pING2022)和IlvE-Ad優(yōu)化的 omega融合物（pING2030)蛋白的SDS-PAGE分析。
[0138] 圖16顯示丙酮酸鈉和7-氨基庚酸生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果，連同7-氨基庚酸底物和L-丙 氨酸產(chǎn)物的測量濃度。
[0139] 圖17顯示在48和96小時(shí)后6種生物轉(zhuǎn)化中L-和D-2-氨基辛二酸對映異構(gòu)體 濃度的HPLC結(jié)果匯總。
[0140] 圖18顯不對來自大腸桿菌GadA(I29)、大腸桿菌LysA(I30)、大腸桿菌GadA ilvE(I31)和大腸桿菌LysA ilvE(I32)蛋白表達(dá)的珠裂解的可溶和不可溶級分的 SDS-PAGE 分析。
[0141] 圖19顯示來自2-氨基辛二酸脫羧的7-氨基庚酸的形成。
[0142] 圖20顯示使用ClustalW算法的蛋白質(zhì)比對，其顯示MJ0277與comD(SEQ ID 41)/ C〇mE(SEQ ID 42)蛋白之間的顯著同源性。
[0143] 圖21顯示MJ0277對來自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)的LACLA乙酰乳酸 合酶（SEQ ID 43)的同源性。
[0144] 圖 22 顯不對 LACLA 乙醜乳酸合酶、來自 Methanocella paludicola 的 comD/comE 和假定的乙酰乳酸合酶MJ0277中功能域的分析顯示其均具有含硫胺磷酸結(jié)合位點(diǎn)的類似 結(jié)構(gòu)。
[0145] 圖23繪出pING2022載體圖譜，其含有IlvE-Omega Vf融合基因。
[0146] 圖24繪出pING2030載體圖譜，其含有IlvE-Ad優(yōu)化的omega融合基因。
[0147] 圖 25 列出 SEQ. ID 1-40。
[0148] 圖 26 描繪 了通過 Thermococcus kodakaraensis (41/42)的酸硫醇連接酶 (EC6· 2· 1. 5)、Acidominococcus fermentans(43/44)的 CoA 轉(zhuǎn)移酶（EC 2· 8· 3· I2)和來自 門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina(45))的酸-硫醇連接酶（EC6. 2. 1. 14)從庚二 酰-CoA形成庚二酸的條形圖。
[0149] 圖27描繪了通過選定的烯酸還原酶從反式-2-己烯二酸（A)形成己二酸和從反 式_2, 3_二脫氧己二醜-CoA形成己二醜-CoA。
[0150] 發(fā)明詳述
[0151] 一般地，本公開涉及用于生物合成性產(chǎn)生雙官能或三官能C7鏈烷的方法和材料， 所述雙官能或三官能C7鏈烷可用作生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7, X和尼龍-X，7以及生產(chǎn)聚酯中的 中間物。
[0152] 在一些實(shí)施方案中，1種或多種（例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、 5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11 種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、 17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種）分離的酶（例如氨裂合 酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酯酶（thioestesterase)、酸-硫醇連接酶、 水裂合酶、羰基還原酶、硫酯酶、羧酸還原酶、脂肪-酰基CoA還原酶、ω -轉(zhuǎn)氨酶、α -酮酸 脫羧酶、催化α -酮酸鏈延伸的酶、酰基ACP合成酶、FatA(脂肪酰基ACP硫酯酶A)、FatB(脂 肪?；鵄CP硫酯酶B)、或酰基_[acp]還原酶）可用于生物合成性產(chǎn)生所述雙官能或三官 能C7鏈烷。這類酶可自表達(dá)編碼所述酶的外源核酸的重組細(xì)胞或天然表達(dá)所述酶的非重 組細(xì)胞分離。
[0153] 在一些實(shí)施方案中，包含1種或多種（例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更 多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多 種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或 更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種；或甚至更多種） 編碼1種或多種（例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更 多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或 更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18 種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種；或甚至更多種）酶（例如一種或多種（如 上文）的氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酯酶（thioestesterase)、 酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、硫酯酶、羧酸還原酶、ThnG、脂肪-?；鵆oA還原 酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、α -酮酸脫羧酶、α -氨基酸脫羧酶、乙酰乳酸合酶、氨基水解酶、催化α -酮 酸鏈延伸的酶、?；鵢[acp]硫酯酶、?；?ACP合成酶、BioW、醇脫氫酶、醇氧化酶、醛脫氫 酶、醛氧化酶、FatA、FatB、或?；鵢[acp]還原酶）的外源核酸的重組宿主，或從這類重組 宿主或天然表達(dá)所述酶的非重組細(xì)胞制備的裂解物可用于生物合成性產(chǎn)生雙官能或三官 能C7鏈烷。重組宿主還可在一種或多種內(nèi)源性酶中具有缺陷以使代謝中間物轉(zhuǎn)向雙官能 或三官能C7鏈烷的產(chǎn)生。
[0154] 如本文中描述的，生物合成性產(chǎn)生的雙官能或三官能C7鏈烷可用于生產(chǎn)尼龍-7、 尼龍-7, X、或尼龍-X，7、以及聚酯。術(shù)語"尼龍-7"是通過單體7-氨基庚酸的聚合作用或 通過庚內(nèi)酰胺的開環(huán)縮合產(chǎn)生的聚酰胺。尼龍-7也稱為"聚庚酰胺（polyenanthamide)" 或"聚庚酰胺（polyheptanamide)"。
[0155] 術(shù)語"尼龍-X，7"指通過庚烷-1，7-二元酸（亦稱為庚二酸或庚二酸酯）與二胺 的聚合作用產(chǎn)生的聚酰胺家族。整數(shù)X指示庚烷-1，7-二元酸與之反應(yīng)的二胺中的碳原 子數(shù)。在一些實(shí)施方案中，整數(shù)X是大于3的整數(shù)，例如大于5、大于7、或大于9。例如，尼 龍-5, 7通過將庚烷-1，7-二元酸與1，5-戊二胺反應(yīng)產(chǎn)生。尼龍7, 7通過將庚烷-1，7-二 元酸與1，7二氨基庚烷反應(yīng)產(chǎn)生。
[0156] 術(shù)語"尼龍-7, X"指通過七亞甲基二胺與二羧酸的聚合反應(yīng)產(chǎn)生的聚酰胺家族。 整數(shù)X指示七亞甲基二胺與之反應(yīng)的二羧酸中的碳原子數(shù)。例如，尼龍-7, 5通過七亞甲基 二胺（亦稱為1，7-二氨基庚烷或1，7-庚二胺）與戊烷-1，5-二元酸的反應(yīng)產(chǎn)生。在一些 實(shí)施方案中，整數(shù)X是大于3的整數(shù)，例如大于5、大于7、或大于9。
[0157] 術(shù)語"聚酯"指在其主鏈中含有酯官能團(tuán)的聚合物種類。聚酯可以是同型聚合物， 例如通過己內(nèi)酯的開環(huán)縮合產(chǎn)生的聚己內(nèi)酯。共聚物聚酯通過多官能醇和酸的酯化縮合形 成。例如，己二酸和乙二醇用于產(chǎn)生聚乙烯己二酸。庚二酸在這類共聚物中可替換己二酸 使用。或者，7-輕基庚酸可用于產(chǎn)生聚庚醇內(nèi)酯（polyenantholactone)。
[0158] 現(xiàn)將以更多關(guān)于本文中描述的所述方案的細(xì)節(jié)來描述本發(fā)明的前述方面和其他 方面。應(yīng)領(lǐng)會(huì)本發(fā)明可以不同形式實(shí)施且不應(yīng)解釋為限制本文中列出的實(shí)施方案。更確切 地，這些實(shí)施方案的提供使得本公開為全面且完整的，并將向本領(lǐng)域技術(shù)人員告知本發(fā)明 的范圍。
[0159] L 1 定義
[0160] 本文發(fā)明描述中使用的術(shù)語學(xué)僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，且不意圖限制本 發(fā)明。如在本發(fā)明實(shí)施方案的描述和所附權(quán)利要求中使用的，除非上下文另外清楚地指示， 單數(shù)形式"一 / 一個(gè)/ 一種"和"該"還意圖包括復(fù)數(shù)形式。而且，如本文中使用的，"和/ 或"意指并涵蓋一種或多種所列關(guān)聯(lián)項(xiàng)的任意和所有可能組合。除非另外定義，描述中使用 的所有術(shù)語，包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員普遍理解的相同 的含義。
[0161] 如本文中使用的，術(shù)語"酶"指能夠催化反應(yīng)的蛋白質(zhì)催化劑。本文中該術(shù)語不僅 指分離的酶，而且還包括表達(dá)該酶的宿主細(xì)胞。因此，通過酶C的A到B的轉(zhuǎn)化還應(yīng)理解為 涵蓋通過表達(dá)酶C的宿主細(xì)胞的A到B的轉(zhuǎn)化。
[0162] 如本文中使用的，術(shù)語"雙官能C7鏈烷"指直鏈或支鏈、飽和或不飽和的具有7個(gè) 碳原子和兩個(gè)官能團(tuán)的烴。所述官能團(tuán)可置于沿?zé)N鏈的任何點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述官 能團(tuán)位于烴鏈的末端（例如在每個(gè)末端各一個(gè)官能團(tuán)）。該術(shù)語還意圖涵蓋環(huán)狀化合物如 庚內(nèi)酰胺。例示性雙官能C7鏈烷包括但不限于，庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]、庚烷-1，7-二 元酸（庚二酸或庚二酸鹽）、7_氨基庚酸、7-羥基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基 庚醇、7-氨基庚醛、庚內(nèi)酰胺、庚二酸半醛（亦稱為7-氧庚酸）、2_庚烯二酸和2-庚烯二 酸-CoA。
[0163] 如本文中使用的，術(shù)語酸酯（_oate)"和酸（_oic acid)"例如庚酸酯和庚 酸可交換使用。此外，應(yīng)理解"鹽/酯（_ate)"、"_酸酯（-oate)"和酸（_oic acid)"可 貫穿交換使用以指示處于其中性或離子化形式和所謂的"兩性離子"形式中任一種的化合 物。
[0164] 如本文中使用的，術(shù)語"三官能C7鏈烷"指直鏈或支鏈、飽和或不飽和的具有7個(gè) 碳原子和三個(gè)官能團(tuán)的烴。所述官能團(tuán)可置于沿?zé)N鏈的任何點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，3個(gè)官 能團(tuán)中有兩個(gè)位于烴的末端（例如在每個(gè)末端各一個(gè)官能團(tuán)）。例示性三官能C7鏈烷包括 但不限于，2-氧庚二酸鹽（α -酮庚二酸鹽）、2_氨基庚二酸鹽（α -氨基庚二酸鹽）、2_羥 基庚二酸鹽（α -羥基庚二酸鹽）和2-羥基庚二酸鹽-CoA ( α -羥基庚二酸鹽-CoA)。
[0165] 如本文中使用的，術(shù)語"官能團(tuán)"指胺基團(tuán)、羧酸基團(tuán)、醛基團(tuán)、醇基團(tuán)、輔酶A基團(tuán) 或酮基團(tuán)。術(shù)語"胺基團(tuán)"指-NH2基。術(shù)語"羧酸基團(tuán)"指-C00H基。術(shù)語"醛基團(tuán)"指-C(0) Η基。術(shù)語"醇基團(tuán)"指-0H基。術(shù)語"酮基團(tuán)"指C(0)基。
[0166] 術(shù)語"輔酶A基團(tuán)"指有機(jī)輔因子或輔基（酶的非蛋白部分），其存在是形成活性 酶系統(tǒng)的許多酶（脫輔基酶蛋白）的活性所需要的。輔酶A在特定濃縮酶中有功能，作用 于乙?；蚱渌；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移和脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和其他乙?；?br> [0167] 術(shù)語"acp"或"?；d體蛋白"指從乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A挑出乙酰和丙二 ?；鶊F(tuán)且通過縮合將其連接以形成β -酮酸?；d體蛋白，并釋放二氧化碳和該?；d體 蛋白的巰基形式的蛋白質(zhì)（其通常在脂肪酸合成中有活性）。
[0168] 雙官能或三官能C7鏈烷上的官能團(tuán)可以是相同或不同的：例如，在雙官能C7鏈烷 的一些實(shí)施方案中，兩個(gè)官能團(tuán)可以均為胺基團(tuán)，兩個(gè)官能團(tuán)可以均為羧酸基團(tuán)，或兩個(gè)官 能團(tuán)可以均為醇基團(tuán)。
[0169] 在一些實(shí)施方案中，雙官能C7鏈烷上的一個(gè)官能團(tuán)是胺基團(tuán)而另一個(gè)是羧酸基 團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，雙官能C7鏈烷上的一個(gè)官能團(tuán)是醇基團(tuán)而另一個(gè)是羧酸基團(tuán)。在 一些實(shí)施方案中，雙官能C7鏈烷上的一個(gè)官能團(tuán)是醇基團(tuán)而另一個(gè)是胺基團(tuán)。
[0170] 在三官能C7鏈烷的一些實(shí)施方案中，兩個(gè)官能團(tuán)是羧酸基團(tuán)而一個(gè)官能團(tuán)是酮 基團(tuán)或羥基基團(tuán)或氨基基團(tuán)。
[0171] 術(shù)語"異源"用于本文指并非源自與宿主細(xì)胞相同物種的細(xì)胞的任何核酸或多肽。 因此，如本文中使用的，"同源"核酸或蛋白質(zhì)是那些存在于與宿主細(xì)胞相同物種的細(xì)胞中 或由其產(chǎn)生的核酸或蛋白質(zhì)。
[0172] 如本文中關(guān)于核酸和具體宿主細(xì)胞使用的，術(shù)語"外源"指不像自然界中發(fā)現(xiàn)的存 在于具體細(xì)胞中（且不能從中獲得）的任何核酸。如此，非天然存在的核酸一旦導(dǎo)入宿主 細(xì)胞即視為對該宿主細(xì)胞外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中發(fā)現(xiàn) 的核酸序列的核酸子序列或片段，只要該核酸作為整體不存在于自然界中。例如，表達(dá)載體 內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞即視為對 該宿主細(xì)胞為外源的，因?yàn)樵摵怂岱肿幼鳛檎w（基因組DNA加載體DNA)不存在于自然界 中。如此，作為整體不存在于自然界中的任何載體、自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《荆ɡ缒孓D(zhuǎn)錄病 毒、腺病毒、或皰疹病毒）視為非天然存在的核酸。由此通過PCR或限制內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的 基因組DNA片段以及cDNA也視為非天然存在的核酸，因?yàn)樗鼈冏鳛槲匆娪谧匀唤绲姆珠_的 分子存在。亦由此任何以未見于自然界中的排布含有啟動(dòng)子序列和多肽編碼序列（例如 cDNA或基因組DNA)的核酸分子也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是對具體細(xì) 胞外源性的。例如，從酵母X的細(xì)胞分離的完整染色體一旦將該染色體導(dǎo)入酵母y的細(xì)胞 中時(shí)即為酵母y細(xì)胞的外源性核酸。
[0173] 從上文來看，"外源性"核酸可以是"同源"或"異源"核酸將是清楚的。相反，如本 文中關(guān)于核酸或基因（或由核酸或基因編碼的蛋白質(zhì)）和具體細(xì)胞使用的術(shù)語"內(nèi)源性"指 如在自然界中發(fā)現(xiàn)的確實(shí)存在于具體細(xì)胞中（且可從中獲得）的任何核酸或基因。
