用于初免-加強疫苗的水皰性口炎病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水皰性口炎病毒(VSV)基質(zhì)(M)蛋白突變體。一種突變體M蛋白，包括在位置（21）變?yōu)楣劝彼岬母拾彼?，在位置?11）變?yōu)楸奖彼岬牧涟彼岷驮谖恢茫?1）變?yōu)榫彼岬募琢虬彼?。另一種M蛋白突變體，包括在位置（22）變?yōu)楣劝彼岬母拾彼岷驮谖恢茫?8）和（51）變?yōu)榫彼岬募琢虬彼?。又一種VSVM蛋白突變體，包括在位置（22）變?yōu)楣劝彼岬母拾彼?，在位置?10）變?yōu)楸奖彼岬牧涟彼岷驮谖恢茫?8）和（51）變?yōu)榫彼岬募琢虬彼帷１景l(fā)明還指向具有這些M突變體的重組VSVs(rVSV)和基于具有本發(fā)明的M突變體的rVSV的疫苗。這些具有突變體M的新型rVSVs被顯著減毒并喪失了毒性，包括神經(jīng)毒性，且能夠誘導(dǎo)針對目標抗原的免疫應(yīng)答。此外，具有第一種描述的M突變體的rVSV印第安納血清型在31℃下能夠有效復(fù)制，且在約37℃或更高時復(fù)制能力差或不能復(fù)制。
【專利說明】用于初免-加強疫苗的水皰性口炎病毒 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明整體涉及生物技術(shù)和免疫學(xué)。特別的，本發(fā)明涉及水皰性口炎病毒（VSV) 的新型基質(zhì)（M)蛋白，涉及表達新型M蛋白的減毒重組VSVs，并涉及基于VSV的初免-加強 疫苗，該初免-加強疫苗針對由具有外源基因的重組VSV表達的外源抗原的長期體液、細胞 介導(dǎo)的和粘膜誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0002] 發(fā)明背景 水皰性口炎病毒（VSV)是一種負鏈RNA病毒，其感染大部分哺乳動物細胞并在受感 染細胞中表達高達總蛋白60%的病毒蛋白[Kim，G.N.和C.Y. Kang. Virology 357:41， 2007]。在自然界中，VSV感染豬、牛和馬，并在口和足附近導(dǎo)致水痘性疾病。雖然已有報道 人感染VSV，但是VSV在人類中沒有導(dǎo)致任何嚴重的癥狀[Fields，B. N.和K.Hawkins. N Engl J Med 277:989,1967 ; Johnson，Κ·Μ·等人，Am J Trop Med Hyg 15:244,1966]。
[0003] VSV編碼5種蛋白，核殼蛋白（N)、磷蛋白（P)、基質(zhì)蛋白（Μ)、表面糖蛋白（G)和RNA 依賴性RNA聚合酶（L)。VSV的Ν、Ρ和L蛋白正義和反義基因組RNA和mRNA的合成所必需 的，后者是VSV蛋白合成需要的。
[0004] 由VSV基質(zhì)（M)蛋白阻斷宿主細胞蛋白合成會誘導(dǎo)細胞死亡。將水皰性口炎病 毒印第安納（Indiana)血清型（VSVInd)中的M蛋白第51位的甲硫氨酸殘基改變?yōu)榫?酸（M51R)，并將水皰性口炎病毒新澤西（New Jersey)血清型（VSVNJ) M基因中的第48 位（Met48)和51位的（Met51)甲硫氨酸改變?yōu)榫彼崮軌蚴沟肰SV M蛋白的這一功能 失效〇(加，6和1^叩，（：.，￥11'〇1(^7,357:41-53,2007)。雖然在]\1蛋白中具有這些]^七至 Arg突變的VSV已經(jīng)顯著降低了細胞病變效應(yīng)，但是它們還是在細胞中復(fù)制和生產(chǎn)后代病 毒并感染動物。VSVInd奧賽（Orsay)毒株的一個溫度敏感（ts)M基因突變體，ts023,已在 37oC和39oC下的小鼠膠質(zhì)細胞系中表現(xiàn)出受限的復(fù)制（Rabinowitz，S.等人，Infection and Immunityy 33:120-125,1981)。已證實ts023的溫度敏感性是39oC下以子彈形結(jié) 構(gòu)為特征的病毒組裝啟動不正確或缺失的結(jié)果（Flood，E.等人，Virology 278:520-533， 2000;Lyles，D.等人，Virology，217:76 - 87，1996)。此外，即使在直接接種到腦部以后， ts023在小鼠中還是喪失了其神經(jīng)毒性（Rabinowitz，S.等人，Infection and Immunity, 33:120-125,1981)〇
[0005] VSV奧賽毒株的野生型M和ts023的M之間存在著三個氨基酸的不同，其是在第 21個氨基酸的甘氨酸（G)至谷氨酸（E) (G21E)，在第111個氨基酸的亮氨酸（L)至苯丙氨 酸（F) (L111F)，和在第227個氨基酸的組氨酸（H)至酪氨酸（Y) (H227Y) (Morita，K.等 人，J. Virol. 61:256-263,1987)。在回復(fù)子中Fill的單氨基酸回復(fù)至L顯示Fill看起 來在ts023的溫度敏感性中起主要作用。然而，另兩個突變也可能具有一些作用，因為在 111位由F至L的單回復(fù)沒有將病毒完全恢復(fù)至其野生型表型（Morita，K.等人，J. Virol. 61:256-263，1987;Li，Y.等人，J. Virol. 62:3729-3737,1988)。
[0006] 目前，研究組已開發(fā)了能夠復(fù)制的、組裝缺陷的VSV，其具有G糖蛋白（G)基因缺 失（AG)或G和M基因同時缺失（AMG)作為更安全的疫苗載體（Kahn，J.等人，J. Virol. 75:11079-11087, 2001 ;Schwartz，J.等人，Virology 366:166-73,2007)。然而，具有 G 基 因缺失或G和M基因缺失，VSV載體需要提供反式（in trans) G或M和G蛋白用于生產(chǎn)組 裝缺陷VSV。為了降低生產(chǎn)疫苗的成本，需要產(chǎn)生能夠生產(chǎn)可以以高滴度復(fù)制的病毒疫苗載 體的系統(tǒng)。因此，所需要的是全長VSV載體系統(tǒng)，其已經(jīng)喪失了它的毒性(無致病性)，且仍 然能夠在31°C下體外復(fù)制至高滴度，在非允許的溫度下不能正確組裝，并針對其表達的目 標基因誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答。
[0007] 本發(fā)明進一步和其它目標將根據(jù)下述發(fā)明概述、發(fā)明討論和實施方式及其實施例 實現(xiàn)。
[0008] 發(fā)明概述 發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了水皰性口炎病毒（VSV)的新的基質(zhì)（M)蛋白突變體，包括VSV印第 安納血清型（VSVInd)和VSV新澤西血清型（VSVNJ)。這些具有突變體M蛋白的新的VSVs 基本上是非細胞溶解的、顯著減毒的和無致病性的，包括神經(jīng)毒性（更安全）。進一步的，這 些具有突變體M蛋白的新的VSVs能夠針對目標抗原或表位誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以 是體液的、細胞的和粘膜的免疫應(yīng)答。此外，具有M突變體的VSVInd可以在31 〇C下組裝并 從受感染的細胞中釋放，但是它們在37° C或更高溫度下不能正確組裝，且病毒從受感染細 胞中的釋放較之野生型VSVInd而言顯著降低了約1000或10, 000倍。
[0009] 據(jù)此，在一個實施方式中，本申請涉及水皰性口炎病毒（VSV)的改性的基質(zhì)（M)蛋 白。在一個實施方式中，改性的M蛋白包含選自由下述組成的氨基酸序列：（i) SEQ ID NO: 3,其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R;和（ii) SEQ ID N0:8,其至少包括下述取代 物：G22E/M48R+M51R。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的改性的M蛋白包含SEQ ID N0:8的氨 基酸序列，該SEQ ID N0:8至少包括下述取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
[0010] 在本發(fā)明的改性的M蛋白的另一個實施方式中，改性的M蛋白包含選自由下述組 成的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10。
[0011] 在另一個實施方式中，本申請?zhí)峁┝艘环N重組VSV (rVSV)。在一個實施方式中， 該rVSV包含改性的基質(zhì)（M)蛋白，該改性的M蛋白包含選自由下述組成的氨基酸序列：（i) SEQ ID N0:3,其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R;和（ii) SEQ ID N0:8,其至少包 括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方式中，rVSV是一種表達外源病原體的蛋白的嵌合rVSV，且 其中所述嵌合rVSV能夠針對所述蛋白的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0013] 在本發(fā)明rVSV的另一個實施方式中，病原體是病毒、真菌、細菌或寄生蟲病原體。