[0174] 如本文中使用的，術(shù)語"重組宿主"指其基因組已通過至少外源性核酸序列擴(kuò)大的 宿主。這類核酸序列包括但不限于，不天然存在于宿主中的核酸（即異源核酸）、不正常轉(zhuǎn) 錄成RNA或翻譯成蛋白質(zhì)（"表達(dá)"）的DNA序列、和期望導(dǎo)入非重組宿主中的其他核酸序 列（例如改變具體核酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)）。會(huì)領(lǐng)會(huì)本文中描述的重組宿主的基因組通常 經(jīng)由一種或多種外源核酸的穩(wěn)定導(dǎo)入得到擴(kuò)大。一般地，所述外源核酸原始不存在于作為 DNA受體的宿主中（即它是異源核酸），但從給定宿主分離核酸然后將該核酸的一個(gè)或多個(gè) 額外拷貝導(dǎo)入相同宿主中，例如以增強(qiáng)編碼產(chǎn)物的產(chǎn)生或改變核酸的表達(dá)模式，是在本發(fā) 明范圍內(nèi)的。在一些情況下，外源核酸將修改或甚至替換內(nèi)源基因或DNA序列，其通過例如 同源重組或定點(diǎn)誘變。內(nèi)源基因的修改或替換可導(dǎo)致特定編碼產(chǎn)物例如酶的缺陷。合適的 重組宿主記載于下文。重組宿主還可含有不包含在宿主細(xì)胞基因組中但附加存在（并復(fù) 制，優(yōu)選地）于細(xì)胞中的核酸。
[0175] 如本文中使用的，"啟動(dòng)子"指使得基因能轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動(dòng)子被RNA聚合酶 識別，然后該酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。如此，啟動(dòng)子含有由RNA聚合酶直接結(jié)合或涉及RNA聚合酶招募 的DNA序列。啟動(dòng)子序列還可包含"增強(qiáng)子區(qū)"，其為可由蛋白質(zhì)（即反式作用因子，很大程 度上像一組轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合以增強(qiáng)基因簇中基因轉(zhuǎn)錄水平（得名由來）的一個(gè)或多個(gè)DNA 區(qū)。通常在編碼區(qū)5'端的增強(qiáng)子也可與啟動(dòng)子序列分開，且可以例如位于基因的內(nèi)含子區(qū) 中或在基因編碼區(qū)的3'。
[0176] 如本文中使用的，"可操作連接"意指摻入遺傳構(gòu)建體中從而使得表達(dá)控制序列有 效控制感興趣編碼序列的表達(dá)。
[0177] 1.2 給料
[0178] 多種不同給料可用于產(chǎn)生二或三官能鏈烷。在一些實(shí)施方案中，使重組宿主細(xì)胞 或從細(xì)胞（例如重組宿主細(xì)胞）制備的裂解物與可再生給料接觸以產(chǎn)生雙官能或三官能C7 鏈烷如7-氨基庚酸?？捎米魈荚吹目稍偕o料的例子包括但不限于，纖維素給料、植物源 的糖類和脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞接觸的給料是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪 酸或甘油。
[0179] 除了可再生給料（如上文所列的）以外，可將重組宿主細(xì)胞修飾為在作為碳源的 合成氣（亦稱為SynGas)上生長。在這一具體的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞工 程化以提供用于利用合成氣或其他氣體碳源來產(chǎn)生雙官能或三官能C7鏈烷的有效代謝途 徑。
[0180] 另外，可以使本文中描述的重組宿主或從重組宿主細(xì)胞制備的裂解物與芳香烴給 料接觸。芳香烴給料代替可再生給料的使用提供了一種將這類石油源材料轉(zhuǎn)化成對環(huán)境更 有益的化合物的方式，從而降低環(huán)境影響。合適的芳香烴給料的例子包括但不限于，甲苯、 苯、苯酸和莽草酸（shikimate)。
[0181] 1.3.包括酶催化步驟的到雙官能C7鏈烷的路徑
[0182] 如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于在存在一種或多種分離的酶、存在表達(dá)該 酶/那些酶的重組宿主細(xì)胞、或存在表達(dá)該酶的細(xì)胞（例如重組細(xì)胞）的細(xì)胞裂解物（或部 分純化的裂解物）的情況下產(chǎn)生雙官能或三官能C7鏈烷的方法。在一些實(shí)施方案中，雙官 能或三官能C7鏈烷的產(chǎn)生開始于庚二酸鹽或庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]，且經(jīng)由通用中 間物即庚二酸半醛進(jìn)行。具體地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生雙官能C7鏈烷 7_氨基庚酸的方法，其通過使用催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶。見圖1。 可以使用半醛氨基轉(zhuǎn)移酶如ω-轉(zhuǎn)氨酶。例示性ω-轉(zhuǎn)氨酶包括但不限于分類在EC 2.6. 1 下的轉(zhuǎn)氨酶，如 EC 2. 6. 1. 18 ;EC 2. 6. 1. 19 ;2· 6. 1. 1 ;EC 2. 6. 1. 13 ;EC 2. 6. 1. 48 ;和 EC 2. 6. 1. 62。在一些實(shí)施方案中，所述氨基轉(zhuǎn)移酶是分類在EC 2. 6. 1. 18中的β -丙氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶，其來自 V. fluvialis、Β. weihenstephanensis、銅綠假單胞菌（Ρ. aureginosa)、 枯草芽孢桿菌（Β· subtilis)、或丁香假單胞菌（Ρ· syringae)。參見W02011/031147,其通過 提述完整并入本文。
[0183] 在一些實(shí)施方案中，7-氨基庚醛可使用催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脫氫 的酶產(chǎn)生。見圖1?？墒褂梅诸愒贓C 1.2. 1下的醛脫氫酶，如EC 1.2. 1.4或EC 1.2. 1.63 從7-氨基庚酸產(chǎn)生7-氨基庚醛。所述醛脫氫酶/羧酸還原酶還可以是EC 1.2. 99例如EC 1. 2. 99. 6中的。所述羧酸還原酶也可以屬于NAD依賴性非?；┟摎涿?，如鞘氨醇單胞菌 屬或貪銅菌屬（Cupriavidus)物種的ThnG。
[0184] 在一些實(shí)施方案中，七亞甲基二胺（亦稱為1,7-二氨基庚烷）可從7-氨基庚醛 產(chǎn)生，其使用催化氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶。見圖1。合適的氨基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于，EC 2.6. 1 中的氨基轉(zhuǎn)移酶如 EC 2. 6. 1. 18 ;EC 2. 6. 1. 19 ;EC 2. 6. 1. 11 ;EC2. 6. 1. 13 ;EC 2. 6. 1. 39 ; EC 2. 6. 1. 48 ;和EC 2. 6. 1. 62。在一些實(shí)施方案中，所述氨基轉(zhuǎn)移酶是分類在EC 2. 6. 1. 18 中的β-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其來自V. fluvialis、B. weihenstephanensis、銅綠假單胞菌、 枯草芽孢桿菌、或丁香假單胞菌。參見W02011/031147,其通過提述完整并入本文。
[0185] 在一些實(shí)施方案中，庚內(nèi)酰胺可使用催化7-氨基庚酸的酰胺水解的酶從7-氨基 庚酸產(chǎn)生。見圖1。可使用合適的酰胺水解酶包括分類在EC 3. 5.2如EC3. 5. 2.12或EC 3. 5. 2. 11下的酰胺轉(zhuǎn)移酶。
[0186] 在一些實(shí)施方案中，7-羥基庚酸自庚二酸半醛產(chǎn)生或7-氨基庚醇自7-氨基庚醛 產(chǎn)生，其使用催化醛還原的酶。見圖1。例如，可使用分類在EC 1.1. 1如EC 1.1. 1.2或 EC 1.1. 1.21下的醇脫氫酶。本領(lǐng)域中技術(shù)人員會(huì)理解存在非常多的具有廣泛底物范圍的 醇脫氫酶，且來自EC L L L -如L L L B3或ECL L L B4或L L L 79,或在EC L L 99如 1. 1. 99. 2或EC 1. 1. 99. 6中的其他脫氫酶也可以用于將醛還原成相應(yīng)的醇?；蛘?，可以使 用醇氧化酶。所述醇氧化酶可以在EC 1.1.3. 13類中。
[0187] 在一些實(shí)施方案中，1，7庚二醇可自7-羥基庚酸產(chǎn)生，其使用醛脫氫酶和醇脫 氫酶。合適的醛脫氫酶可以使分類在EC 1.2. 1(例如EC 1.2. 1.4或EC1. 2. 1.63或EC 1. 1. 1.21)下的。見圖1。合適的醇脫氫酶可以是分類在E. C. 1. 1. 1.如EC 1. 1. 1. 1或EC 1. 1. 1. 2下的。本領(lǐng)域中技術(shù)人員會(huì)理解存在非常多的具有廣泛底物范圍的醇脫氫酶，且來 自 EC 1. 1. 1.-如 1. 1. 1. B3 或 EC 1. 1. 1. B4,或 1. 1. 1. 79,或在 EC 1. 1. 99 如 1. 1. 99. 2 或 EC 1.1. 99. 6中的其他脫氫酶也可以用于將醛還原成相應(yīng)的醇?；蛘撸梢允褂么佳趸?。 所述醇氧化酶可以在EC1. 1. 3. 13類中。類似地，存在非常多數(shù)量的具有廣泛底物特異性的 醛脫氫酶或羧酸還原酶。適宜的醛脫氫酶包括EC 1.2. 1.3:EC 1.2. 1.4;和EC 1.2. 1.63。 所述醛脫氫酶/羧酸還原酶還可以在EC 1.2. 99例如EC 1.2. 99. 6中。所述醛脫氫酶/ 羧酸還原酶還可以屬于NAD依賴性非?；┟摎涿福缜拾贝紗伟鷮倩蜇濄~菌屬物種的 ThnG?；蛘?，可以使用醛氧化酶，如來自EC 1. 2. 3. 1的醛氧化酶。
[0188] 在其中C7二或三官能烷可能對宿主有毒性（例如半醛如7-氧庚酸或7-氨基庚 醛）的實(shí)施方案中，對毒性化合物的轉(zhuǎn)化可以在體外實(shí)施，其使用分離的酶或來自重組宿 主的裂解物。在一些實(shí)施方案中，毒性化合物由宿主產(chǎn)生，然后轉(zhuǎn)化（使用分離的酶、表達(dá) 酶的重組宿主、或化學(xué)轉(zhuǎn)化）成庚內(nèi)酰胺。
[0189] 1. 5庚二酸和/或庚二酰-CoA的生物合成途徑
[0190] 庚二酸和/或庚二酰-CoA可經(jīng)由許多不同的方式獲得，包括：（i)從α-酮酸鏈 延伸途徑產(chǎn)生的α-酮辛二酸，或（ii)生物素生物合成途徑I 生物素生物合成途 徑II ; (iv)三個(gè)丙二酰-CoA分子到單個(gè)庚二酰-CoA分子的縮合；(v)苯甲酸降解途徑； (vi)環(huán)己烷羧酸酯途徑，（vi)D，L-二氨基庚二酸途徑；和（vii)其中起始碳源是巴豆酸酯 (crotonate)的生物合成途徑。見圖2。這些到庚二酸和/或庚二酰-CoA的途徑在下文以 更多細(xì)節(jié)描述。
[0191] 在其中任一種途徑中，庚二酸可從庚二酰-CoA產(chǎn)生，其使用催化硫酯水解的酶。 例如，能水解硫酯的酶包括但不限于，硫酯酶、酸-硫醇連接酶和CoA轉(zhuǎn)移酶。合適的硫酯 酶包括分類在EC 3. 1.2中的硫酯酶，如YciA，tesB或Acotl3;EC 3. 1.2. 2的基因產(chǎn)物； EC3·l·2·18;EC3·l·2·19;或EC3·l·2·20。作用于?；?[acp]硫酯的硫酯酶包括EC 3·l·2·14，如FatA、FatB;和EC3·l·2·21。例如，可使用以下一種酶：分類在EC3·l·2中 的硫酯水解酶/?；?CoA硫酯酶如EC 3. 1. 2. 19和3. 1. 2. 18中的ADP依賴性中等鏈酰 基-CoA水解酶、EC 3. 1. 2. 20中的?；鵆oA水解酶；或YciA，tesB或Acotl3的基因產(chǎn)物； EC 3. 1. 2. 14中的油酰-[?；d體蛋白]水解酶。合適的酸-硫醇連接酶包括分類在EC 6.2.1 中的酸-硫醇連接酶，如 EC 6.2.1. 3 ;EC 6.2.1. 14;和 EC 6.2.1.23。合適的 CoA 轉(zhuǎn)移酶包括分類在EC 2. 8. 3下的CoA轉(zhuǎn)移酶如EC 2. 8. 3. 6、EC 2. 8. 3. 8、EC 2. 8. 3. 12 ; EC2. 8. 3. 13或EC 2. 8. 3. 14,或ThnH的基因產(chǎn)物，其催化CoA到庚二酸的可逆轉(zhuǎn)移。
[0192] 庚烷-1，7-二元酸可從庚二酰-[acp]獲得，其通過使用作用于[acp]_硫酯的酶， 如EC 3. 1. 2. 14中的酰基-[acp]硫酯酶，如fatA和fatB或EC 3. 1. 2. 21。或者，可以使用 作用于[acp]硫酯的酸-硫醇連接酶，如EC 6. 2. 1. 14和EC 6. 2. 1. 20。
[0193] 或者，庚二酸可從庚二酰_[acp]甲基酯獲得，其通過由AaasaS(?；?ACP合成 酶）水解酯鍵，接著通過脂肪酶/酯酶除去甲基基團(tuán)。
[0194] 庚二酸可轉(zhuǎn)化成庚二酸半醛，其使用催化羧酸還原的酶。合適的還原酶包括但不 限于，分類在EC 1. 2. 99中的羧酸還原酶；該羧酸還原酶還可以屬于NAD依賴性非酰化醛 脫氫酶，如鞘氨醇單胞菌屬或貪銅菌屬物種中的ThnG;或分類在EC 1.2. 1如EC 1.2. 1.3; EC 1.2. 1.10 ;EC 1.2. 1.22 ;EC 1.2. 1.50 ;EC1. 2. 1.57;和 EC 1.2. 1.76 中的脂肪?；?CoA還原酶。在一些實(shí)施方案中，脂肪-酰基-CoA還原酶可直接將庚二酰-CoA或庚二 酰-[acp]轉(zhuǎn)化成庚二酸半醛。EC 1.2.99中的例示性羰基還原酶包括但不限于來自諾卡 氏菌物種（Aimin 等，Appl. Environ. Microbiol. 70:1874-1881 (2004)，通過提述并入）或 灰色鏈霉菌（S. griseus) (Suzuki 等，J. Antibiot. (Tokyo)60:380_387(2007)，通過提述 并入）的EC1. 2. 99. 6。EC 1.2. 1中的例示性脂肪-?；鵆oA還原酶包括但不限于來自 例如 C. aurantiacus (Hugler, M,等，J. Bacteriology 184:2404-2410 (2002)，通過提述 并入）、M. sedula (Kockelkorn，D.和 Fuchs, G.，J. Bacteriology 191:6352-6362 (2009)， 通過提述并入）、或 S. tokodai (Alber, Β·等，J. Bacteriology 188:8551-8559 (2006)， 通過提述并入）的EC 1. 2. 1. 75 ;和來自以下的1. 2. 1. 50 :例如不動(dòng)桿菌屬物種 A.platyrhynchos(Ishige，T·，等，Appl.Envtl Microbiology 68:1192-1195(2002)， 通過提述并入）、擬南芥（A. thaliana) (Doan, Τ· Τ·，等，Journal Plant Physiology 166:787-796 (2009)和 Hooks, M A.，等，Plant J. 20:1-13 (1999)，兩者均通過提述并 入）；人（Homo sapiens) (McAndrew, R. P.等，J. Biol. Chem. 283:9435-9443(2008)，通過 提述并入）、小家鼠（M. Musculis)、P. leiognathi、明亮發(fā)光桿菌（P. phosphoreum)、豌 豆（P. sativum)、或 S. chinesis 的 1. 2. 1. 50。EC1. 2. 1 中的例示性?；?[acp]還原酶 包括ECl·2·l·80，來自例如Synecoccuselongates(Shirmer，A·等，（2010)·Microbila biosynthesis of alkanes. Science, 329(5991:559-562)〇
[0195] 1.5.1 a-酮酸鏈延伸
[0196] 二官能鏈烷可從a-酮戊二酸產(chǎn)生，其經(jīng)由本領(lǐng)域中已知的到a-酮己二酸、 a-酮庚二酸或a-酮辛二酸的連續(xù)鏈延伸反應(yīng)。參見例如圖3和W02010/068944。a-酮二 元酸（Cn，η = 5-8)或相應(yīng)2-氨基二元酸的脫羧然后提供Cn-Ι例如C4-7的a，ω -雙官能 烷的前體。這些連續(xù)的alpha-酮酸鏈延伸反應(yīng)發(fā)生在輔酶Β生物合成途徑中，如在產(chǎn)甲烷 細(xì)菌如詹氏甲燒球菌（Methanocaldococcus jannaschii)、沃氏甲燒球菌（Methanococcus voltae)和嗜熱甲燒八疊球菌（Methanosarcina thermophila)中闡明的。
[0197] 從α -酮戊二酸（C5)到α -酮辛二酸的3輪連續(xù)的鏈延伸由在底物上作用3次 的3個(gè)相同酶催化（且在EC 4. 2. 1. 114 (AksD (3-異丙基蘋果酸脫水酶大亞基）/AksE (3-異 丙基蘋果酸脫水酶小亞基））的情況中6次），每次增加鏈長度。見圖3。這些酶包括但 不限于：EC 2. 3. 3. 14:高朽1檬酸合酶/AksA (alpha-異丙基蘋果酸合酶），其作用于α-酮 戊二酸、α-酮己二酸和α-酮庚二酸；EC4. 2. 1. 114:高順烏頭酸酶或AksD/AksE，其催化 (R)-高檸檬酸、二高檸檬酸和三高檸檬酸的脫水反應(yīng)，以及順式-高烏頭酸、順式_(高） 2 烏頭酸和順式_(高）3烏頭酸的水合反應(yīng)；和EC 1. 1. 1.87 :高異檸檬酸脫氫酶或AksF(多 功能3-異丙基蘋果酸脫氫酶/D-蘋果酸脫氫酶），其催化高異檸檬酸、蘇型-異（高）2檸 檬酸和蘇型-異（高） 3檸檬酸的NAD (P) +依賴性氧化性脫羧。
[0198] 例示性AksA酶包括但不限于，EC 2. 3. 3中的那些，如EC 2. 3. 13或2. 3. 3. 14。例 示性AksD酶包括EC 4. 2. 1中的那些，如EC 4. 2. 1. 36。例示性AksF酶包括但不限于EC 1. 1. 1 中的酶，如 EC 1. 1. 1.87。
[0199] 在一些實(shí)施方案中，所述鏈延伸酶是 AksA MTH1630、AksD MTH1631、AksE MTH0829 或AksF MTH1388。參見，例如W02010/104391，其通過提述并入本文。
[0200] 該途徑的優(yōu)點(diǎn)在于其僅需要這3種異源蛋白質(zhì)在宿主中的重組表達(dá)。從α-酮 戊二酸到α_酮己二酸的鏈延伸還發(fā)生在古細(xì)菌，包括Aeropyrum pernix、Deinococcus radiodurans、Pyrococcus abyssi>Pyrococcus horikoshii、硫石黃礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus)、Sulfolobus tokodaii和嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus)的賴氨酸生 物合成V途徑中；以及酵母和真菌包括Euglena gracilis、曲霉屬、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum)和釀酒酵母的賴氨酸生物合成IV途徑中。
[0201] 在賴氨酸生物合成IV和V途徑中，從α-酮戊二酸到α-酮己二酸的反應(yīng)由 4種酶的連續(xù)作用催化，即疋0 2.3.3.14:高檸檬酸合酶〇?^/1^520/1^521/1^-)出〇 4. 2. 1.114 :產(chǎn)甲烷菌HACN;EC 4. 2. 1.36:高順烏頭酸酶水合酶；和EC 1.1. 1.87-高異檸 檬酸脫氫酶（hicDH或LYS12)。
[0202] 1. 5. 3丙二酰-CoA縮合途徑
[0203] 在一些實(shí)施方案中，丙二酰-CoA可用作庚二酰-CoA的來源，因?yàn)槟承┥锬軐? 個(gè)丙二酰-CoA分子縮合成單個(gè)庚二酰-CoA分子。見圖4。亦參見Lin, S.和Cronan, ΙΕ. ， Molecular Biosystems 7:1811-21 (2011)，其通過提述并入本文。因此，可產(chǎn)生一種其 中從丙二酰-CoA生成庚二酰-CoA的重組宿主。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是無色桿菌 屬（Achromobacter)以外的生物體。在一些實(shí)施方案中，庚二酰-CoA可隨后轉(zhuǎn)化成庚二酸 或其他雙官能C7鏈烷。
[0204] 1. 5. 4生物素生物合成途徑I (革蘭氏陰性細(xì)菌）和II (革蘭氏陽性細(xì)菌）
[0205] 在一個(gè)實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞從源自甘油和/或脂肪酸的乙酰-CoA產(chǎn) 生庚二酸和 / 或庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。參見d^i^nLin，S.，NatureChem. Biol. 6:682-688 (2010);和 Cronan，J.E.和 Lin, S·，Current Opinion in Chem. Biology 15:1-7(2011)，兩者均通過提述并入本文。圖5顯示通過枯草芽孢桿菌中的Biol經(jīng)由對長 鏈脂肪酸-[acp]硫酯的氧化性切割形成庚二酰-[acp]，其被轉(zhuǎn)化成作為生物素生物合成 Π (革蘭氏陽性細(xì)菌）中前體的庚二酸或庚二酰-CoA。圖6顯示在生物素生物合成1(革 蘭氏陰性細(xì)菌）中形成庚二酰_[acp]或其甲基酯。圖6還顯示用于將庚二酰-[acp]甲基 酯轉(zhuǎn)化成庚二酸單甲基酯的途徑。然后，庚二酸單甲基酯在存在例如EC 3. 1.1.中的脂肪 酶的情況下轉(zhuǎn)化成庚二酸（庚烷-1，7-二元酸）。圖6還顯示在存在酯酶（例如EC 3. 1. 1 如EC 3. 1. 1.85中的酶，BioH)的情況下庚二酰-[acp]甲基酯到庚二酰-[acp]的轉(zhuǎn)化。庚 二酰-[acp]然后在存在?；?[acp]-硫酯酶，例如EC 3. 1. 2. 14中的酶如FatA或FatB的 情況下被轉(zhuǎn)化成庚二酸（庚烷-1，7-二元酸）。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋能產(chǎn)生庚二 酸（庚烷-1，7-二元酸）的重組宿主細(xì)胞，其包含圖6中顯示的一種或所有酶。在一些實(shí) 施方案中，所述重組宿主細(xì)胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中確實(shí)具有缺陷，該酶是一種能 將6-羧基己?；?C 〇A(庚二酰-CoA)轉(zhuǎn)化成7-酮-8-氨基壬酸（ΚΑΡΑ)的酶，且由具有天 然生物素生物合成途徑的宿主生物中的BioF基因編碼，從而使得庚二酰-CoA不能穿梭到 生物素生物合成中。
[0206] 庚二酰_[acp]甲基酯還可作為長鏈?；?[acp]和/或游離脂肪酸通過Biol (例 如來自枯草芽孢桿菌的Biol)的代謝的結(jié)果產(chǎn)生。
[0207] 1. 5. 5真核生物素生物合成途徑
[0208] 庚二酸和/或庚二酰-CoA還可從真核的生物素生物合成途徑獲得。參見，例如 Roje，S·，Phytochemistry 68:1904-1921(2007);和 Charles R. Hall, The Contribution of Horizontal Gene Transfer to the Evolution of Fungi (May 10, 2〇〇7)(未公開出版 的博士論文，Duke University)(存檔在Duke University Libraries)，兩者均通過提述并 入本文。在真核途徑中，乙酰-CoA被生物轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰CoA，其使用分類在EC 2. 3. 1. 9 下的酶；乙酰乙酰-CoA被生物轉(zhuǎn)化成（S)-3-羥基丁酰-CoA，其使用分類在E. C. 1. 1. 1. 157 下的酶；（S)-3-羥基丁酰-CoA被生物轉(zhuǎn)化成巴豆酰-CoA，其使用分類在EC 4. 2. 1. 17下的 酶；巴豆酰-CoA被生物轉(zhuǎn)化成戊烯二酰-Ι-CoA，其使用分類在EC 4. 1. 1. 70下的酶；戊烯 二酰-Ι-CoA被生物轉(zhuǎn)化成戊二酰-CoA，其使用分類在EC 1. 3. 99. 7下的酶；戊二酰-CoA 被生物轉(zhuǎn)化成3-酮庚二酰-CoA，其使用分類在EC 2. 3. 1. 43下的酶；3-酮庚二酰-CoA被 生物轉(zhuǎn)化成3-羥基庚二酰-CoA，其使用分類在EC1. 1. 1. 4259下的酶；3-羥基庚二酰-CoA 被生物轉(zhuǎn)化成2, 3-二脫氫-庚二酰-CoA，其使用分類在EC 4. 2. 1.-下的酶，而2, 3-二 脫氫-庚二酰-CoA被生物轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，其使用分類在EC 1. 3. 1. 62下的酶。庚二 酰-CoA隨后轉(zhuǎn)化成庚二酸。
[0209] 如此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其包含用于將乙酰CoA 轉(zhuǎn)化成庚烷-1，7-二元酸的酶。在一些實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞在7-酮-8-氨 基壬酸合成酶中具有缺陷，該酶是一種能將6-羧基己?；?C 〇A(庚二酰-CoA)轉(zhuǎn)化成 7_酮-8-氨基壬酸（ΚΑΡΑ)的酶，且由宿主（如果宿主生物具有天然生物素生物合成途徑） 中的BioF基因編碼，從而使得庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]不能穿梭到生物素生物合成 中。在一些實(shí)施方案中，將Biol過表達(dá)以增加經(jīng)由脂肪酸-[acp]酯的氧化性切割形成 的庚二酰-[acp]。在一些實(shí)施方案中，[acp]-轉(zhuǎn)移酶/合成酶活化長鏈脂肪酸到其相應(yīng) [acp]_硫酯以通過Biol切割在宿主細(xì)胞中過表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供一種產(chǎn)生庚 烷-1，7-二元酸的方法，其包括使用這類重組宿主細(xì)胞。
[0210] 1. 5. 6苯甲酰-CoA降解途徑
[0211] 本文中涵蓋的庚二酰-CoA和/或庚二酸的一個(gè)另外的來源是圖7中顯示的苯 甲酸降解途徑。參見，例如 Bernsteinb，J.R·，等，Metabolic Eng'g 10:131-140(2008); Harwood, C.S·，等，F(xiàn)EMS Microbiology Reviews 22:439-458(1999);和Harrison, F.H.和 Harwood, C. S.，Microbiology 151:727-736 (2005)，其均通過提述并入本文。許多轉(zhuǎn)化例示 在圖7中，其中苯甲酸使用分類在EC6. 2. 1.25下的酶轉(zhuǎn)化成苯甲酰-CoA，并最后轉(zhuǎn)化成庚 二酰-CoA。苯甲酰-CoA轉(zhuǎn)化成環(huán)己-1，5-二烯羰基CoA，其使用分類在EC 1.3. 99. 15下 的酶。在一些實(shí)施方案中，環(huán)己-1，5-二烯羰基CoA生物轉(zhuǎn)化成6-羥基環(huán)己-1-烯-1-羧 基-CoA，其使用分類在EC 4. 2. 1. 100下的酶；6-羥基環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA生物轉(zhuǎn) 化成6-酮氧基環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA，其使用分類在EC 1. 1. 1-下的酶；6-酮氧基環(huán) 己-1-烯-1-羧基-CoA生物轉(zhuǎn)化成3-羥基庚二酰-CoA，其使用分類在EC 3. 7. 1.-下的 酶；3-羥基庚二酰-CoA生物轉(zhuǎn)化成6-羧基己-2-烯酰-CoA，其使用分類在EC4. 2. 1.-下 的酶；3-羥基庚二酰-CoA生物轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，其使用分類在EC1. 3. 1. 62下的酶。相 應(yīng)地，庚二酰-CoA轉(zhuǎn)化成庚二酸（庚烷-1,7-二元酸）。在一些實(shí)施方案中，環(huán)己-1,5-二 烯羰基CoA生物轉(zhuǎn)化成環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA，環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA生物轉(zhuǎn)化成 2-羥基環(huán)己烷-1-羧基CoA，其使用分類在EC4. 2. 1.-下的酶；2-羥基環(huán)己烷-1-羧基CoA 生物轉(zhuǎn)化成2-酮環(huán)己烷-1-羧基-CoA，其使用分類在E.C. 1. 1. 1.-下的酶，而2-酮環(huán)己烷 羧基-CoA生物轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，其使用分類在EC 3. 1. 2.-下的酶（例如一種酮環(huán)己烷 羧基-CoA水解酶Rp-badl，分類在EC 3. 1. 2.-下的酶）。
[0212] 在一些實(shí)施方案中，所述能產(chǎn)生庚烷-1，7-二元酸的重組宿主細(xì)胞包含一種或多 種在圖7或本部分中列出的酶。
[0213] 1. 5. 7 2, 6-二氨基庚二酸途徑
[0214] 庚二酸的又一種來源是D，L二氨基庚二酸，亦稱為2, 6-二氨基庚二酸。D，L-二 氨基庚二酸是賴氨酸產(chǎn)生中的中間物。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源性賴氨酸途徑可修改為優(yōu) 先產(chǎn)生庚二酸，其通過創(chuàng)造出在二氨基庚二酸脫羧酶中具有缺陷的重組宿主細(xì)胞。見例 如圖10。D，L二氨基庚二酸可生物轉(zhuǎn)化成不飽和的單氨基庚二酸，其通過催化D，L二氨基 庚二酸到6-氨基-2-庚烯二元酸的還原性脫氨基化的酶。催化D，L二氨基庚二酸的還 原性脫氨基化的酶例子包括分類在EC 4. 3. 1中的氨裂合酶，如EC 4. 3. 1. 1 ;EC 4. 3. 1. 2 ; EC 4. 3. 1. 3 ;EC 4. 3. 1. 9 ;EC 4. 3. 1. 12 ;EC 4. 3. 1. 13 ;EC 4. 3. 1. 14 ;EC 4. 3. 1. 23 ;和 EC 4. 3. 1.24。在一些實(shí)施方案中，所述氨裂合酶是分類在EC 4. 3. 1.2下的甲基天冬氨酸氨 裂合酶，其來自無丙二酸朽1檬酸桿菌、C. tetanomorphum或米曲霉（A. oryzae)。參見，例 如 Botting，Biochemistry 27:2953-2955(1988);和 Kato，Appl Microbiol. BiotechnoL 50:468-474(1998)，其通過提述完整并入本文。
[0215] 6-氨基-2-庚烯二酸可生物轉(zhuǎn)化成2-氨基-2-庚烯二酸，其使用催化6-氨 基-2-庚烯二酸到2-氨基-2-庚二酸（亦稱為2-氨基庚二酸或alpha氨基庚二酸鹽） 的烯酸還原的酶。催化6-氨基-2-庚烯二酸的烯酸還原的酶例子包括分類在EC1. 3. 1中 的烯酸還原酶，如 EC 1.3.1.8;EC 1.3.1.9;EC 1.3.1.10，EC L3.L31;ECL3.L38;EC L 3. L 39 ;EC L 3. L 44,或 EC L 3. L 62 中的庚二酰-CoA 脫氫酶如 PimC/PimD 或 ThnJ/ ThnK。所述烯酸還原酶還可以在EC 1.3中，如EC 1.3. 8.1或EC 1.3. 99. 3 ;EC 1.3. 99. B10或Syntrophus aciditrophicus 2, 3-二脫氫庚二酰-CoA還原酶及其同源物。在一些 實(shí)施方案中，所述烯酸還原酶是EC 1.3. 1.31中的YqjM或0PR1/3,其分別來自枯草芽孢 桿菌或 L. esculentum。參見，例如 Stueckler, Org. Lett. 9:5409-5411 (2007) ;Kitzing，J. Biol. Chem. 280:27904-27913(2005) ;Hall，Angew.Chem.Int. Ed. 46:3934-3937(2007);和 fceithaupt, Proc. Natl. Acad. Sci USA 103:14337-14342 (2006)，其通過提述完整并入本 文。
[0216] 2-氨基庚二酸可轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的2-庚烯二酸（亦稱為2, 3-二脫氫庚二酸），其通 過催化2-氨基庚二酸的還原性脫氨基化的酶。催化2-氨基庚二酸的還原性脫氨基化的 酶例子包括分類在EC 4. 3. 1中的氨裂合酶，如EC 4. 3. 1. 1 ;EC4. 3. 1. 2 ;EC 4. 3. 1. 3 ;EC 4· 3· 1· 9 ;EC 4· 3· 1· 12 ;EC 4· 3· 1· 13 ;EC 4· 3· 1· 14 ;EC4. 3· 1· 23 ;或 EC 4· 3· 1· 24,如上文 描述的。
[0217] 2-庚烯二酸可轉(zhuǎn)化成2-庚烯二酸CoA，其使用CoA轉(zhuǎn)移酶（例如，分類在EC2. 8. 3 如EC 2. 8. 3. 12或EC 2. 8. 3. 13或EC 2. 8. 3. 14中的CoA轉(zhuǎn)移酶或催化CoA到庚二酸的 可逆轉(zhuǎn)移的ThnH的基因產(chǎn)物）和酸硫醇連接酶（例如分類在EC6. 2. 1如EC 6. 2. 1. 3 ;EC 6. 2. 1. 5 ;EC 6. 2. 1. 14 ;或 EC 6. 2. 1. 23 中的酸-硫醇連接酶）。
[0218] 然后，將2-庚烯二酸CoA轉(zhuǎn)化成庚二酸-CoA，其通過催化2-庚烯二酸的烯酸還原 的酶，如分類在EC 1.3. 1.中的烯酸還原酶。庚二酸-CoA可如上文所述轉(zhuǎn)化成庚二酸或庚 二酸半醛。