[0014] 在本發(fā)明rVSV的另一個實施方式中，rVSV基本上是非細胞溶解的和無致病性的。
[0015] 在本發(fā)明的一個實施方式中，rVSV是一種重組水皰性口炎病毒印第安納血清型 (rVSVInd)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，該SEQ ID NO :3至少包括下 述取代物：G21E/L111F/M51R。
[0016] 在本發(fā)明的rVSVInd的另一個實施方式中，改性的M蛋白包含SEQ ID NO :4的氨 基酸序列。
[0017] 在本發(fā)明的rVSVInd的另一個實施方式中，改性的M蛋白由包含SEQ ID NO :2的 核苷酸序列的基因編碼。
[0018] 在本發(fā)明rVSV的另一個實施方式中，前述任一實施方式的rVSVInd能夠在允許的 溫度下產(chǎn)生VSVInd顆粒，且不能在非允許的溫度下產(chǎn)生顆粒。
[0019] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，rVSV是一種重組水皰性口炎病毒新澤西血清型 (rVSVNJ)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該SEQ ID NO :8至少包括下述 取代物：G22E/M48R+M51R。
[0020] 在本發(fā)明的rVSVNJ的另一個實施方式中，改性的M蛋白由具有SEQ ID NO :6的核 苷酸序列的基因編碼。
[0021] 在本發(fā)明的rVSVNJ的另一個實施方式中，改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :9。
[0022] 在本發(fā)明的rVSVNJ的另一個實施方式中，改性的M蛋白包括以下取代物：G22E/ L110F/M48R+M51R。
[0023] 在本發(fā)明的rVSVNJ的另一個實施方式中，改性的M蛋白由具有SEQ ID NO :7的核 苷酸序列的基因編碼。
[0024] 在本發(fā)明的rVSVNJ的另一個實施方式中，改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。
[0025] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種疫苗。在一個實施方式中，本發(fā)明的疫苗包 含有效量的一種或多種減毒rVSVs，該一種或多種減毒rVSVs包括改性的基質(zhì)（M)蛋白，該 改性的M蛋白包含選自由下述組成的氨基酸序列：（i) SEQ ID NO :3,其至少包括下述取代 物：G21E/L111F/M51R;和（ii) SEQ ID N0:8,其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
[0026] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是一種重組水皰性口炎病毒印第安納 血清型（rVSVInd)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，該SEQ ID NO :3至少 包括下述取代物：G21E/L111F/M51R。
[0027] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSVInd的改性的M蛋白包含SEQ ID NO : 4的氨基酸序列。
[0028] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSVInd的改性的M蛋白由包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的基因編碼。
[0029] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，該rVSVInd能夠在允許的溫度下產(chǎn)生 VSVInd顆粒，且不能在非允許的溫度下產(chǎn)生顆粒。
[0030] 在之前發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是一種重組水皰性口炎病毒新澤西 血清型（rVSVNJ)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該SEQ ID NO :8至少 包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
[0031] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白由具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列的基因編碼。
[0032] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白包含氨基 酸序列 SEQ ID NO :9。
[0033] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白包括以下 取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
[0034] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白由具有SEQ ID NO :7的核苷酸序列的基因編碼。
[0035] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白包含氨基 酸序列 SEQ ID NO :10。
[0036] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，根據(jù)前述任一實施方式的rVSV是一種表 達外源病原體的蛋白的嵌合rVSV，且該嵌合rVSV能夠針對所述蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0037] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，rVSV包含減毒嵌合rVSVs的混合物，其中 混合物中的至少兩種嵌合rVSVs表達外源病原體的不同蛋白。
[0038] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，病原體是病毒、真菌、細菌或寄生蟲病原 體。
[0039] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，病原體是慢病毒。
[0040] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方式中，慢病毒是HIV且表位是HIV蛋白。
[0041] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，病原體是HCV且表位是HCV蛋白。
[0042] 在本發(fā)明的一個實施方式中，前述任一實施方式的疫苗能夠誘導(dǎo)體液、細胞和粘 膜免疫應(yīng)答。
[0043] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，根據(jù)前述任一實施方式的疫苗進一步包括佐劑。
[0044] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。在本 發(fā)明的一個實施方式中，該方法包括對受試者施用：(a)有效量的包含一種血清型的減毒 rVSV的疫苗，該一種血清型的減毒rVSV具有第一改性的M蛋白，該第一改性的M蛋白包含 SEQ ID N0:3的氨基酸序列，該SEQ ID N0:3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R;和 (b)有效量的包含另一種血清型的減毒rVSV的另一種疫苗，該另一種血清型的減毒rVSV具 有第二改性的M蛋白，該第二改性的M蛋白包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該SEQ ID NO: 8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。在本發(fā)明的一個方面，該第二改性的M蛋白包含 SEQ ID N0:8的氨基酸序列，該SEQ ID N0:8至少包括下述取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
[0045] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，在對患者施用（b)前對受試者施用（a)。
[0046] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，在誘導(dǎo)過程中對受試者施用（b)多于一次。
[0047] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，對受試者施用（a)且在施用（a)后約第3周、 第8周和第16周時對受試者施用（b)。
[0048] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，在對受試者施用（a)前對受試者施用（b)。
[0049] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，在誘導(dǎo)過程中對受試者施用（a)多于一次。
[0050] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，對受試者施用（b)且在施用（b)后約第3周、 第8周和第16周時對受試者施用（a)。
[0051] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，疫苗（a)的rVSV和疫苗（b)的rVSV是表達 外源病原體的蛋白的嵌合rVSV，且其中這兩種rVSVs能夠針對該蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0052] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，病原體是病毒、真菌、細菌或寄生蟲病原體。
[0053] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，病原體是慢病毒。
[0054] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。
[0055] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，一種血清型的rVSV和另一種血清型的rVSV 包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于表達HIV蛋白的 基因是插入G基因和L基因之間的HIV基因。
[0056] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，HIV基因選自包含gag、env和pol的一組HIV 基因。
[0057] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，病原體是HCV且蛋白是HCV蛋白。
[0058] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，一種血清型的rVSV和另一種血清型的rVSV 包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于表達HCV蛋白的 基因被插入rVSV的G基因和L基因之間。
[0059] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，疫苗（a)和疫苗（b)包含減毒嵌合rVSVs的 混合物，其中混合物中的至少兩種減毒嵌合rVSVs表達病原體的不同蛋白。
[0060] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，（a)和（b)兩種疫苗的每一種都誘導(dǎo)體液、細 胞和粘膜免疫應(yīng)答。
[0061] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，疫苗（a)的rVSV血清型是印第安納，疫苗（b) 的rVSV血清型是新澤西。
[0062] 在本發(fā)明方法的另一個實施方式中，疫苗（a)和疫苗（b)的每一種都進一步包含 佐劑。
[0063] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種初免-加強聯(lián)合疫苗。在一個實施方式中， 該初免-加強聯(lián)合疫苗包含：(a)有效量的包含一種血清型的減毒rVSV的疫苗，該一種血 清型的減毒rVSV具有包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的第一改性M蛋白；和（b)有效量的 包含另一種血清型的rVSV的疫苗，該另一種血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二改性M蛋白。
[0064] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的一個實施方式中，疫苗（a)是初免疫苗，疫苗 (b)是加強疫苗。
[0065] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，疫苗（b)是初免疫苗，疫苗 (a)是加強疫苗。
[0066] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，兩種減毒rVSVs是表達外 源病原體的蛋白的嵌合rVSV，且這兩種嵌合rVSVs能夠針對蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0067] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，病原體是病毒、真菌、細菌 或寄生蟲病原體。
[0068] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，病原體是慢病毒。
[0069] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，慢病毒是HIV且蛋白是HIV 蛋白。
[0070] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，一種血清型的rVSV和另一 種血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于 表達HIV蛋白的基因被插入G基因和L基因之間。
[0071] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，HIV基因選自由env、gag 和pol組成的一組HIV基因。
[0072] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，病原體是HCV且表位是HCV 蛋白。
[0073] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，一種血清型的rVSV和另一 種血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于 表達HCV蛋白的基因被插入G基因和L基因之間。
[0074] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，HCV蛋白是結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu) 的HCV蛋白。
[0075] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，兩種疫苗的每一種都包含 減毒嵌合rVSVs的混合物，且混合物中的至少兩種減毒嵌合rVSVs具有病原體的不同蛋白。
[0076] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，兩種疫苗的每一種都能夠 誘導(dǎo)體液、細胞和粘膜免疫應(yīng)答。
[0077] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，疫苗（a)的血清型是印第 安納且疫苗（b)的血清型是新澤西。
[0078] 在本發(fā)明的初免-加強聯(lián)合疫苗的另一個實施方式中，疫苗（a)和疫苗（b)的每 一種都進一步包含佐劑。
[0079] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含：(a)至少一種劑量的有效 量的包含rVSV Ind的疫苗，該rVSVInd具有包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的改性的M蛋白； 和（b)至少一種劑量的有效量的含rVSVw的疫苗，該rVSV w具有包含SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的改性的M蛋白。
[0080] 在本發(fā)明試劑盒的另一個實施方式中，（a)和（b)配制于一種藥學(xué)可接受的載體 中。