[0219] 如圖10和圖3中顯示的，α酮庚二酸還可進(jìn)行1輪鏈延伸成為α -酮-辛二酸， 其其使用鏈延伸酶如存在于產(chǎn)甲燒細(xì)菌（例如Methanobacterium autotrophicum)中的那 些。這類鏈延伸酶包括但不限于AksA、AksD和AksE或F，如上文論述的。例示性AksA酶 包括但不限于EC 2. 3. 3.中的那些。EC 2. 3. 3中的例示性酶包括但不限于EC 2. 3. 13或 2. 3. 3. 14。例示性AksD酶包括EC4. 2. 1.中的那些。EC 4. 2. 1中的例示性酶包括但不限于 EC 4. 2. 1. 36。例示性AksF酶包括但不限于EC 1. 1. 1.中的酶。EC 1. 1. 1中的例示性酶 包括但不限于EC1. 1.1.87。而且在此情況下，第四組酶包括脫羧酶。例示性脫羧酶包括EC 4. 1. 1.中的那些。EC 4. 1. 1中的例示性脫羧酶包括但不限于EC 4. 1. 1. 11 ;EC 4. 1. 1. 15 ; EC 4. 1. 1. 17 ;EC 4. 1. 1. 18 ;EC 4. 1. 1. 19 ;EC 4. 1. 1. 20 和 EC 4. 1. 1. 86。
[0220] 在一些實(shí)施方案中，乙酰-CoA可供給到三羧酸（TCA)循環(huán)中，其中乙酰-CoA轉(zhuǎn)化 成琥珀酸（1，4-丁二酸）。然后，琥珀酸從TCA循環(huán)轉(zhuǎn)移到用于合成庚二酸的途徑中，其開 始于2-氧戊二酸到2-羥基-1，2, 4- 丁烷三羧酸（高檸檬酸）（例如通過EC 2. 3. 3. 14中 的酶）的生物轉(zhuǎn)化；高檸檬酸到高順式烏頭酸和高順式烏頭酸到高異檸檬酸的生物轉(zhuǎn)化， 其使用分類在EC 4. 2. 1. 36下的酶；高異檸檬酸到草酰戊二酸的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在 EC 1.1. 1.87下的酶；草酰戊二酸到2-氧己二酸的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在EC 1.1. 1.87 下的酶；和2-氧己二酸到戊二酰-CoA的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在EC 1.2. 4.2下的酶。戊 二酰-CoA可轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，如上文論述的。最后，高檸檬酸轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，然后 轉(zhuǎn)化成庚二酸，如本文中描述的。
[0221] α -酮-辛二酸可被α -酮酸脫羧酶脫羧以形成庚二酸半醛，或使用氨基酸轉(zhuǎn)氨 酶轉(zhuǎn)化成α-氨基辛二酸，其在通過α-氨基酸脫羧酶脫羧時(shí)將直接產(chǎn)生7-氨基庚酸。或 者，所述庚二酸半醛可使用ω-轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化成7-氨基庚酸。例示性α-酮酸脫羧酶包括EC 4. 1. 1 中的那些，如 EC 4. 1. 1. 1 ;EC 4. 1. 1.7 ;和 EC 4. 1. 1.72,或 EC 2.2. 1.6 類中的乙酰 乳酸合酶。
[0222] 例示性 α -氨基酸脫羧酶包括 EC 4. 1. 1. 11 ;EC 4. 1. 1. 15 ;EC 4. 1. 1. 17 ; EC4. 1· 1· 18 ;EC 4· 1· 1· 19 ;EC 4· 1· 1· 20 ;EC 4· 1· 1· 45 和 EC 4· 1· 1· 86 中的那些。在一些 實(shí)施方案中，所述脫羧酶包括EC 4. 1. 1. 1中的來自乳酸乳球菌的酮異戊酸脫羧酶kivD ; EC4. 1. 1.7中的來自惡臭假單胞菌（P.putida)的苯甲酰甲酸脫羧酶mdIC A460I或BFD; EC 4. 1. 1. 1中的來自釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶同工酶1和2Pdcl ;來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的 丙酮酸脫羧酶Pdc(I472A);或EC 4. 1. 1.72中的來自乳酸乳球菌的支鏈alpha-酮酸脫羧 酶kdcA，如記載于W02011/031147的，其通過提述完整并入本文。例示性氨基酸轉(zhuǎn)氨酶包 括 EC2.6.1 中的那些，如 EC 2.6.L21;EC 2.6.L39;EC 2.6.L42;和 EC 2.6.L67。例 示性 ω-轉(zhuǎn)氨酶包括 EC 2. 6. 1 中的那些，如 EC 2. 6. 1. 11 ;EC 2. 6. 1. 13 ;EC 2. 6. 1. 18 ;EC 2· 6· 1· 19 ;EC 2· 6· 1· 48 ;和 EC 2· 6· 1· 62。
[0223] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可使α酮庚二酸與一種或多種催化到α羥基庚二酸的酮還 原的酶（例如羰基還原酶如EC 1. 1. 1. 184)接觸，其相應(yīng)地可使用催化CoA轉(zhuǎn)移的酶（例 如上述CoA轉(zhuǎn)移酶）轉(zhuǎn)化成α -羥基庚二酸CoA。α -羥基庚二酸CoA可轉(zhuǎn)化成2-庚烯二 酸CoA，其使用催化α -羥基庚二酸-CoA脫水的酶（例如分類在EC 4. 2. 1下的水裂合酶如 EC 4. 2. 1. 2、4· 2. 1. 17 ;EC 4. 2. 1. 18 ;EC EC 4. 2. 1. 59 和 EC 4. 2. 1. 61)。2-庚烯二酸 CoA 可轉(zhuǎn)化成庚二酸CoA，其使用催化2-庚烯二酸CoA的烯酸還原的酶。在上文描述了合適的 烯酸還原酶。
[0224] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其包含將D，L_二氨基庚二酸 優(yōu)先轉(zhuǎn)化成庚二酸所需的一種或多種酶。
[0225] 1.5. 8巴豆酸酯途徑
[0226] 庚二酰-CoA的來源以及最終庚二酸的來源是其中起始碳源是巴豆酸酯的生物 合成途徑。該生物合成途徑例示于圖9。參見，例如Mouttaki，H.，等，Applied Envtl. Microbiology 73:930-938(2001)。巴豆酸酯分解成乙酰-CoA。已報(bào)告圖9所示生物合成 途徑中產(chǎn)生的2/3的乙酰-CoA被轉(zhuǎn)化成乙酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿 主細(xì)胞，其在會(huì)將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酸的酶（例如磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酸激酶）中有缺 陷，從而使得乙酰-CoA在圖9所示許多代謝步驟中被轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰-CoA，然后轉(zhuǎn)化成戊 烯二酰-CoA。然后戊烯二酰-CoA被轉(zhuǎn)化成戊二酰-CoA。戊二酰-CoA經(jīng)過鏈延伸以形成 3-氧庚二酰-CoA。在還原、脫水和第二次還原后，獲得庚二酰-CoA。
[0227] 在圖9所示生物合成途徑中，庚二酰-CoA最終被轉(zhuǎn)化成環(huán)己烷羧酸。這類生物合 成途徑已在S. aciditrophicus中觀察到。如此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組 宿主細(xì)胞，其中編碼會(huì)將庚二酰-CoA轉(zhuǎn)化成環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA并最終轉(zhuǎn)化成環(huán)己 烷羧酸的酶被"敲除"，從而使得代謝途徑在庚二酰-CoA終止。
[0228] 1. 5. 9 萘滿（Tetralin)降解途徑
[0229] 在一些實(shí)施方案中，使用來自鞘氨醇單胞菌和棒狀桿菌物種的萘滿（苯環(huán)己烷） 降解途徑產(chǎn)生庚二酸半醒。7-氧庚酸作為Sphingomonas macrogolitabid中萘滿降解途 徑的中間物產(chǎn)生。L0pez_S(5nchez，A.，等，Appl. Environ. Microbiol. 76:110-118 (2010)。 萘滿通過切割兩個(gè)芳香環(huán)代謝，得到丙酮酸和庚二酸半醛。萘滿（一種有機(jī)溶劑）是源 自萘的復(fù)雜起始材料。萘目前自煤焦油產(chǎn)生，但已知用于萘合成的生物合成途徑發(fā)生 在白蟻、真菌和一些植物類型中。Chen, J.等，Nature 392:558-559(1998) ;Daisy，B. H·，等，Microbiology 148:3737-3741(2002);和 Azuma，H·，等，Phytochemistry 42:999-1004 (1996)。庚二酸半醛可轉(zhuǎn)化成7-氨基庚酸或7-羥基庚酸，如上文論述的。
[0230] 1. 11來自2-氧庚二酸的六亞甲基二胺
[0231] 本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供一種從2-氧庚二酸產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法，包 括使用重組的宿主細(xì)胞。2-氧庚二酸是產(chǎn)甲烷古細(xì)菌中輔酶B生物合成途徑中的已知中間 物。
[0232] 如此，本發(fā)明提供包含以下的重組宿主細(xì)胞：能將2-氧庚二酸轉(zhuǎn)化成2-氨基庚二 酸的酶（例如EC 2. 6. 1. 67中的氨基轉(zhuǎn)移酶）、能將2-氨基庚二酸轉(zhuǎn)化成2-氨基-7-氧庚 酸的酶（例如EC 1. 4. 1中的還原酶）、能將2-氨基-7-氧庚酸轉(zhuǎn)化成2, 7-二氨基庚酸的 酶（例如EC 2. 6. 1中的1-氨基轉(zhuǎn)移酶）、能將2, 7-二氨基庚酸轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺的酶 (例如EC 4. 1.1中的脫羧酶）。在一些實(shí)施方案中，所述能產(chǎn)生六亞甲基二胺的重組宿主 細(xì)胞包含任意或所有的這些酶。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供一種產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法， 其包括使用這些重組宿主細(xì)胞。
[0233] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于從可再生給料如糖、脂肪酸、甘油和合成 氣產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法。在一些實(shí)施方案中，能產(chǎn)生六亞甲基二胺的非天然存在的宿 主細(xì)胞包含將可再生給料轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺所需的任意或所有酶。
[0234] 2. 2重組宿主細(xì)胞
[0235] 本公開特征是重組表達(dá)1種或多種（例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更 多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多 種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或 更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種、或甚至更多種） 用于在本文所述的一種途徑中產(chǎn)生化合物的酶的重組宿主細(xì)胞，以及使用這類宿主細(xì)胞來 產(chǎn)生二和三官能C7鏈烷的方法。例如，宿主細(xì)胞可包含一種或多種（如上文）外源性核 酸，其編碼一種或多種（如上文）以下酶：催化D，L二氨基庚二酸或alpha-氨基庚二酸的 還原性脫氨基化的酶；催化2-庚烯二酸到庚二酸的烯酸還原的酶；催化庚二酸到庚二酸半 醛的羧酸還原的酶，催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶，催化7-氨基庚酸到 庚內(nèi)酰胺的酰胺水解的酶，催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脫氫的酶；催化氨基基團(tuán)到 7_氨基庚醛的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7-二氨基庚烷的酶；催化CoA到2-庚烯二酸轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2-庚 烯二酸-CoA的酶；催化2-庚烯二酸-CoA到庚二酰-CoA的烯酸還原的酶；催化庚二酰-CoA 以產(chǎn)生庚二酸的硫酯水解的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸還原的酶；催化alpha氨 基庚二酸的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生alpha酮庚二酸的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha輕基 庚二酸的羰基還原的酶；催化CoA到alpha羥基庚二酸轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生alpha羥基庚二酸CoA 的酶；催化alpha輕基庚二酸到2-庚烯二酸的還原的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha酮 辛二酸的alpha酮酸鏈延伸的酶，催化氨基基團(tuán)到alpha酮辛二酸轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生alpha-氨基 辛二酸酯的酶，催化alpha氨基辛二酸到7-氨基庚酸的alpha酮酸脫羧的酶；催化alpha 酮辛二酸的alpha酮酸脫羧以產(chǎn)生庚二酸半醛的脫羧的酶；催化6-氨基-2-庚烯二酸的烯 酸還原以產(chǎn)生庚二酸的酶；或催化庚二酰[acp]到庚二酸的硫酯水解的酶。重組宿主細(xì)胞 可含有由編碼一種或多種上文所列酶的一種或多種（如上文）核酸組成的任意亞組。
[0236] 使用的宿主細(xì)胞通常具有許多特性：它們可容易地進(jìn)行遺傳修飾、對本發(fā)明方法 中使用的條件耐受、且生長至工業(yè)有用的細(xì)胞密度。
[0237] 任選地，所述宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，或可以是細(xì)胞系的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可 以具有野生基因型。在此情況中，用于催化本發(fā)明方法中一個(gè)或多個(gè)步驟的酶天然存在于 宿主細(xì)胞中且以在本發(fā)明方法中具有工業(yè)用途的水平表達(dá)。在一個(gè)備選方案中，宿主細(xì)胞 已經(jīng)過遺傳修飾從而以在本發(fā)明實(shí)施方案的方法中具有工業(yè)用途的水平表達(dá)酶。所述酶可 源自表達(dá)其的細(xì)胞。在一個(gè)備選方案中，所述酶源自不同的菌株或物種的細(xì)胞。
[0238] 在一個(gè)備選方案中，所述宿主細(xì)胞是原核生物的。在另一個(gè)備選中，其為真核生物 的。通常使用單細(xì)胞微生物。
[0239] 術(shù)語原核細(xì)胞包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。合適的革蘭氏陰性細(xì)菌的例子 包括：埃希氏菌屬（Escherichia)如大腸桿菌（Escherichia coli);梭菌屬（Clostridia) 如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum) 或克氏梭菌（Clostridium kluyveri);棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿 菌（Corynebacterium glutamicum);貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator)或 耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metallidurans);假單胞菌屬（Pseudomonas)如焚光假單 胞菌（Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)或食油假單胞 菌（Pseudomonas oleavorans);代爾夫特菌屬（Delftia)如食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans);芽抱桿菌屬（Bacillus)如枯草芽抱桿菌（Bacillus subtillis);乳桿 菌屬（Lactobacillus)如德氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii);和乳球菌屬 (Lactococcus)如乳酸乳球菌（Lactococcus lactis) ?