[0081] 在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的肽，其包含選自列為SEQ ID NOs : 4、9和10的一組氨基酸序列的氨基酸序列。
[0082] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于編碼SEQ ID NOs :4、9和10的分離的肽的 分離的核苷酸序列。
[0083] 附圖簡述 僅以實例的方式描述各實施方式，并參考附圖，其中： 圖1顯示了在M基因中具有突變（mutations)的印第安納（Ind)血清型水皰性口炎病 毒（VSV)的基因組織（organization)。
[0084] 圖2顯示了在M基因中具有突變的新澤西（NJ)水皰性口炎病毒（VSV)的基因組。
[0085] 圖3顯不了用于從cDNA回收VSV的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)。
[0086] 圖4顯示了在允許的溫度下[圖A)和C)]和半允許的溫度下[圖B)和D)]，在 感染重組VSVs的幼倉鼠腎（BHK)細胞[圖A)和B)]和感染rVSV的人成神經(jīng)細胞瘤細胞 (SH-SY5Y)中，rVSV Ind的M蛋白中突變LlllF的裂解量效應(yīng)。
[0087] 圖5是表示在31°C和37°C下的BHK21細胞中，rVSVw的M蛋白中突變M48R+M51、 G22E、G22E/M48R+M51R、G22E/L110F、G22E/L110F/M48R+M51R 的裂解量效應(yīng)的圖表。
[0088] 圖6A)是表現(xiàn)rVSVInd的rVSV蛋白表達水平的蛋白質(zhì)印跡分析：1. WT、2. M51R、 3. G21E、4. G21E/M51R、5. G21E/L111F 和 6. G21E/L111F/M51R。
[0089] 圖6B)是表現(xiàn)rVSVNJ的rVSV蛋白表達水平的蛋白質(zhì)印跡分析：I. WT、2. M48R+M51R、3. G22E、4. G22E/M48R+M51R、5. G22E/L110F 和 6. G22E/L110F/M48R+M51R。
[0090] 圖7包括受到具有野生型M基因的rVSVInd(圖7B和I)和感染在M基因具有不同 突變的rVSV Ind (圖7八、034、6、!1、1(、1^^和沁感染的冊1(21細胞圖片和未感染的冊1(21 細胞圖片（圖7C和J)。細胞在31°C (圖7A-G)或37°C (圖7H-N)下溫育。
[0091] 圖8包括受到在M基因具有不同突變的（圖8C、D、E、F、I、J、K和L)或具有野生 型M基因（圖8A和G)的rVSV Ind感染的SH-SY5Y細胞的圖片和未感染的SH-SY5S細胞的 圖片（圖8B和Η)。細胞在31°C (圖8A-F)或37°C (圖8G-L)下溫育。
[0092] 圖9包括受到在1基因具有不同突變的（圖9八、03、？、6、!1、1(、1^』和吣或具有 野生型M基因（圖9B和I)的rVSV w感染的BHK21細胞的圖片以及未感染的BHK21細胞圖 片（圖9C和J)。細胞在31°C (圖9A-G)或37°C (圖9H-N)下溫育。
[0093] 圖10包括受到在M基因具有不同突變的（圖10A、D、E、F、G、Η、K、L、M、和N)或 具有野生型M基因（圖IOB和I)的rVSV w感染的SH-SY5Y細胞圖片，和未感染的SH-SY5Y 細胞圖片（圖IOC和J)。細胞在31°C (圖10A-G)或37°C (圖10H-N)下溫育。
[0094] 圖11包括顯示在瑞士韋伯斯特小鼠中通過內(nèi)側(cè)（intralateral)腦室注射進行的 神經(jīng)毒性研究的圖表4)淠-輻射的1^^2比/111卟肩511?、8)1^￥ 111(1町、〇1^^111(1 M51R 和 D) rVSVInd G21E/L111F/M51R。
[0095] 圖12包括顯示在瑞士韋伯斯特小鼠中通過內(nèi)側(cè)（intralateral)腦室注射進行的 神經(jīng)毒性研究的圖表：A) rVSVw WT、B)rVSVw M48R+M51R、C) rVSVw G22E/M48R+M51R和 D) rVSVNJ G22E/L110F/M48R+M51R〇
[0096] 圖 13 (SEQ ID NOs :11-15) A)顯示了將 HIV-I Gag-En 基因克隆入 rVSV 的 cDNA 克隆。圖13B)是感染表達Gag-En和具有M基因不同突變的rVSVs并在31°C下溫浴的BHK 細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。圖13C)是感染表達Gag-En和具有M基因不同突變的rVSVs并在 37°C下溫浴的BHK細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0097] 圖14描述了接種管理模式和接種組列表。
[0098] 圖15描述了用二甲亞砜（DMSO)刺激的如插圖所示的不同接種組的肽特異性⑶8+ IFN Y + T細胞的頻率圖。
[0099] 圖16是用VSV N刺激的如插圖所示的不同接種組的VSV N肽特異性⑶8+ IFN Y + T細胞的頻率圖。
[0100] 圖17是用Hiv-I Gag刺激的如插圖所示的不同接種組的Hiv-I Gag肽特異性CD8+ IFN Y + T細胞的頻率圖。
[0101] 圖18是顯示如插圖所示的不同接種組的Hiv-I Gag特異性抗體應(yīng)答的圖表。
[0102] 圖19是用不同劑量的表1中的rVSV接種的不同接種組的VSV N肽特異性⑶8+ IFN Y + T細胞的頻率圖。
[0103] 圖20是用不同劑量的表1中的rVSV接種的不同接種組的HIV-I Gag肽特異性 ⑶8+ IFN Y + T細胞的頻率圖。
[0104] 圖21是顯示用不同劑量的表1中的rVSV接種的不同接種組的HIV-I Gag特異性 抗體應(yīng)答的圖表。
[0105] 圖22 (SEQ ID NOS :16-26)顯示了將連接至編碼gpl20和gp41的人B細胞和 T細胞表位的核苷酸的HIV-I ?基因克隆入rVSVInd G21E/L111F/M51R和rVSVw G22E/ M48R+M51R 的 cDNA 克隆。
[0106] 圖23 (分別為SEQ ID NOS :11-15和27-31)顯示了將連接至編碼gp41、nef、 gpl20、RT、Tat和Rev的人B細胞和T細胞表位的核苷酸的HIV-I ?基因克隆入rVSVInd G21E/L111F/M51R和 rVSVw G22E/M48R+M51R 的 cDNA 克隆。其還顯示了將 HIV-I 和 基因克隆入 rVSVInd G21E/L111F/M51R 和 rVSVw G22E/M48R+M51R 的 cDNA 克隆。
[0107] 圖 24 顯示了用表達 Gag A、B、C、En 和 RT 的 rVSVInd G21E/L111F/M51R 感染并在 31°C和37°C下溫育的BHK21細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0108] 圖 25 顯示了用表達 Gag A、B、C、En 和 RT 的 rVSVwG22E/M48R+M51R 感染并在 31°C 和37°C下溫育的BHK21細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0109] 圖 26 顯示了用表達 HIV-I 基因的 rVSVInd G21E/L111F/M51R 或 rVSVw G22E/ M48R+M51R感染的BHK21細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0110] 圖 27 顯示了用表達 HIV-I 沿77你 kss 基因的 rVSVInd G21E/L111F/M51R 或 rVSVNJ G22E/M48R+M51R感染的BHK21細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0111] 圖28包括描述在表6的不同接種組：G1、G2、G3、G4、G5和不含Env P18的G5中 的VSV N和HIV-I蛋白肽特異性⑶8+ T細胞應(yīng)答的圖表。
[0112] 圖29是描述表6的G6接種組中的VSV N和HIV-I蛋白肽特異性⑶8+ T細胞應(yīng) 答的圖表。顯示了 VSV N肽和用于刺激脾細胞的來自HIV-I蛋白的肽的氨基酸序列（SEQ ID NOS :32 - 37)。
[0113] 圖30顯示了表6的接種組中誘導(dǎo)的針對HIV-I Gag (圖30A)和Gpl20 (圖30B) 的體液免疫應(yīng)答，其通過酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA)進行測定。
[0114] 圖 31 描述了 克隆入 rVSVInd (GLM)和 rVSVNJ (GM)和 rVSVNJ (GLM)的 HCV 結(jié)構(gòu)蛋白基 因。
[0115] 圖 32 顯示了 對來自 rVSVInd (GLM)、rVSVNJ (GM)、rVSVNJ (GLM)的 HCV Core (圖 32A)、 El (圖32B)、E2 (圖32C)和NS4B (圖32D)蛋白表達的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0116] 圖 33 描述了克隆入 rVSVInd (GLM)、rVSVNJ (GM)和 rVSVNJ(GLM)的 HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白基 因。
[0117] 圖 34 對來自 rVSVInd (GLM)的 HCV NS3 在 37〇C 和 31〇C 下的表達（圖 34A)、NS5A 在 37°C下的表達（圖34B)和NS5B (圖34C)在37°C和31°C下的表達的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0118] 圖 35 顯示了來自 rVSVw(GM)的 HCV NS3、NS4B、NS5A 和 NS5B 在 37〇C 的表達（圖 35A)和HCV NS5AB在37°C的表達（圖35B)。蛋白表達通過蛋白質(zhì)印跡分析進行檢測。
[0119] 發(fā)明詳述 綜述 除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普 遍理解的相同含義。同樣的，除了在權(quán)利要求中，除非另有說明，否則"或"的使用包括了 "和"，反之亦然。非限制性術(shù)語不會被解釋為限制性的，除非有明確表述或上下文清楚地顯 示了相反含義(例如"包括"、"具有"和"包含"一般表示"無限制地包括")。在權(quán)利要求中 包含的單數(shù)形式例如"一"、"一個"和"該"包括了復(fù)數(shù)指向，除非另有明確說明。"基本上 由……組成"表示列舉的任何元素都必然地被包括在內(nèi)，會在相當程度上影響所列舉的元 素的基本特性和新型特性的元素被排除在外，且其他元素可選的可以被包括在內(nèi)。"由…… 組成"表示除了所列舉的那些元素外其他所有元素都被排除在外。由這些術(shù)語的每一個所 定義的實施方式均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0120] 所有的數(shù)值名稱(例如規(guī)模和重量(包括范圍)）都是約數(shù)，其一般可以0. 1、1. 0或 10.0的增量發(fā)生適當變化（+)或（-)。所有的數(shù)值名稱都可以被理解為其前面存在術(shù)語 "約"。
[0121] 術(shù)語"施用"包括遞送本發(fā)明化合物的任何方法，包括將藥物組合物、疫苗或治療 劑遞送到受治療者系統(tǒng)，或者遞送到受治療者的特定部位內(nèi)或特定部位上。本文使用的術(shù) 語"全身性給藥"、"全身性施用"、"外周給藥"和"經(jīng)外周施用"是指以不同于直接進入中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的方法施用化合物、藥物或其它物質(zhì)，由此使之進入患者系統(tǒng)，從而進行代謝和其 他類似過程，例如皮下給藥。"胃腸外給藥"和"胃腸外施用"是指不同于腸內(nèi)給藥和局部 給藥的給藥方式，一般通過注射來進行，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶 內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸肌 內(nèi)注射和輸注。
[0122] 術(shù)語"氨基酸"為本領(lǐng)域所知。本文用于標明氨基酸和保護基的縮寫一般根據(jù) IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會的推薦（參見Biochemistry(1972) 11 :1726-1732)。對于 本發(fā)明相關(guān)的氨基酸其名稱為：M :甲硫氨酸，R :精氨酸，G :甘氨酸，E :谷氨酸，L :亮氨酸， F :苯丙氨酸。在某些實施方式中，用于本發(fā)明應(yīng)用的氨基酸是存在于蛋白質(zhì)中的天然存在 的氨基酸或天然存在的含有氨基和羧基的這類氨基酸的合成代謝產(chǎn)物或分解代謝產(chǎn)物。特 別合適的氨基酸側(cè)鏈包括選自以下氨基酸的側(cè)鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、 精氨酸、脯氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
[0123] 本文所用術(shù)語"抗體"包括例如任何同種型（IgG、IgA、IgM、IgE等）的完整抗體， 包括多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體和人源化抗體；以及其特異性識別并能夠結(jié)合蛋白 質(zhì)表位的片段?？梢圆捎贸Ｒ?guī)技術(shù)使抗體成為片段，并以相同方式篩選出可利用的片段。 因此，該術(shù)語包括能夠選擇性與特定蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體分子的蛋白酶剪切部分區(qū)段或重組 制備部分區(qū)段。這類蛋白酶解片段和/或重組片段的非限制性實例包括Fab、F(ab' )2、 Fab'、Fv和含有通過肽接頭連接的V[L]區(qū)和/或V[H]區(qū)的單鏈抗體（scFv)。scFv可以 共價或非共價連接以形成具有兩個或更多個結(jié)合位點的抗體。
[0124] 本文使用的術(shù)語"表位"指在動物體內(nèi)，優(yōu)選的哺乳動物體內(nèi)具有抗原性或免疫原 性的多肽或蛋白質(zhì)的位點或片段。具有免疫原性的表位是如本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例如免疫 分析等熟知的任何方法所確定的抗體免疫特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)的位點或片段。
[0125] 本文在蛋白質(zhì)試劑的上下文中使用的術(shù)語"片段"指包含肽、多肽或蛋白質(zhì)的氨基 酸序列的至少2個連續(xù)氨基酸殘基、至少5個連續(xù)氨基酸殘基、至少10個連續(xù)氨基酸殘基、 至少15個連續(xù)氨基酸殘基、至少20個連續(xù)氨基酸殘基、至少25個連續(xù)氨基酸殘基、至少40 個連續(xù)氨基酸殘基、至少50個連續(xù)氨基酸殘基、至少60個連續(xù)氨基酸殘基、至少70個連續(xù) 氨基酸殘基、至少80個連續(xù)氨基酸殘基、至少90個連續(xù)氨基酸殘基、至少100個連續(xù)氨基 酸殘基、至少125個連續(xù)氨基酸殘基、至少150個連續(xù)氨基酸殘基、至少175個連續(xù)氨基酸 殘基、至少200個連續(xù)氨基酸殘基、或至少250個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列的肽或多 肽。在一個實施方式中，全長蛋白質(zhì)的片段保留該全長蛋白質(zhì)的活性，例如免疫原性。在另 一個實施方式中，全長蛋白質(zhì)的片段不保留該全長蛋白質(zhì)的活性，例如非免疫原性。
[0126] 本文在核酸的上下文中使用的術(shù)語"片段"指包含編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸序 列的至少2個連續(xù)核苷酸、至少5個連續(xù)核苷酸、至少10個連續(xù)核苷酸、至少15個連續(xù)核 苷酸、至少20個連續(xù)核苷酸、至少25個連續(xù)核苷酸、至少30個連續(xù)核苷酸、至少35個連續(xù) 核苷酸、至少40個連續(xù)核苷酸、至少50個連續(xù)核苷酸、至少60個連續(xù)核苷酸、至少70個連 續(xù)核苷酸、至少80個連續(xù)核苷酸、至少90個連續(xù)核苷酸、至少100個連續(xù)核苷酸、至少125 個連續(xù)核苷酸、至少150個連續(xù)核苷酸、至少175個連續(xù)核苷酸、至少200個連續(xù)核苷酸、至 少250個連續(xù)核苷酸、至少300個連續(xù)核苷酸、至少350個連續(xù)核苷酸、或至少380個連續(xù) 核苷酸的核酸序列。在一個優(yōu)選的實施方式中，核酸的片段編碼保留完整蛋白活性例如免 疫原性的肽或多肽。在另一個實施方式中，全長蛋白質(zhì)的片段不保留該全長蛋白質(zhì)的活性， 例如非免疫原性。
[0127] 本文使用的術(shù)語"基本上非細胞溶解的"表示重組水皰性口炎病毒（rVSV)不會顯 著損傷或殺死其感染的細胞。