[0240] 真核宿主細(xì)胞包括來自酵母和其他真菌的那些細(xì)胞，以及例如昆蟲、小鼠、大 鼠、靈長類或人的細(xì)胞。合適的真核宿主細(xì)胞的例子包括來自以下屬的酵母和真菌： 曲霉屬（Aspergillus)如黑曲霉（Aspergillus niger);酵母屬（Saccharomyces)如 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);假絲酵母屬（Candida)如熱帶假絲酵母 (C. tropicalis)、白色假絲酵母（C. albicans)、C. cloacae、C. guillermondii、中型假絲 酵母（C. intermedia)、麥芽糖假絲酵母（C.maltosa)、近平滑假絲酵母（C.parapsilosis) 和C. zeylenoides ;畢赤酵母屬（Pichia)如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris); 耶氏酵母屬（Yarrowia)如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica);伊薩酵母屬 (Issatchenka)如 Issathenkia orientalis ;德巴利酵母屬（Debaryomyces)如漢遜 德巴利酵母（Debaryomyces hansenii) ;Arxula 屬如 Arxula adenoinivorans ;克魯 維酵母屬（Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis);外瓶霉屬 (Exophiala);毛霉屬（Mucor);木霉屬（Trichoderma);枝抱屬（Cladosporium);平革菌屬 (Phanerochaete) ;Cladophialophora 屬；擬青霉屬（Paecilomyces) ;Scedosporium 屬和 Ophiostoma 屬。
[0241] 可以以多種不同形式提供宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是靜息細(xì)胞。即，在培養(yǎng)物中 生長細(xì)胞并在用作生物催化劑之前從培養(yǎng)基取出。所述細(xì)胞可在生長后直接使用，或者可 在使用前將其儲(chǔ)存。儲(chǔ)存的典型方法包括冷凍。在一個(gè)備選方案中，所述細(xì)胞在使用前凍 干。在一個(gè)別的備選方案中，所述細(xì)胞是生長的細(xì)胞。即，細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)實(shí)施其生物催化作 用。如果特定生物催化反應(yīng)的底物不能跨越細(xì)胞膜由宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，那么在一個(gè)備選方案 中，可使用粗裂解物。粗裂解物是在裂解細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞組分的初始懸液。細(xì)胞的裂解 可通過任何手段實(shí)施，包括化學(xué)或機(jī)械手段。根據(jù)其一般知識和本文中教導(dǎo)，其他裂解方法 對于技術(shù)人員來說將是明顯的。在另一個(gè)備選方案中，可使用澄清的裂解物。澄清的裂解 物可通過將粗裂解物離心以使未裂解細(xì)胞和其他細(xì)胞殘片形成團(tuán)粒來制備。
[0242] 在一些實(shí)施方案中，提供基本純的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文中使用的，重組 細(xì)胞的"基本純的培養(yǎng)物"是其中低于約40% ( g卩，低于約：35% ;30% ;25% ;20% ;15% ; 10% ;5% ;2% ;1% ;0· 5% ;0· 25% ;0· 1% ;0· 01% ;0· 001% ;0· 0001% ;或甚至更低）的培 養(yǎng)物中活細(xì)胞總數(shù)是重組細(xì)胞（例如細(xì)菌、真菌（包括酵母）、支原體或原生動(dòng)物細(xì)胞）以 外的活細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語"約"在此背景中意指相關(guān)百分?jǐn)?shù)可以在所指示百分?jǐn)?shù)之 上或之下15%。如此，例如，約20%可以是17%到23%。這類重組細(xì)胞的培養(yǎng)物包含細(xì)胞 和生長、儲(chǔ)存或運(yùn)輸培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、半固體（例如凝膠狀介質(zhì)）或冷凍的。培 養(yǎng)物包括液體中或半固體培養(yǎng)基中/上生長或在儲(chǔ)存或運(yùn)輸培養(yǎng)基（包括冷凍儲(chǔ)存或運(yùn)輸 培養(yǎng)基）中儲(chǔ)存或運(yùn)輸?shù)募?xì)胞。培養(yǎng)物在培養(yǎng)容器或儲(chǔ)存容器或基質(zhì)中（例如培養(yǎng)皿、燒 瓶或管或儲(chǔ)存小瓶或管）。
[0243] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的重組細(xì)胞可從發(fā)酵工藝收獲，其通過常規(guī)方法如過 濾或離心，并在維持高活性的同時(shí)配制成干團(tuán)粒或干粉末配制物。用于產(chǎn)生展現(xiàn)出本文中 公開的一種或多種活性的干粉末全重組細(xì)胞組合物的工藝包括噴干、凍干、流化床干燥、真 空轉(zhuǎn)鼓干燥或團(tuán)聚等。所述組合物可以是貨架穩(wěn)定的、干生物催化劑組合物，其適用于本文 中描述的生物合成方法。干燥方法如凍干、流化床干燥或采用擠壓（extrusion)/球團(tuán)團(tuán)粒 化（spheronisation pelleting)繼之以流化床干燥的方法可尤其有用。這些工藝的溫度 可為<100°C，但通常<70°C以維持高殘余活性和立體選擇性。干粉末配制物應(yīng)具有0-10% w/w，通常2-5% w/w的水含量?？珊蟹€(wěn)定化添加劑如鹽（例如KC1)、糖、蛋白質(zhì)等以改進(jìn) 重組細(xì)胞在干燥過程期間的熱耐受性或改進(jìn)干燥屬性。
[0244] 在一些實(shí)施方案中，可代替重組宿主或重組或非重組細(xì)胞的裂解物，或與其組合 來使用部分或完全純化的酶。完全或部分純化的酶可以是本文所述任意重組細(xì)胞的或非重 組細(xì)胞的完全或部分純化的裂解物。純化方法是本領(lǐng)域中公知的。部分或完全純化具有的 優(yōu)點(diǎn)在于，感興趣的酶與可能干擾（通過也與底物反應(yīng)或通過將中間物或期望產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為 不想要的化合物）由該酶催化的反應(yīng)的其他細(xì)胞組分分開。純化確實(shí)向任何生物催化劑制 備加入了別的步驟，然而且因此并非在所有情況中均為合適的。對使用部分或完全純化的 酶的適宜性的確定將完全在遵循本文教導(dǎo)的技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
[0245] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中的一種或多種轉(zhuǎn)化將由生物催化劑在需氧條件 下進(jìn)行。在一個(gè)備選方案中，本發(fā)明方法中的一種或多種轉(zhuǎn)化將在厭氧條件下進(jìn)行。在一 個(gè)別的備選方案中，本發(fā)明方法中的一些步驟將在需氧條件下進(jìn)行而一些步驟將在厭氧條 件下進(jìn)行。
[0246] 2. 3全細(xì)胞生物催化劑的修飾
[0247] 本發(fā)明方法中使用的生物催化劑可以是未經(jīng)修飾的物種宿主細(xì)胞，其中天然存在 該酶。然而，通常需要遺傳修飾宿主細(xì)胞以產(chǎn)生非天然存在（即重組或工程化）的宿主細(xì) 胞。
[0248] 2. 4宿主細(xì)胞基因組的染色體修飾
[0249] 在一些實(shí)施方案中，已修飾了全細(xì)胞生物催化劑（即宿主細(xì)胞）的染色體。該修 飾可以是染色體中核酸的插入、缺失或取代。對細(xì)胞染色體引起修飾的方法是公知的，例如 轉(zhuǎn)座子誘變、Cre-Lox介導(dǎo)的重組、lambda Red和RecET介導(dǎo)的重組。
[0250] 穩(wěn)定整合到核酸染色體中是有利的，因?yàn)槠湓试S維持核酸而無需可選擇標(biāo)志物。
[0251] 通過實(shí)施重復(fù)插入，可以將許多不同核酸穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞生物催化劑的染色 體中。穩(wěn)定整合意指可將宿主細(xì)胞培養(yǎng)超過5代而不失去該改變。一般而言，穩(wěn)定的遺傳 改變包括持續(xù)超過10代的修飾，特別穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過約25代，且更特別穩(wěn)定的遺傳 修飾將超過50代（包括無限期）。
[0252] 2. 5對宿主細(xì)胞生物催化劑基因組的附加體修飾
[0253] 在一些實(shí)施方案中，修改宿主細(xì)胞基因組的附加體組成。附加體意指任何自主復(fù) 制元件，例如質(zhì)粒（可為線性或環(huán)狀）、粘粒、酵母人工染色體（YAC)等。附加體元件經(jīng)常對 其宿主細(xì)胞施加代謝負(fù)荷，且因此在缺乏確保附加體的至少一個(gè)拷貝在細(xì)胞分裂后存在于 每個(gè)子細(xì)胞的任何活性劃分機(jī)制的情況下，需要納入可選擇標(biāo)志。
[0254] 2. 6導(dǎo)入的核酸序列
[0255] 導(dǎo)入細(xì)胞的核酸可包含一種或多種（例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更 多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多 種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或 更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種、或甚至更多）的 許多元件。通常地，這些元件之一編碼用于產(chǎn)生雙官能或三官能C7鏈烷或這類分子前體的 酶。在一些備選方案中，該核酸編碼的蛋白質(zhì)并非是在本發(fā)明方法中發(fā)揮功能的酶。
[0256] 通常而言，啟動(dòng)子可操作地連接于核酸。啟動(dòng)子的選擇將取決于意圖的應(yīng)用，且可 容易地由技術(shù)人員確定。例如，如果酶催化的反應(yīng)可能對特定宿主細(xì)胞有害，那么可以期望 使用受調(diào)節(jié)的或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，從而使得基因表達(dá)可在需要時(shí)打開或關(guān)閉?；蛘?，可能優(yōu) 選的是使得表達(dá)受弱或強(qiáng)構(gòu)成性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)以確保該酶在生長的所有階段均表達(dá)。適用于 真核細(xì)胞系統(tǒng)的例示性啟動(dòng)子包括SV40早期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子、小鼠乳房 腫瘤病毒（MMTV)類固醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、和Moloney鼠白血病病毒（MMLV)啟動(dòng)子。例示性 酵母啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸酯激酶啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)啟動(dòng)子、半 乳糖激酶（GAL1)啟動(dòng)子、半乳糖差向異構(gòu)酶（galactoepimerase)啟動(dòng)子和醇脫氫酶（ADH) 啟動(dòng)子。酵母中的其他合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。適用于細(xì)菌細(xì)胞系統(tǒng)的 例示性啟動(dòng)子包括但不限于：T7、T3、SP6、lac和trp啟動(dòng)子。
[0257] 如果需要確保表達(dá)，那么導(dǎo)入的核酸還可以可操作地連接以如需要的包含5'不翻 譯區(qū)（UTR)、3'UTR、增強(qiáng)子和/或終止子區(qū)。這類元件將是技術(shù)人員已知的。
[0258] 2. 7多種酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)
[0259] 在一些實(shí)施方案中，使用單一菌株的宿主細(xì)胞來表達(dá)超過一種（例如2種或更多 種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、 9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多 種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種 或更多種、或甚至更多種）用在本發(fā)明方法中的酶。在此情況中，所述多種酶可由同一種導(dǎo) 入核酸編碼。在一個(gè)備選方案中，所述酶可編碼在分開的導(dǎo)入核酸片段上。酶可均從單個(gè) 啟動(dòng)子表達(dá)（例如通過將酶以操縱子的形式排布）。在一個(gè)備選方案中，酶可從多個(gè)分開 的啟動(dòng)子表達(dá)。在一些情況中，可通過相同化學(xué)物誘導(dǎo)多個(gè)分開的啟動(dòng)子（例如，多種酶中 每種可從酵母GAL啟動(dòng)子表達(dá)，如此意味著每個(gè)基因可用半乳糖誘導(dǎo)）。其他合適的啟動(dòng) 子是本領(lǐng)域中已知的。在一個(gè)備選方案中，編碼本發(fā)明方法中使用的酶的每個(gè)基因在不同 啟動(dòng)子的控制下。如此，可經(jīng)由不同誘導(dǎo)化合物的使用來分別誘導(dǎo)不同的酶。在另一個(gè)備 選方案中，使用折中辦法，其中許多酶在相同啟動(dòng)子的控制下，而許多酶在不同啟動(dòng)子的控 制下。當(dāng)已在宿主細(xì)胞中生成眾多酶途徑且期望協(xié)調(diào)途徑的其他成員來控制途徑的每個(gè)成 員，但分開控制每個(gè)途徑時(shí)，這一備選方案特別有利。
[0260] 可對多種酶是從染色體還是從質(zhì)粒表達(dá)進(jìn)行其他考慮。在其中從質(zhì)粒表達(dá)酶的情 況下，有利地，每種質(zhì)粒包含不同的起點(diǎn)和/或不同的可選擇標(biāo)志。
[0261] 多種酶在單一細(xì)胞中表達(dá)是有利的，因?yàn)槿绻脖磉_(dá)的酶在反應(yīng)途徑中彼此承接 直接作用，這確保上游酶反應(yīng)的產(chǎn)物立即可受下游酶的作用。這避免了以下需要：（i)中間 物的純化和第二反應(yīng)容器的設(shè)置以實(shí)施第二反應(yīng)；或（ii)將產(chǎn)物從包含上游酶的細(xì)胞運(yùn) 輸?shù)狡淇墒馨掠蚊傅募?xì)胞作用的培養(yǎng)基中。
[0262] 2. 8伴侶蛋白系統(tǒng)
[0263] 當(dāng)細(xì)胞已工程化為在非自然條件下（例如，當(dāng)某物種天然的蛋白質(zhì)以高于自然水 平的水平表達(dá)或者在一個(gè)備選方案中，當(dāng)來自不同物種的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)）表 達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，在一些情況下該蛋白將不會(huì)以活性形式表達(dá)。相反它會(huì)不正確地折疊并累積 為非功能性"包含體"聚集物。在此情況下，用于表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞可進(jìn)行遺傳修飾以進(jìn) 一步表達(dá)伴侶蛋白，其能夠阻止該蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，或者能夠?qū)⑵鋸木奂癄顟B(tài)重折疊。納 入這類伴侶蛋白是有利的，因?yàn)樗黾用考?xì)胞的活性蛋白質(zhì)的量，且因此增加本發(fā)明方法 的總體效率。所表達(dá)的伴侶蛋白可以是宿主細(xì)胞的伴侶蛋白。在一個(gè)備選方案中，伴侶蛋白 可來自與該蛋白質(zhì)相同的物種/菌株。典型的用于表達(dá)的伴侶蛋白包括GroEL/GroES家族 的成員和DnaJ/DnaK/GrpE家族的成員。原型大腸桿菌GroEL/GroES和DnaJ/DnaK/GrpE蛋 白的同源物已在其他原核物種中鑒定出來（參見例如），且真核同源物也是已知的（GroEL 和GroES分別對應(yīng)于真核蛋白Hsp60和HsplO,而DnaJ、DnaK和GrpE分別對應(yīng)于真核蛋白 Hsp70、HSp40和Hsp24)。這些蛋白質(zhì)已在許多酵母物種（例如釀酒酵母）中鑒定出來。用 于與用在本發(fā)明方法中的酶共表達(dá)的適宜伴侶蛋白的選擇對于遵循本文中教導(dǎo)的技術(shù)人 員來說將是明顯的。
[0264] 2. 9宿主細(xì)胞的代謝工程化
[0265] 代謝工程化是優(yōu)化宿主細(xì)胞中參數(shù)以增加細(xì)胞產(chǎn)生化合物能力的過程。任選地， 本發(fā)明方法中使用的宿主細(xì)胞已經(jīng)過工程化以優(yōu)化上文論述的雙官能C7鏈烷的輸出。
[0266] 增加細(xì)胞產(chǎn)生一種化合物能力的代謝工程化主要經(jīng)由兩種方法進(jìn)行。第一種是優(yōu) 化途徑中從起始材料產(chǎn)生期望產(chǎn)物的酶。在導(dǎo)致雙官能C7鏈烷產(chǎn)生的多酶途徑中（如附 圖所示和前面部分所述的），可以使用技術(shù)人員已知的技術(shù)（例如，二維電泳、使用同位素 標(biāo)記的前體、和核磁共振（NMR)光譜學(xué)）來測定途徑中每種中間物的濃度，并因此確定哪個(gè) 酶轉(zhuǎn)化是限速步驟，即反應(yīng)方案中的哪個(gè)步驟最慢。這可以通過觀察中間物的積累來確定， 中間物的積累指示作用于此中間物的酶在限制轉(zhuǎn)化的總體速率。在此情況中，因而應(yīng)增加 該中間物反應(yīng)的速率。這可通過多種手段進(jìn)行。首先，可提高限制性酶的表達(dá)水平。任選 地，這可以通過將編碼該酶的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子，例如T7啟動(dòng)子（如果該酶在大腸桿菌中 表達(dá)）或TEF啟動(dòng)子（如果該酶在酵母中表達(dá)）的控制下來實(shí)現(xiàn)。第二種選擇是提高編碼 存在于細(xì)胞的該酶的基因的拷貝數(shù)，例如通過將該基因置于多拷貝質(zhì)粒上，或通過將基因 的多拷貝納入宿主細(xì)胞的染色體中（這些拷貝可摻入染色體的同一位置或在染色體的不 同位置）。
[0267] 提高雙官能C7鏈烷的產(chǎn)生（如附圖中顯示和前述部分描述的）還可以通過使得 任一種能將底物、任意中間物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)向到并非本方法目標(biāo)的代謝途徑中的酶的活性失活 或降低。因此，可降低酶活性以增加雙官能C7鏈烷的產(chǎn)率。如此，在一些實(shí)施方案中，本文 中公開的重組宿主細(xì)胞可在能將本發(fā)明方法的起始材料或在產(chǎn)生雙官能C7鏈烷的反應(yīng)途 徑中產(chǎn)生的任意中間物轉(zhuǎn)向成不同的、不想要的終產(chǎn)物的一種或多種酶中具有缺陷（例如 通過缺失編碼感興趣酶的核酸或降低核酸的表達(dá)）。在一個(gè)備選方案中，所述酶未缺失，而 是改變?yōu)槭蛊湟缘陀谝吧兔傅乃俾首饔糜诘孜?、中間物或產(chǎn)物。在其中酶催化可逆反應(yīng) 的情況中，所述酶應(yīng)改變?yōu)槭蛊鋬H以期望的反應(yīng)方向作用。
[0268] 例如，在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞可在能將庚二酰-[acp]轉(zhuǎn)化成 7_酮-8-氨基壬酸（ΚΑΡΑ)或?qū)?-羧基己?；?C 〇A(庚二酰-CoA)轉(zhuǎn)化成ΚΑΡΑ的酶中具有 缺陷（例如BioF的缺失或失活，該基因編碼7-酮-8-氨基壬酸合成酶（E. C. 2. 3. 1. 47))。
[0269] 在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞可在二氨基庚二酸脫羧酶中具有缺陷，其創(chuàng)建 賴氨酸營養(yǎng)缺陷型。賴氨酸營養(yǎng)缺陷型對于D，L二氨基庚二酸（賴氨酸的中間前體）的碳 通量的去調(diào)節(jié)可尤其有用。賴氨酸營養(yǎng)缺陷型將需要補(bǔ)料分批發(fā)酵。
[0270] 2. 10生長的全細(xì)胞生物催化劑
[0271] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用在實(shí)施本發(fā)明方法中轉(zhuǎn)化時(shí)生長（即分裂）的 宿主細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在優(yōu)化期望雙官能C7鏈烷產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)。可 培養(yǎng)本文中所述的任一種重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生和/或分泌本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。如本文 中使用的，術(shù)語培養(yǎng)等同于發(fā)酵罐和生物反應(yīng)器。
[0272] 2. 10. 1 培養(yǎng)基
[0273] 在一些情況中，用于生長的碳源將以營養(yǎng)液，例如Luria培養(yǎng)基或酵母提取培養(yǎng) 基的形式提供。在其他情況中，可使用適于宿主細(xì)胞生長的限定培養(yǎng)基（即，其中每種組分 濃度已知的培養(yǎng)基）。在一個(gè)備選方案中，生長培養(yǎng)基包含葡萄糖作為碳源。在另一個(gè)備選 方案中，宿主細(xì)胞使用的培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。
[0274] 2. 10. 2多種菌株在相同培養(yǎng)物中的生長
[0275] 在一些實(shí)施方案中，催化本發(fā)明方法中轉(zhuǎn)化的酶存在于超過一種菌株/物種的細(xì) 胞中，其中同時(shí)使用那些超過一種菌株/物種的細(xì)胞。在其中當(dāng)實(shí)施本發(fā)明方法中的轉(zhuǎn)化 時(shí)多種菌株/物種在生長的情況中（即細(xì)胞在共培養(yǎng)），選擇的菌株/物種必須選擇為使得 一種菌株不與其他菌株競爭。這類關(guān)系可通過向共培養(yǎng)物引入人工共生獲得。即，使用的 兩種菌株/物種對于必要但是不同的養(yǎng)分各自為營養(yǎng)缺陷的。此外，其他菌株應(yīng)工程化為 產(chǎn)生過量的該養(yǎng)分，從而使得兩種菌株在培養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基不包含這兩種必要養(yǎng)分時(shí)能 在培養(yǎng)物中一起存活。適宜的營養(yǎng)缺陷體的選擇將完全在遵循本文教導(dǎo)的技術(shù)人員的能力 以內(nèi)。
[0276] 2. 10. 3 發(fā)酵
[0277] 本文所述培養(yǎng)條件可以擴(kuò)大規(guī)模并連續(xù)生長用于制備庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚 酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨 基庚醇或庚內(nèi)酰胺。例示性的生長規(guī)程包括，例如補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵 和連續(xù)分離，或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。所有這些工藝均為本領(lǐng)域中公知的。發(fā)酵規(guī)程對于 商業(yè)量的二和三官能C7鏈烷的生物合成產(chǎn)生尤其有用。一般地且如同非連續(xù)培養(yǎng)規(guī)程地， 前文描述的庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲 基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺的連續(xù)和/或接近連續(xù)產(chǎn)生包括 在充足的養(yǎng)分和培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)產(chǎn)生本文所述庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚 酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi) 酰胺的重組宿主細(xì)胞以維持和/或近乎維持指數(shù)期生長。在這類條件下的連續(xù)培養(yǎng)可包括 例如，1天、2、3、4、5、6或7天或更長。另外，連續(xù)培養(yǎng)可包括1周、2、3、4或5周或更長并長 達(dá)數(shù)個(gè)月?；蛘?，如果適合特定應(yīng)用的話，重組細(xì)胞可培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。應(yīng)理解連續(xù)和/或接近 連續(xù)培養(yǎng)條件還可包括在這些例示性時(shí)段之間的所有時(shí)間間期。還理解培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì) 胞的時(shí)間是用于產(chǎn)生針對期望目的充足量的產(chǎn)物的充足時(shí)間段。
[0278] 發(fā)酵規(guī)程是本領(lǐng)域中公知的。簡言之，用于生物合成產(chǎn)生前文所述庚烷-1，7-二 元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨 基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺的發(fā)酵可以例如，補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā) 酵和連續(xù)分離，或連續(xù)分離和連續(xù)發(fā)酵利用。分批和連續(xù)發(fā)酵規(guī)程的例子是本領(lǐng)域中公知 的。
[0279] 除了上文使用本文所述庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、 7_氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺生產(chǎn)者來連 續(xù)生產(chǎn)大量這些的發(fā)酵規(guī)程以外，庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、 7_氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺生產(chǎn)者還可 以例如，同時(shí)進(jìn)行別的規(guī)程以將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成其他化合物，或使產(chǎn)物可與發(fā)酵培養(yǎng)物分開并 序貫進(jìn)行化學(xué)或生物催化轉(zhuǎn)化以如期望的將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成其他化合物。
[0280] 2. 11本發(fā)明的組合物
[0281] 本發(fā)明還提供包含依照本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞以及庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚 酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨 基庚醇和庚內(nèi)酰胺的組合物。本發(fā)明還提供包含依照本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞和給料的組合 物。在一些實(shí)施方案中，所述給料是可再生給料，例如其中所述給料選自下組：葡萄糖、蔗 糖、木糖、脂肪酸和甘油。在一些實(shí)施方案中，所述給料是多芳香烴，例如苯、甲苯或莽草酸。
[0282] 3. 1實(shí)施例
[0283] 在一般性描述本發(fā)明后，通過對以下實(shí)施例的提述將會(huì)更容易地理解本發(fā)明，其 通過例示提供且不意圖為限制的。理解可對本文中公開的例示性實(shí)施方案進(jìn)行各種修改和 變化，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
[0284] 3. 1. 1通過氨裂合酶（EC 4. 3. 1. _)的2, 6-二氨基庚二酸酯到2-氨基-5, 6-脫 氫庚二酸（6-氨基-2-庚烯二元酸）和2-氨基庚二酸到2-庚烯二元酸的轉(zhuǎn)化（見圖10)
[0285] 3. 1. 1. 1詵擇MAL酶某閔靶物
[0286] 在鑒定了涉及2, 6-二氨基庚二酸到庚二酸（其用于產(chǎn)生尼龍7, 7)的轉(zhuǎn)化和庚 二酸到7-氨基庚酸的轉(zhuǎn)化的途徑后，選擇來自這些途徑的基因靶物。具體地，選擇來自 包括甲基天冬氨酸氨裂合酶（MAL ;EC 4. 3. 1. 2)在內(nèi)的氨裂合酶家族（EC 4. 3. 1)的酶靶 物，該選擇基于其廣泛底物特異性、在一大批宿主中的存在、被克隆和外源表達(dá)的能力和 用于合理設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程的可用晶體結(jié)構(gòu)。選擇來自無丙二酸梓檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus)、假破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetanomorphum)和米曲霉的 MAL 基因。由 無丙二酸檸檬酸桿菌（GeneBank AB005294 ;片段 1641-2882878596. · 879060NM_NM)和假破 傷風(fēng)梭菌（GeneBank S48141 ;片段756-1997)編碼的MAL酶具有顯著的相異性（57%同一 性）。米曲霉MAL基因 （GeneBank XM 001827609)是進(jìn)化趨異的（與無丙二酸檸檬酸桿菌 MAL 44%同一性，與假破傷風(fēng)梭菌MAL 39%同一性），其可顯示不同的催化特性和/或選擇 性。另一種不尋常的氨裂合酶（其為用于2, 6-二氨基庚二酸酯和2-氨基庚二酸的還原性 脫氨基化的潛在酶的）是來自突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)的D-葡糖氨酸 氨裂合酶（EC 4. 3. 1. 9)(登錄號BAD69624)。這是一種催化α，β -消除的不尋常的氨裂合 酶：
[0287] D-葡糖氨酸一 >2-脫氫-3-脫氧-D-葡糖酸+ΝΗ3
[0288]
【權(quán)利要求】
1. 一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自2, 6二氨基庚二酸鹽 (2, 6diaminopimelate, 2, 6DAP)和 α -氨基-庚二酸鹽（a -amino-pimelate, AAP)的化合 物與催化 2, 6DAP 到 6-氨基 _2_ 庚烯二酸（6-amin〇-2_heptenedioic acid, 6A2HA)的還原 性脫氨基化或AAP到2-庚烯二酸（2-heptene dioic acid，2HDA)的還原性脫氨基化的酶 接觸，其中產(chǎn)生6A2HA或2HDA。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是2, 6DAP。
3. 權(quán)利要求2的方法，其還包括使所述6A2HA與催化6A2HA到AAP的烯酸還原的酶接 觸，其中產(chǎn)生AAP。
4. 權(quán)利要求3的方法，其還包括使所述AAP與催化AAP到2HDA的還原性脫氨基化的酶 接觸，其中產(chǎn)生2HDA。
5. 權(quán)利要求4的方法，其還包括使所述2HDA與催化2HDA到庚二酸（pimelic acid，PA) 的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
6. 權(quán)利要求5的方法，其還包括使所述PA與催化PA到庚二酸半醒（pimelic acid semialdehyde，PAS)的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
7. 權(quán)利要求6的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7-氨基-庚酸 (7-amino-heptanoic acid，7AHA)的半醒氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
8. 權(quán)利要求7的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到庚內(nèi)酰胺 (enantholactam，ENTL)的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
9. 權(quán)利要求7的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7-氨基-庚醛 (7-amino-h印tanal，7AHT)的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生AHT。
10. 權(quán)利要求9的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7-二氨基庚烷（1，7-diaminoh印tane，1，7DAH)的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
11. 權(quán)利要求4的方法，其還包括使所述2HDA與催化輔酶A(CoA)到2HAD的轉(zhuǎn)移以產(chǎn) 生 2-庚烯二酸-CoA(2-h印tene diacid-CoA, 2HDA-CoA)的酶接觸，其中產(chǎn)生 2HDA-CoA。
12. 權(quán)利要求11的方法，其還包括使所述2HDA-C〇A與催化2HDA-C〇A到庚二 酰-CoA(pimeloyl-CoA，PCoA)的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PCoA。
13. 權(quán)利要求12的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生PA。
14. 權(quán)利要求13的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
15. 權(quán)利要求14的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHA。
16. 權(quán)利要求15的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
17. 權(quán)利要求15的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
18. 權(quán)利要求17的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
19. 權(quán)利要求4的方法，其還包括使所述AAP與催化氨基基團(tuán)到AAP的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 α-酮-庚二酸鹽（a-ket〇-pimelate，AKP)的酶接觸，其中產(chǎn)生AKP。
20. 權(quán)利要求19的方法，其還包括使所述AKP與催化AKP到α-羥基-庚二酸鹽 (a -hydroxy-pimelate, ΑΗΡ)的酮還原的一種或多種酶接觸，其中產(chǎn)生ΑΗΡ。
21. 權(quán)利要求20的方法，其還包括使所述ΑΗΡ與催化CoA到ΑΗΡ的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α -羥 基-庚二酸鹽 _CoA( a -hydroxy-pimelate-CoA, AHP-CoA)的酶接觸，其中產(chǎn)生 AHP-CoA。
22. 權(quán)利要求21的方法，其還包括使所述AHP-CoA與催化AHP-CoA到2HDA-C〇A的脫水 的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA-CoA。
23. 權(quán)利要求22的方法，其還包括使所述2HDA-CoA與催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸還 原的酶接觸，其中產(chǎn)生PCoA。
24. 權(quán)利要求23的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生PA。
25. 權(quán)利要求24的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
26. 權(quán)利要求25的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHA。
27. 權(quán)利要求26的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
28. 權(quán)利要求26的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
29. 權(quán)利要求28的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
30. 權(quán)利要求20的方法，其還包括使所述ΑΗΡ與催化ΑΗΡ到2HDA的脫水的酶接觸，其 中產(chǎn)生2HDA。
31. 權(quán)利要求30的方法，其還包括使所述2HDA與催化2HDA到庚二酸（ΡΑ)的烯酸還原 的酶接觸，其中產(chǎn)生ΡΑ。
32. 權(quán)利要求31的方法，其還包括使所述ΡΑ與催化ΡΑ到PAS的羧酸還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
33. 權(quán)利要求32的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
34. 權(quán)利要求33的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
35. 權(quán)利要求33的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΤ。
36. 權(quán)利要求35的方法，其還包括使所述7ΑΗΤ與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
37. 權(quán)利要求30的方法，其還包括使所述2HDA與催化CoA到2HAD的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 2HDA-CoA的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA-CoA。