[0128] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的術(shù)語"HIV"是指人免疫缺陷病毒。有兩種類型的HIV : HIV-I和HIV-2。有許多不同的HIV-I毒株。HIV-I毒株可被分為三組："主要（major) "組， 即M組，"異常（outlier) "組，即0組和"新（new) "組，即N組。這三個組可代表三種獨立 進入人體的猿猴免疫缺陷病毒。在M組內(nèi)有至少10個亞型或分化體：例如，分化體A、B、C、 D、E、F、G、H、I、J和K。"分化體"是一組生物（例如一個種），其成員有共同的衍生自共同 祖先的同源特征。本申請任何提及HIV-I時都包括所有的這些毒株。
[0129] 術(shù)語"非感染性的"是指降低到不存在感染能力。
[0130] 本文使用的術(shù)語"受試者"或"患者"可交換使用。本文使用的術(shù)語"受試者"和 "受試者們"指人或非人動物。
[0131] 術(shù)語"遞藥裝置"是指可用來施用受治療者治療藥或藥物的任何裝置。遞藥裝置 的非限制性實例包括皮下注射器、多室注射器（multichamber syringe)、支架、導(dǎo)管、透皮 貼劑、微針（microneedle)、微研磨器（microabrader)和可植入控釋裝置。在一個實施方式 中，術(shù)語"遞藥裝置"是指能夠在注射前使兩種化合物混勻的雙室注射器。
[0132] 本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"是指在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適于與人組織和動 物組織接觸而無過度毒性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，并與合理的利益/風(fēng)險 比相當?shù)幕衔?、物質(zhì)、組合物和/或劑型。
[0133] 本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"是指藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或溶媒， 例如參與將題述化合物從一種器官或身體的一部分運送或轉(zhuǎn)運到另一種器官或身體的另 一部分的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料。在與制劑的其它成分相容 并且對患者無害的意義上來說，各載體必須是"可接受的"?？捎米魉帉W(xué)上可接受的載體的 物質(zhì)的一些實例包括：（1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯 淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)西黃蓍 膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油，例如花 生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；（10)二醇，例如丙二醇；（11)多元 醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；（12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；（13)瓊 月旨；（14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；（15)海藻酸；（16)無熱原水；（17)等滲鹽水； (18)林格溶液（Ringer' s solution) ; (19)乙醇；（20)pH緩沖溶液；（21)聚酯、聚碳酸酯 和/或聚酐；和（22)用于藥物制劑的其它無毒相容性物質(zhì)。
[0134] 術(shù)語"多核苷酸"和"核酸"可互換使用，是指任何長度的聚合形的核苷酸，或是脫 氧核糖核苷酸，或是核糖核苷酸或其類似物。下面是多核苷酸的非限制性實例：基因或基 因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、由聯(lián)鎖分析界定的基因座、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、 轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸（branched polynucleotide)、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引 物。多核苷酸可包含改性核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，則核苷酸 結(jié)構(gòu)的改性可以在聚合物組裝之前或之后進行。核苷酸序列可以被非核苷酸組分間隔開。 多核苷酸可以在聚合后進一步被改性，例如通過與標記組分綴合。術(shù)語"重組"多核苷酸是 指基因組、cDNA、半合成來源或合成來源的多核苷酸，其不是天然存在的多核苷酸或者與其 它非天然排列的多核苷酸連接。"寡核苷酸"是指不超過約100個核苷酸的單鏈多核苷酸， 例如不超過約75、50、25或10個核苷酸。
[0135] 本文術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"（如果為單鏈）可互換使用，是指氨基酸的聚 合物。該聚合物可以是直鏈或是支鏈，它可包含改性氨基酸，而且可被非氨基酸間隔開。該 術(shù)語還包括已被改性的氨基酸聚合物，例如二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化或 任何其它操作，例如與標記組分綴合。
[0136] 在某些實施方式中，本發(fā)明的多肽可以經(jīng)化學(xué)合成、在無細胞系統(tǒng)中經(jīng)核糖體合 成、或者在細胞內(nèi)經(jīng)核糖體合成。可以采用各種本領(lǐng)域公認的方法進行本發(fā)明多肽的化 學(xué)合成，包括分步固相合成、經(jīng)由肽片段構(gòu)象輔助再連接（conformationally-assisted re-ligation)的半合成、克隆或合成肽區(qū)段的酶促連接和化學(xué)連接。天然化學(xué)連接采用 兩個未受保護的肽區(qū)段的化學(xué)選擇反應(yīng)以產(chǎn)生瞬時硫酯連接的中間體。然后，該瞬時硫酯 連接的中間體自發(fā)地進行重排，以提供在連接位點具有天然肽鍵的全長連接產(chǎn)物。全長連 接產(chǎn)物在化學(xué)上與通過無細胞合成而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相同。全長連接產(chǎn)物可以根據(jù)被允許 的情況而進行重新折疊和/或氧化，以形成天然的含有二硫鍵的蛋白質(zhì)分子（參見例如美 國專利號 6, 184, 344 和 6, 174, 530;以及 T. W. Muir 等，Curr. Opin. Biotech. (1993): 第 4 卷，第 420 頁；Μ· Miller 等，Science (1989):第 246 卷，第 1149 頁；A. Wlodawer 等， Science (1989):第 245 卷，第 616 頁；L.H. Huang 等，Biochemistry (1991):第 30 卷， 第 7402 頁；M. Schnolzer 等，Int. J. Pept. Prot. Res. (1992):第 40 卷，第 180-193 頁；K. Rajarathnam 等，Science (1994):第 264 卷，第 90 頁；R. E. Offord，"Chemical Approaches to Protein Engineering(蛋白質(zhì)工程的化學(xué)方法）"，載于 Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook,G. Poste 主編， (Plenum Press，New York，1990)，第 253-282 頁；C. J. A. Wallace 等，J. Biol. Chem. (1992):第 267 卷，第 3852 頁；L. Abrahmsen 等，Biochemistry (1991):第 30 卷，第 4151 頁；T. K. Chang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91 :12544-12548 ;E Schnlzer 等，Science(1992):第 3256 卷，第 221 頁；和 Κ· Akaji 等，Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985)33 :184)。
[0137] " VSV "用于指水皰性口炎病毒。
[0138] "rVSV"用于指重組水皰性口炎病毒。
[0139] 術(shù)語"印第安納"和"IND"用于指VSV血清型印第安納（VSVlnd)。