38. 權(quán)利要求37的方法，其還包括使所述2HDA-CoA與催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸還 原的酶接觸，其中產(chǎn)生PCoA。
39. 權(quán)利要求38的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生PA。
40. 權(quán)利要求39的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
41. 權(quán)利要求40的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHA。
42. 權(quán)利要求41的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
43. 權(quán)利要求41的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
44. 權(quán)利要求43的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
45. 權(quán)利要求19的方法，其還包括使所述AKP與催化AKP到α-酮-辛二酸鹽 (a-keto_suberate，AKS)的α-酮酸鏈延伸的酶接觸，其中產(chǎn)生AKS。
46. 權(quán)利要求45的方法，其還包括使所述AKS與催化氨基基團(tuán)到AKS的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 α-氨基辛二酸鹽（a-amino suberate，AAS)的酶接觸，其中產(chǎn)生AAS。
47. 權(quán)利要求46的方法，其還包括使所述AAS與催化AAS到7AHA的α -氨基酸脫羧化 的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
48. 權(quán)利要求47的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
49. 權(quán)利要求47的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΤ。
50. 權(quán)利要求49的方法，其還包括使所述7ΑΗΤ與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
51. 權(quán)利要求45的方法，其還包括使所述AKS與催化AKS到PAS的α -酮酸脫羧化的 酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
52. 權(quán)利要求51的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
53. 權(quán)利要求52的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
54. 權(quán)利要求52的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
55. 權(quán)利要求54的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
56. 權(quán)利要求23的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
57. 權(quán)利要求56的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHA。
58. 權(quán)利要求57的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
59. 權(quán)利要求57的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
60. 權(quán)利要求59的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
61. 權(quán)利要求38的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
62. 權(quán)利要求61的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHA。
63. 權(quán)利要求62的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
64. 權(quán)利要求62的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
65. 權(quán)利要求64的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
66. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自6A2HA和2HDA的化合物與催化 6A2HA到AAP的烯酸還原或2HDA到PA的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生AAP或PA。
67. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自PCoA和庚二酰[acp] (PACP)的化合 物與催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
68. 權(quán)利要求67的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其 中產(chǎn)生PAS。
69. 權(quán)利要求68的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHA。
70. 權(quán)利要求69的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接 觸，其中產(chǎn)生ENTL。
71. 權(quán)利要求69的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接 觸，其中產(chǎn)生7AHT。
72. 權(quán)利要求71的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生 1，7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
73. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使AKP與催化AKP到ΑΗΡ的酮還原的一種或 多種酶接觸，其中產(chǎn)生ΑΗΡ。
74. 權(quán)利要求73的方法，其中所述AKP通過α -酮己二酸或α -酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn) 生。
75. 權(quán)利要求73的方法，其進(jìn)一步包括將ΑΗΡ轉(zhuǎn)化成ΡΑ或PcoA。
76. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括通過α -酮酸鏈延伸將AKP轉(zhuǎn)化為AKS。
77. 權(quán)利要求76的方法，其中所述AKP通過α-酮己二酸或α-酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn) 生。
78. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使所述PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基 化的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
79. 權(quán)利要求78的方法，其中通過從2, 6DAP、AKG、PCoA或PACP的轉(zhuǎn)化獲得所述PAS。
80. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自PCoA和PACP的化合物與催化該化合 物到PAS還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
81. -種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使PAS與催化PAS到7-羥基-庚酸（7HHA) 的醇脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7HHA。
82. 權(quán)利要求1-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶、或一種或多種酶是純化的酶。
83. 權(quán)利要求1-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶、或一種或多種酶在細(xì)胞裂解物或部 分純化的細(xì)胞裂解物中。
84. 權(quán)利要求1-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶、或一種或多種酶在重組表達(dá)其的細(xì) 胞中。
85. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酶包含氨裂合酶。
86. 權(quán)利要求85的方法，其中所述氨裂合酶是EC 4. 3. 1中的氨裂合酶。
87. 權(quán)利要求86的方法，其中所述EC 4. 3.1中的氨裂合酶包括EC 4. 3. 1.1 ;EC 4. 3. 1. 2 ;EC 4. 3. 1. 3 ;EC 4. 3. 1. 9 ;EC 4. 3. 1. 12 ;EC 4. 3. 1. 13 ;EC 4. 3. 1. 23 ;或 EC 4. 3. 1. 24。
88. 權(quán)利要求3、5、12、23、31、38和66中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括烯酸還原酶。
89. 權(quán)利要求88的方法，其中所述烯酸還原酶包括EC 1.3. 1中的烯酸還原酶。
90. 權(quán)利要求88的方法，其中所述烯酸還原酶為： (a) 在 EC 1. 3. 1 中，且包括 EC 1. 3. 1. 8 ;EC 1. 3. 1. 9 ;EC 1. 3. 1. 10、EC 1. 3. 1. 31 ;EC 1.3.1. 38 ;EC 1.3.1. 39 ;EC 1.3.1. 44;或 EC 1.3.1. 62 中的庚二酰-CoA 脫氫酶如 PimC/ PimD 或 ThnJ/ThnK ;或 (b) 在 EC 1.3 中，如 EC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10;或 Syntrophus aciditrophicus 2, 3-二脫氫庚二酰-CoA還原酶及其同源物。
91. 權(quán)利要求6、14、25、32、40和68中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括羧酸還原酶或 NAD依賴性非酰化醛脫氫酶。
92. 權(quán)利要求91的方法，其中所述羧酸還原酶包括EC 1. 2. 99中的羧酸還原酶或NAD 依賴性非?；衙摎涿溉缜拾贝紗伟鷮伲⊿hingomonas)或貪銅菌屬（Cupriavidus)物種 中的ThnG。
93. 權(quán)利要求92的方法，其中所述EC 1.2. 99中的羧酸還原酶包括EC1. 2. 99. 6,且所 述NAD依賴性非?；衙摎涿甘乔拾贝紗伟鷮伲⊿phingomonas)中的ThnG。
94. 權(quán)利要求7、15、26、33、52、57、62、69和78中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括(〇-轉(zhuǎn) 氨酶。
95. 權(quán)利要求94的方法，其中所述ω轉(zhuǎn)氨酶包括EC 2.6. 1中的轉(zhuǎn)氨酶。
96. 權(quán)利要求95的方法，其中所述EC 2.6. 1中的ω轉(zhuǎn)氨酶包括EC 2.6. 1. 18 ;EC 2. 6. 1. 19 ；EC 2. 6. 1. 11 ；EC 2. 6. 1. 13 ；EC 2. 6. 1. 39, EC 2. 6. 1. 48, EC 2. 6. 1. 62〇
97. 權(quán)利要求13、24、39、56、61和67中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包含硫酯酶、酸-硫 醇連接酶或CoA轉(zhuǎn)移酶。
98. 權(quán)利要求97的方法，其中所述硫酯酶包含EC 3. 1. 2中的硫酯酶。
99. 權(quán)利要求98的方法，其中所述EC 3. 1. 2中的硫酯酶包括： 作用于CoA-硫酯的硫酯酶，其來自EC 3. L 2· 18 ;EC 3. L 2· 19 ;或EC3. L 2· 20 ; YciA、tesB或Acotl3的基因產(chǎn)物；或 作用于[acp]_硫酯的硫酯酶，其來自EC 3· 1·2· 14和EC 3· 1.2.21。
100. 權(quán)利要求97的方法，其中所述酸-硫醇連接酶包括EC 6. 2. 1中的酸-硫醇連接 酶。
101. 權(quán)利要求100的方法，其中所述EC 6. 2.1中的酸-硫醇連接酶包括來自EC 6. 2.1. 3 ;EC 6. 2.1.5 ;EC 6. 2. 1.14;或 EC 6. 2. 1.23 的作用于 CoA 酯的 CoA 合成酶和 EC 6. 2. 1. 14(如 BioW)和 EC 6. 2. 1. 20 中的?；?[acp]_ 合成酶。
102. 權(quán)利要求97的方法，其中所述CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC 2. 8. 3中的CoA轉(zhuǎn)移酶。
103. 權(quán)利要求102的方法，其中所述EC 2. 8. 3中的CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2. 8. 3. 12 ;EC 2. 8. 3. 13 或 EC 2. 8. 3. 14 或 ThnH 的基因產(chǎn)物。
104. 權(quán)利要求10、18、19、29、36、44、46、50、60、65和72中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包 括氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶或脫氨基脫氫酶。
105. 權(quán)利要求104的方法，其中所述氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶包含EC 2. 6. 1中的氨基轉(zhuǎn)移 酶。
106. 權(quán)利要求105的方法，其中所述EC 2.6. 1中的氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶包括EC 2. 6. 1. 21 ;EC 2. 6. 1. 39 ;EC 2. 6. 1. 42 ;或 EC 2. 6. 1. 67。
107. 權(quán)利要求20或73的方法，其中所述一種或多種酶包括羰基還原酶。
108. 權(quán)利要求107的方法，其中所述羰基還原酶包括EC. 1. 1. 1. 184、EC1. 1. 1. 79、EC 1. L L B3 ;EC L L L B4 ;或來自EC L L 99. 2.或EC L L 99. 6的2-羥基戊二酰脫氫酶/ α酮戊二酸還原酶。
109. 權(quán)利要求47或51的方法，其中所述酶包括α-酮酸脫羧酶或乙酰乳酸合酶。
110. 權(quán)利要求56、61、或80的方法，其中所述酶包括脂肪-?；?CoA還原酶或脂 肪-酰基-[acp]還原酶或醛脫氫酶。
111. 權(quán)利要求110的方法，其中所述脂肪-?；?CoA還原酶、脂肪-?；?[acp]還原 酶或醛脫氫酶是EC 1. 2. 1中的還原酶。
112. 權(quán)利要求111的方法，其中所述EC 1.2. 1中的脂肪-?；?CoA還原酶、脂肪-酰 基-[acp]還原酶或醛脫氫酶包括 EC L2.L3;EC L2.L4;EC L2.L20;EC L2.L22; EC 1· 2· 1· 50 ;EC 1· 2· 1· 57 ;EC 1· 2· 1· 63 ;或 EC 1· 2· 1· 76。
113. 權(quán)利要求9、15、28、35、43、49、55、59、64和71中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括醛 脫氫酶、羧酸還原酶或非?；┟摎涿?。
114. 權(quán)利要求113的方法，其中所述醛脫氫酶包括EC 1.2. 1，所述羧酸還原酶或非酰 化醛脫氫酶包括EC 1. 2. 99中的羧酸還原酶或非?；┟摎涿溉鏣hnG。
115. 權(quán)利要求114的方法，其中所述EC 1.2. 1中的醛脫氫酶包括EC1. 2. 1.3、EC 1. 2. 1. 4或EC 1. 2. 1. 63,所述羧酸還原酶包括EC 1. 2. 99. 6 ;且所述非?；┟摎涿赴?來自鞘氨醇單胞菌屬或貪銅菌屬物種的ThnG。
116. 權(quán)利要求11、21和37中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括CoA轉(zhuǎn)移酶或酸-硫醇連 接酶。
117. 權(quán)利要求116的方法，其中所述CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC 2. 8. 3中的CoA轉(zhuǎn)移酶，且所 述酸-硫醇連接酶包括EC 6. 2. 1。
118. 權(quán)利要求117的方法，其中所述EC 2. 8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2. 8. 3.12 ;EC 2. 8. 3. 13或EC 2. 8. 3. 14或ThnH的基因產(chǎn)物，且所述EC 6. 2. 1中的酸-硫醇連接酶包括 EC 6. 2. 1. 3 ;EC 6. 2. 1. 5 ;EC 6. 2. 1. 14 ;和 EC 6. 2. 1. 23。
119. 權(quán)利要求8、16、27、34、42、48、53、58、63和70中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶是EC 3. 5. 2如3. 5. 2. 11中的氨基水解酶。
120. 權(quán)利要求22或30的方法，其中所述酶包括水裂合酶。
121. 權(quán)利要求120的方法，其中所述水裂合酶包括EC 4. 2. 1中的水裂合酶。
122. 權(quán)利要求121的方法，其中所述EC 4. 2. 1中的水裂合酶包括EC4. 2. 1. 2 ;EC 4. 2. 1. 59 ;4· 2. 1. 61 ;4· 1. 2. 17 或 4. 1. 2. 18。
123. 權(quán)利要求45、74、76和77中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-酮酸鏈延伸由包含以下 的一組或多組酶催化：AksA、AksD、AksE和AksF。
124. 權(quán)利要求123的方法，其中所述AksA包括EC 2. 3. 3中的AksA酶。
125. 權(quán)利要求124的方法，其中所述EC 2. 3.3中的AksA酶包括EC2. 3. 3. 13或 2. 3. 3. 14。
126. 權(quán)利要求123的方法，其中所述AksD和Aks E均包括EC 4. 2. 1. 114中的AksD/E 酶。
127. 權(quán)利要求123的方法，其中所述AksD包括EC 4. 2. 1.114中的酶，而Aks E包括 EC 4. 2. L 36 中的酶。
128. 權(quán)利要求123的方法，其中所述AksF包括EC 1. 1. 1中的AksF酶。
129. 權(quán)利要求128的方法，其中所述EC 1.1. 1.中的AksF酶包括EC1. 1.1.87。
130. 權(quán)利要求45、74、76和77中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種α -酮酸鏈延伸 酶來自產(chǎn)甲烷的細(xì)菌。
131. 權(quán)利要求81的方法，其中所述酶包括醇脫氫酶或醛還原酶。
132. 權(quán)利要求131的方法，其中所述醇脫氫酶包括EC. 1.1. 1.1、EC 1.1. 1.2或EC 1. 1. 1. 21。
133. 權(quán)利要求131的方法，其中所述醇脫氫酶選自來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)的丁醇脫氧酶、酵母屬（Saccharomyces)ADHIV、和來自釀酒酵母 (S.cerevisiae)的 ADH6。
134. 權(quán)利要求67或80的方法，其中所述PCoA或PACP源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA。
135. 權(quán)利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自可再生給料，其包含纖維素給料、 糖、甘油或脂肪酸。
136. 權(quán)利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自合成氣（SynGas)、甲烷或甲醇。
137. 權(quán)利要求134的方法，其中所述苯甲酰-CoA源自多環(huán)芳香烴。
138. 權(quán)利要求1、2和79中任一項(xiàng)的方法，其中所述2, 6DAP由缺少二氨基庚二酸脫羧 酶的產(chǎn)賴氨酸生物體產(chǎn)生。
139. 權(quán)利要求1、2、79和138中任一項(xiàng)的方法，其中所述2, 6DAP源自可再生給料。
140. 權(quán)利要求139的方法，其中所述可再生給料包括糖。
141. 一種生物衍生的尼龍-7、尼龍-7, x或尼龍-X, 7。
142. 由包括聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍-7,其中所述7AHA源自PAS或AAS。
143. 由包括聚合PA和1，7DHA的工藝產(chǎn)生的尼龍-7, 7,其中所述PA源自PCoA ;PACP ; 或 2HDA 而 1，7DHA 源自 7AHA。
144. 由包括聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍-7,所述7AHA由包括以下方法步驟的方法制 備： ⑴權(quán)利要求2-7 ; (ii) 權(quán)利要求2-4和11-15 ; (iii) 權(quán)利要求2-4和19-26 ; (iv) 權(quán)利要求 2-4、19-20 和 30-33 ; (v) 權(quán)利要求 2-4、19-20、30 和 37-41 ; (vi) 權(quán)利要求 2-4、19 和 45-47 ; (vii) 權(quán)利要求 2-4、19、45 和 51-52 ; (viii) 權(quán)利要求 2-4、19-23 和 56-57 ; (ix) 權(quán)利要求 2-4、19-20、30、37-38 和 61-62 ; (X)權(quán)利要求67-69 ; (xi) 權(quán)利要求73-75 ; (xii) 權(quán)利要求76-77 ; (xiii) 權(quán)利要求78-79 ;或 (xiv) 權(quán)利要求80。
145. 由包括聚合1，7DHA和PA的工藝產(chǎn)生的尼龍7, 7,其中1，7DHA由包括以下方法步 驟的方法制備： (a) 權(quán)利要求2-7和9-10 ; (b) 權(quán)利要求 2-4、11-15 和 17-18 ; (c) 權(quán)利要求 2-4、19-26 和 28-29 ; (d) 權(quán)利要求 2-4、19_2〇、3〇-33 和 35_36 ; (e) 權(quán)利要求 2-4、19-20、37-41 和 43-44 ; (f) 權(quán)利要求 2-4、19、45-47 和 49-50 ; (g) 權(quán)利要求 2-4、19、45、51-52 和 54-55 ; (h) 權(quán)利要求 2-4、19-23 和 56-60 ; (i) 權(quán)利要求 2-4、19-20、37-38 和 61-65 ; (j) 權(quán)利要求67-69和71-72 ; (k) 權(quán)利要求73-75 ; (l) 權(quán)利要求76-77 ; (m) 權(quán)利要求78-79 ;或 (η)權(quán)利要求80,且 其中ΡΑ由包括以下方法步驟的方法制備： (〇)權(quán)利要求2-5 ; (Ρ)權(quán)利要求2-4和11-13 ; (q) 權(quán)利要求2-4和19-24 ; (r) 權(quán)利要求 2-4、19-20 和 30-31 ; (s) 權(quán)利要求 2-4、19-20、30 和 37-39 ; (t) 權(quán)利要求67 ;或 (u) 權(quán)利要求73-75。
146. -種基本純的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，大量所述宿主細(xì)胞包含一種或多種外源核酸， 該外源核酸編碼一種或多種酶，該酶涉及選自下組的一種或多種聚合物單體的生物合 成：7AHA ;PA;1，7DAH;ENTL ;和7HHA，其中所述酶選自下組：氨裂合酶、烯酸還原酶、羧 酸還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、硫酯酶、酸-硫醇連接酶或CoA合成酶（synthtase)、CoA轉(zhuǎn)移 酶、酰基-[acp]硫酯酶、?；鵢[acp]合成酶、氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、脫氨基脫氫酶、羰基還 原酶、α-酮酸脫羧酶、乙酰乳酸合酶、α-氨基酸脫羧酶、脂肪-?；?CoA還原酶、酰 基-[acp]_還原酶、醛脫氫酶、醛氧化酶、酰胺水解酶、水裂合酶、和催化α -酮酸鏈延伸的 酶。
147. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
148. 權(quán)利要求147的培養(yǎng)物，其中所述原核細(xì)胞選自下組：埃希氏菌屬（Escherichia) 如物種大腸桿菌（Escherichia coli);梭菌屬（Clostridia)如物種楊氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)、自產(chǎn)乙酉享梭菌（Clostridium autoethanogenum)或克氏 梭菌（Clostridium kluyveri);棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如物種谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum);貪銅菌屬如物種鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator)或 耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metallidurans);假單胞菌屬（Pseudomonas)如物種突光假 單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)或食油假單胞 菌（Pseudomonas oleavorans);代爾夫特菌屬（Delftia)如物種食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans);芽抱桿菌屬（Bacillus)如物種枯草芽抱桿菌（Bacillus subtillis);乳桿 菌屬（Lactobacillus)如物種德氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii);和乳球菌屬 (Lactococcus)如物種乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)。
149. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
150. 權(quán)利要求149的培養(yǎng)物，其中所述真核細(xì)胞選自下組：曲霉屬（Aspergillus) 如物種黑曲霉（Aspergillus niger);酵母屬（Saccharomyces)如物種釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae);假絲酵母屬（Candida)如物種熱帶假絲酵母 (C. tropicalis)、白色假絲酵母（C. albicans)、C. cloacae、C. guillermondii、中型假絲 酵母（C. intermedia)、麥芽糖假絲酵母（C.maltosa)、近平滑假絲酵母（C.parapsilosis) 或C. zeylenoides;畢赤酵母屬（Pichia)如物種巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris); 耶氏酵母屬（Yarrowia)如物種解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica);伊薩酵母 屬（Issatchenka)如物種東方伊薩酵母（Issathenkia orientalis);德巴利酵母 屬（Debaryomyces)如物種漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii) ;Arxula 屬 如物種Arxula adenoinivorans ;克魯維酵母屬（Kluyveromyces)如物種乳酸克魯 維酵母（Kluyveromyces lactis);外瓶霉屬（Exophiala);毛霉屬（Mucor);木霉屬 (Trichoderma);枝抱屬（Cladosporium);平革菌屬（Phanerochaete) ;Cladophialophora 屬；擬青霉屬（Paecilomyces) ;Scedosporium 屬和 Ophiostoma 屬。
151. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述氨裂合酶包括EC 4. 3. 1中的氨裂合酶。
152. 權(quán)利要求151的培養(yǎng)物，其中所述EC 4.3. 1中的氨裂合酶包括EC4. 3. 1. 1 ; EC 4. 3. 1. 2 ；EC 4. 3. 1. 3 ；EC 4. 3. 1. 9 ；EC 4. 3. 1. 12 ；EC 4. 3. 1. 13 ；EC4. 1. 3. 14 ；EC 4. L 3. 23 或 EC 4. 3. L 24。
153. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述烯酸還原酶包括EC 1. 3. 1中的烯酸還原酶。
154. 權(quán)利要求153的培養(yǎng)物，其中所述烯酸還原酶為： (a) 在 EC 1. 3. 1 中，且包括 EC 1. 3. 1. 8 ;EC 1. 3. 1. 9 ;EC 1. 3. 1. 10、EC 1. 3. 1. 31 ;EC 1.3.L38;EC L3.L39;EC L3.L44;或 EC L3.L62 中的庚二酰-CoA 脫氫酶如 PimC/ PimD 或 ThnJ/ThnK ;或 (b) 在 EC 1.3 中，如 EC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10;或 Syntrophus aciditrophicus 2, 3-二脫氫庚二酰-CoA還原酶及其同源物。
155. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述羧酸還原酶包括EC 1. 2. 99中的羧酸還原酶或 非?；┟摎涿?。
156. 權(quán)利要求155的培養(yǎng)物，其中所述EC 1. 2. 99中的羧酸還原酶包括EC1. 2. 99. 6， 且所述非酰化醒脫氫酶包括來自鞘氨醇單胞菌屬中的Spingomonas和貪銅菌屬 (Cupriavidus)物種的ThnG或其同源物。
157. 權(quán)利要求156的培養(yǎng)物，其中所述ω-轉(zhuǎn)氨酶包括EC 2.6. 1中的轉(zhuǎn)氨酶。
158. 權(quán)利要求157的培養(yǎng)物，其中所述EC 2.6. 1中的ω-轉(zhuǎn)氨酶包括EC2. 6. 1. 18 ; EC 2. 6. 1. 19 ;EC 2. 6. 1. 1 ;EC 2. 6. 1. 13 ;EC 2. 6. 1. 39EC 2. 6. 1. 48 ;EC2. 6. 1. 48 ;或 EC 2. 6. 1. 62。
159. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述硫酯酶包括EC 3. 1. 2中的硫酯酶。
160. 權(quán)利要求159的培養(yǎng)物，其中所述EC 3. 1. 2中的硫酯酶包括來自EC3. 1. 2. 18 ;EC 3. 1. 2. 19 ;或EC 3. 1. 2. 20的作用于CoA硫酯的硫酯酶；YciA、tesB或Acotl3的基因產(chǎn)物； 或來自EC 3. 1. 2. 14和EC 3. 1. 2. 21的作用于[acp]_硫酯的硫酯酶。
161. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述酸-硫醇連接酶包括EC 6. 2. 1中的酸-硫醇連 接酶。
162. 權(quán)利要求161的培養(yǎng)物，其中所述EC 6. 2.1中的酸-硫醇連接酶包括來自EC 6.2. L 3 ;EC 6.2. L 14;或 EC 6.2. L 23 的作用于 CoA 酯的 CoA 合成酶和 EC 6.2. L 14 (如 BioW)和EC 6. 2. L 20中的?；?[acp]-合成酶。
163. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC 2. 8. 3中的CoA轉(zhuǎn)移酶，或 ThnH的基因產(chǎn)物及其同源物。
164. 權(quán)利要求163的培養(yǎng)物，其中所述EC 2. 8. 3中的CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2. 8. 3. 12 ;EC 2. 8. 3. 13 ;EC 2. 8. 3. 14 ;或 ThnH 的基因產(chǎn)物。
165. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶包括EC 2.6. 1中的氨基轉(zhuǎn)移 酶。
166. 權(quán)利要求165的培養(yǎng)物，其中所述EC 2.6. 1中的氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶包括EC 2. 6. 1. 21 ;EC 2. 6. 1. 39 ;EC 2. 6. 1. 42 ;或 EC 2. 6. 1. 67。
167. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述羰基還原酶包括EC. 1. 1. 1. 184 ;EC1. 1. 1. 79 ; EC L L L B3 ;EC L L L B4或來自EC L L 99. 2.或EC L L 99. 6的2-羥基戊二酰脫氫酶 /α酮戊二酸還原酶。
168. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述脂肪-酰基-CoA還原酶、脂肪-酰基-[acp]還 原酶或醛脫氫酶包括EC 1. 2. 1中的還原酶。
169. 權(quán)利要求168的培養(yǎng)物，其中所述EC 1.2. 1中的脂肪-?；?CoA還原酶、 脂肪-?；?[acp]還原酶或醛脫氫酶包括EC 1.2. 1.3 ;EC 1.2. 1.4 ;EC1. 2. 1.20 ;EC 1· 2· 1· 22 ;EC 1· 2· 1· 50 ;EC 1· 2· 1· 57 ;EC 1· 2· 1· 63 ;或 EC 1· 2· 1· 76。
170. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述醛脫氫酶包括EC 1.2. 1中的醛脫氫酶。
171. 權(quán)利要求170的培養(yǎng)物，其中所述EC 1.2. 1中的醛脫氫酶包括EC1. 2.1.3 ;EC 1. 2. 1. 4 或 EC 1. 2. 1. 63。
172. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述水裂合酶包括EC 4. 2. 1中的水裂合酶。
173. 權(quán)利要求172的培養(yǎng)物，其中所述EC 4. 2. 1中的水裂合酶包括EC4. 2. 1. 2 ;EC 4. 2. 1. 59 ;EC 4. 2. 1. 61 ;EC 4. 1. 2. 17 或 EC 4. 1. 2. 18。
174. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述催化α-酮酸鏈延伸的酶包括選自包含以下的 酶組中的一種或多種酶：AksA、AksD、AksE和AksF酶。
175. 權(quán)利要求174的培養(yǎng)物，其中所述AksA包括EC 2. 3. 3中的AksA酶。
176. 權(quán)利要求175的培養(yǎng)物，其中所述EC 2. 3. 3中的AksA酶包括EC2. 3. 3. 13或EC 2. 3. 3. 14。
177. 權(quán)利要求174的培養(yǎng)物，其中所述AksD和Aks E均包括EC 4. 2. 1. 114中的AksD/ E酶。
178. 權(quán)利要求177的培養(yǎng)物，其中所述EC 4. 2. 1中的AksD酶包括EC4. 2. 1. 36。
179. 權(quán)利要求174的培養(yǎng)物，其中所述AksF包括EC 1. 1. 1中的AksF酶。
180. 權(quán)利要求179的培養(yǎng)物，其中所述EC 1. 1. 1.中的AksF酶包括EC1. 1. 1.87。
181. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述醇脫氫酶包括EC. 1. 1. 1. 1或EC1. 1. 1. 2或EC 1. 1. 1. 21。
182. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述醇脫氫酶選自來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhA、來 自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌的丁醇脫氫酶、酵母屬ADHIV、和來自釀酒酵 母的ADH6。
183. -種分離的細(xì)胞，其包含一種或多種外源核酸，該外源核酸編碼一種或多種酶，該 酶涉及選自下組的一種或多種聚合物單體的生物合成：7AHA ;PA ;1，7DAH ;ENTL ;和7HHA， 其中所述酶選自下組：氨裂合酶、烯酸還原酶、羧酸還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、硫酯酶、酸-硫醇 連接酶或CoA合成酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、?；?[acp]硫酯酶、?；?[acp]合成酶、氨基酸氨基 轉(zhuǎn)移酶、脫氨基脫氫酶、羰基還原酶、α-酮酸脫羧酶、乙酰乳酸合酶、α-氨基酸脫羧酶、月旨 肪-?；?CoA還原酶、?；?[acp]-還原酶、醛脫氫酶、醛氧化酶、酰胺水解酶、水裂合酶、 和催化α-酮酸鏈延伸的酶。
【文檔編號】C12P7/44GK104126012SQ201280070432
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】P.S.珀?duì)柭? C.陳, A.博茨, A.V.E.康拉蒂, B.D.赫佐格 申請人:英威達(dá)技術(shù)有限責(zé)任公司