[0140] 術(shù)語"新澤西"和"NJ"用于指VSV血清型新澤西（VSVw)。
[0141] "MWT"、"M(WT)"用于指野生型M蛋白。VSVlnd野生型M基因的核苷酸序列可以包 含由SEQ ID NO: 1表示的核苷酸序列。VSVlnd野生型M蛋白的氨基酸序列可以包含由SEQ ID NO :3表示的氨基酸序列。VSVw野生型M基因的核苷酸序列可以包含由SEQ ID NO :5表 示的核苷酸序列。VSVw野生型M蛋白的氨基酸序列可以包含由SEQ ID NO :8表示的氨基 酸序列。"M51R"用于指VSVlnd中的M(WT)，其在第51位具有甲硫氨酸變?yōu)榫彼帷?G21E" 用于指VSVlnd中的M(WT)，其在第21位具有甘氨酸變?yōu)楣劝彼帷?L111F"用于指VSVlnd中 的M(WT)，其在第111位具有亮氨酸變?yōu)楸奖彼帷?G22E"用于指VSV w中的M(WT)，其在 第22位具有甘氨酸（G)變?yōu)楣劝彼幔‥)。"L110F"用于指VSVw中的M(WT)，其在第110位 具有亮氨酸（L)變?yōu)楸奖彼幔‵)。"M48R+M51R"用于指VSV w中的M(WT)，其在第48和51 位具有甲硫氨酸（M)變?yōu)榫彼幔≧)。"rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)" 或"rVSVInd (GLM)" 用于指具有M(WT)的rVSVInd，其在第21位具有甘氨酸變?yōu)楣劝彼?，在?11位的亮氨酸變 為苯丙氨酸和在第51位的甲硫氨酸變?yōu)榫彼帷?rVSV w M(G22E/M48R+M51R) "或"rVSVNJ (GM) "用于指具有M(WT)的rVSVw，其在第22位具有甘氨酸變?yōu)楣劝彼岷驮诘?8和51位 甲硫氨酸變?yōu)榫彼幔?rVSV w M(G22E/L110F/M48R+M51R) "或"rVSVw (GLM) "用于指具有 M(WT)的rVSVw，其在第22位具有甘氨酸變?yōu)楣劝彼?、在?10位亮氨酸變?yōu)楸奖彼岷驮?第48和51位甲硫氨酸變?yōu)榫彼帷?br> [0142] 綜述 發(fā)明人產(chǎn)生了新型M蛋白和能夠產(chǎn)生該新型M蛋白的新型減毒rVSVs。本發(fā)明的新型 蛋白可以包括：M(G21E/L111F/M51R)、M(G22E/M48R+M51R)和 M(G22E/L110F/M48R+M51R)。 本發(fā)明的新型減毒rVSVs可被用于蛋白表達和疫苗載體以及用于預(yù)防或治療感染的方法。 本發(fā)明的rVSV可被用于制備用于人和其它動物的感染性疾病的疫苗以誘導(dǎo)細胞和體液免 疫應(yīng)答。
[0143] 分離的蛋白和M蛋白 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及分離的蛋白和編碼該分離的蛋白的核苷酸序列。從而， 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的肽，包含選自以SEQ ID NOs :4、9和10列出的氨 基酸序列的氨基酸序列。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及分離的核苷酸序列，其包含選自 以SEQ ID NOs :2、6和7列出的多核苷酸的核苷酸序列。
[0144] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及具有至少一種以下取代物的新型VSV M蛋： M(G21E/L111F/M51R)、M(G22E/M48R+M51R)和 M(G22E/L110F/M48R+M51R)。在一個方面本發(fā) 明涉及一種VSV M蛋白，其包含選自以SEQ ID NOs :4、9和10列出的氨基酸序列的氨基酸 序列。在另一個實施方式中本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的新型VSV M蛋白的核苷酸序列。該核 苷酸序列可選自以SEQ ID NOs :2、6和7列出序列組。
[0145] 預(yù)防或治療感染的方法 提供了一種誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、預(yù)防或治療感染的方法。在一個實施方式中，該方法可以包 括對受試者施用：(a)有效量的包含一種血清型的減毒rVSV的一種疫苗，該一種血清型的 減毒rVSV具有⑴第一改性的M蛋白，該第一改性的M蛋白包含SEQ ID NO :3的氨基酸 序列，該SEQ ID NO :3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R，和（ii)病原體的表位；和 (b)有效量的包含另一種血清型的減毒rVSV的另一種疫苗，該另一種血清型的減毒rVSV 具有：（i)第二改性的M蛋白，該第二改性的M蛋白包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該 SEQ ID N0:8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R，和（ii)病原體的表位。在本發(fā)明的 實施方式中，該方法可以包括在初步-加強免疫模式中對受試者施用（a)有效量的rVSV Ind M(G21E/L111F/M51R)，和（b)有效量的rVSVNJ M(G22E/M48R+M51R)或rVSVNJ M(G22E/L110F/ M48R+M51R)。
[0146] 本文使用的術(shù)語"有效量"表示有效和以劑量存在且在一段時間內(nèi)需要達到期望 結(jié)果的量。
[0147] 在某些實施方式中，在對受試者施用（b)之前對受試者施用（a)。
[0148] 在某些實施方式中，在治療或預(yù)防過程中對受試者施用（b)多于一次。
[0149] 在某些實施方式中，對有需要的受試者施用（a)并在施用（a)后約第3周、第8周 和第16周對有需要的受試者施用（b)。
[0150] 在某些實施方式中，在對受試者施用（a)前對受試者施用（b)。
[0151] 在某些實施方式中，在治療或預(yù)防過程中對受試者施用（a)多于一次。
[0152] 在某些實施方式中，對有需要的受試者施用（b)并在施用（b)后約第3周、第8周 和第16周對有需要的受試者施用（a)。
[0153] 重組病毒 在某些實施方式中，本發(fā)明涉及重組水皰性口炎病毒（rVSV)，其可以是全長的VSV，基 本上非細胞溶解的，無致病性的，能夠在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，能夠在允許溫度下復(fù)制病 毒顆粒至高滴度、在半允許溫度下復(fù)制病毒顆粒至低滴度，以及在非允許溫度下可以不能 生產(chǎn)病毒，且其能夠表達外源病原體的表位。本發(fā)明的rVSV可以能夠誘導(dǎo)體液、細胞和粘 膜免疫應(yīng)答。
[0154] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及rVSVInd和rVSVw。該rVSV Ind可以是全長的、基本 上非細胞溶解的rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)，其能夠在約31°C的允許溫度下生產(chǎn)病毒顆 粒，且其可以在約37°C的半允許溫度下不能或很弱地生產(chǎn)病毒顆粒，以及在高于37°C、例 如39°C的非允許溫度下不能生產(chǎn)病毒顆粒。在某些實施方式中，rVSV Ind可以包括M(G21E/ L111F/M51R)。在某些實施方式中，rVSVInd可以包括含有核苷酸序列SEQ ID NO :2的M基 因。
[0155] 在某些實施方式中，rVSV是全長的、基本上非細胞溶解的rVSVw M (G22E/ M48R+M51R)或M(G22/L110F/M48R+M51R)。在某些實施方式中，rVSV是基本上非細胞溶解 的rVSV w，其包括M基因，其中M基因的核苷酸序列選自SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7。
[0156] 本發(fā)明的rVSVs可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。在一個實施方式中，rVSVs可在 適于rVSV在宿主中復(fù)制和表達的條件下被引入宿主細胞。從而，本發(fā)明還提供了一種細 胞，其具有rVSV Ind，其中病毒的M蛋白的氨基酸序列被改性以提供基本上非細胞溶解性，且 還允許rVSVInd在允許溫度下有效復(fù)制但在非允許溫度下不能復(fù)制。
[0157] 從而，本發(fā)明還涉及具有一種或多種本發(fā)明的重組VSVs的細胞。 本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物 本發(fā)明進一步以包含一種或多種本發(fā)明的rVSVs的疫苗或免疫原性組合物為特征。在 一個實施方式中，本發(fā)明以如上所述的包含rVSVInd的疫苗或免疫原性組合物和包含rVSVw 的疫苗或免疫原性組合物為特征。
[0159] 在一個實施方式中，疫苗可以包括表達一種病原體的一種表位的rVSVs。在另一個 實施方式中，疫苗可以包括表達一種病原體的不同表位的混合物或混合劑（cocktail)(見 表6,接種組5和6)。
[0160] 本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物適于在體內(nèi)以生物相容性的形式給予受試者。本 文使用的"適于在體內(nèi)以生物相容性的形式給予"這一表述意味著待給予的物質(zhì)的一種形 式，其中治療效果超越了任何的毒性效應(yīng)。這些物質(zhì)可被給予任何動物或受試者，優(yōu)選人 類。本發(fā)明的疫苗還可以作為可被冷凍運輸?shù)娜芤哼M行提供。此外，疫苗可含有合適的防腐 齊IJ，如甘油，或者可以不用防腐劑進行配制。如果合適的話（即，對疫苗中的VSV沒有損害)， 疫苗還可以含有合適的稀釋劑、佐劑和/或載體。
[0161] 疫苗的劑量可根據(jù)例如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重以及在個體內(nèi)抗體產(chǎn) 生期望應(yīng)答的能力等因素進行變化。還可以對疫苗的劑量進行變化以基于環(huán)境提供最優(yōu)的 劑量應(yīng)答。
[0162] 試劑盒 本發(fā)明提供了用于例如預(yù)防或治療感染的試劑盒。例如，試劑盒可以包含一種或多種 如上所述的藥物組合物或疫苗和可選的其使用說明。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了 包含一種或多種藥物組合物或疫苗和一種或多種用于實現(xiàn)這些組合物給藥的裝置的試劑 盒。
[0163] 對試劑盒組件進行包裝，以用于手動或半自動或全自動地實踐前述方法。在涉及 試劑盒的其它實施方式中，本發(fā)明預(yù)期（contemplate) 了包括本發(fā)明組合物的試劑盒和可 選的其使用說明。這些試劑盒可具有多種用途，包括，例如造影、診斷、治療和其它應(yīng)用。
[0164] 本發(fā)明rVSVs的優(yōu)點和獨特特征 本發(fā)明的新的和不尋常的特征： rVSVInd M(G21E/L111F/M51)在允許溫度下（約31°〇的常規(guī)組裝和釋放使其可能在允 許溫度下擴增新型突變體rVSVs至高滴度以制造病毒儲備（stock) ^VSVlnd M (G21E/L111F/ M51)在非允許溫度（約37° C (體溫左右））下的組裝缺陷通過在非允許溫度下顯著降低后 代感染病毒的數(shù)量增加了在人和其它動物中使用rVSV的安全性。在rVSV IndM蛋白中之前 存在M5IR突變下增加這些突變進一步減輕了 VSVlnd的毒性。
[0165] 在 rVSVNJ 的]? 蛋白中的三突變 M(G22E/M48R+M51R)或四突變 M(G22E/L110F/ M48R+M51R)沒有使得病毒對于病毒組裝溫度敏感。然而，對M48R+51R突變增加 G22E突變 或G22E/L110F使得VSVw更加減毒并顯著減少致病性。
[0166] 以上公開內(nèi)容大概描述了本發(fā)明?？蓞⒖枷率鼍唧w實施例獲得更全面的了解。描 述這些實施例僅用于闡釋，不意味著限制本發(fā)明的范圍。按照條件可能建議的或作為權(quán)宜 之用也預(yù)期了形式的變化和等效物替換。雖然本文使用了具體的術(shù)語，但是這些術(shù)語被用 作描述性的含義，而非用于限制。 實施例
[0167] 通過下述實施例對本發(fā)明進行了進一步闡釋，其不應(yīng)以任何形式被解釋為限制性 的。
[0168] 實施例1 -向rVSVInd和基因中引入突變和通過反向遺傳學(xué)回收重組 VSV 向VSVlnd (圖1)和VSVw (圖2)的M基因中引入突變。在各位點編碼氨基酸的核苷 酸序列通過大引物（mega-primer)PCR方法進行突變。每個突變表達為在一個具體位點處 的一個氨基酸（例如，M51R中的M51)被另一個氨基酸（例如，M51R中的R)取代物。為了 進一步減輕VSV的毒性，發(fā)明人將ts023中的突變（G21E和LllF)與M基因中的甲硫氨酸 至精氨酸突變（M51R)進行了組合，后者減少了 M蛋白對細胞蛋白合成的抑制活性，此外，還 降低了 VSV顆粒在非允許（39 °C)和半允許（37 °C)溫度下的組裝。rVSVInd和 基因中核苷酸序列和氨基酸從野生型至突變體的變化見于表2、3、4和5。改變的核苷酸密 碼子用下劃線標出，改變的核苷酸序列和氨基酸序列用粗體標出。
[0169] 通過反向遺傳學(xué)從cDNA質(zhì)粒回收野生型和突變體重組水皰性口炎病毒（rVSV) (圖3KVSV反向遺傳學(xué)應(yīng)用了表達噬菌體T7 (T7)的DNA依賴的RNA聚合酶的BHK21細胞， 和編碼VSV全長基因組RNA (pVSV)的一個質(zhì)粒以及表達核殼體蛋白（pN)、磷酸蛋白（pP)和 VSV聚合酶L蛋白（pL)的3個質(zhì)粒。全長基因組RNA和N、P和L蛋白的信使RNA的轉(zhuǎn)錄 處于T7 RNA聚合酶的控制之下。位于每個VSV的N、P和L基因上游的內(nèi)部核糖體進入位 點（IRES)增強了蛋白的翻譯。將質(zhì)粒用Lipofectamine? 2000以10 μ g的ρΝ、10 μ g的 ρΡ、5 μ g的pL和15 μ g的pVSV的濃度轉(zhuǎn)染入BHK-T7細胞。當細胞表現(xiàn)出約50-70%的 CPE時收集被轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基。
[0170] 實施例2 -M基因中的突變LlllF在半允許溫度37° C下顯著降低rVSVInd的裂 解量 回收的病毒通過挑噬菌斑純化3次，并通過在31°C下以0. 1的MOI感染BHK21細胞擴 增得到更大體積的存儲病毒。發(fā)明人以MOI為3的rVSVs感染了 BHK21細胞和人成神經(jīng)細胞 瘤細胞SH-SY5Y。在允許的溫度（3Γ C)和半允許溫度（37° C，體溫）下培養(yǎng)感染的細胞 以測定新型M突變體在病毒顆粒組裝中的溫度敏感性。在感染后每2小時從受感染細胞收 集培養(yǎng)基直至10小時，通過用Vero E6細胞進行噬菌斑分析測定感染性病毒顆粒的數(shù)量。 用于噬菌斑分析的受到突變體病毒感染的細胞在3Γ C下培養(yǎng)。在整個10小時的感染中 野生型和所有突變體均同等良好地復(fù)制并產(chǎn)生相似的感染性病毒滴度（圖4A和C)。然而， 突變體 rVSVInd、rVSVInd-G21E/L111F 和 rVSVInd-G21E/L111F/M5IR在 37° C 下以較之 rVSVInd 的 野生型或M51R突變體顯著更低的滴度復(fù)制。野生型和新型M突變體rVSVInd-G21E/LlllF/ M51R之間生產(chǎn)感染性顆粒的差異程度大至4個log(圖4B和D)。圖4中的誤差條表示均 值的標準差。在圖4B中感染后4小時、6小時、8小時和10小時的rVSV Ind-G21E/LlllF/ M51R的病毒滴度的P值(通過將其與rVSVInd-WT的滴度相比獲得）為p〈0. 0001、p=0. 0055、 p=0. 0040和p=0. 0015。在圖4B中感染后4小時、6小時、8小時和10小時的rVSVInd-G21E/ LlllF的病毒滴度的P值(通過將其與rVSVInd-WT的滴度相比獲得)為p〈0. OOOUp=O. 0055、 ρ=0· 0041和ρ=0· 0016。圖4D中的P值為〈0· 005。通過使用雙方（two-sided)獨立t檢驗 計算P值。
[0171] 實施例3-rVSVwM基因中的突變G22E和L110F在37°C下不降低rVSVw的裂 解量。
[0172] 以MOI為3的野生型和M基因突變體rVSVs感染BHK21細胞。在37。C (半允許 溫度）和3Γ C (允許溫度）下培養(yǎng)，在感染后10小時收集培養(yǎng)基。通過用Vero E6細胞 進行噬菌斑分析測定每種病毒的病毒滴度。表中顯示了來自平行樣本的平均病毒滴度。在 31° C和37° C兩種溫度下野生型和所有rVSVw的M突變體均同等良好地復(fù)制（圖5)，表明 在rVSVwM基因中引入G22E和LllOF突變沒有影響37°C下的病毒組裝和釋放。圖5中的 誤差條表示均值的標準差。
[0173] 實施例4 -rVSVInd M基因中的LlllF突變所導(dǎo)致的在半允許的溫度下的組裝缺 陷不影響VSV蛋白的表達 以MOI為6的野生型和M基因突變體rVSVInd和rVSVw感染BHK21細胞。感染的細胞 在37° C和3Γ C下培養(yǎng)6小時。感染后6小時裂解感染的細胞，在SDS-PAGE凝膠上載5 μ g的總蛋白，通過蛋白質(zhì)印跡分析使用兔抗VSVlnd和VSVw血清（1:5000稀釋）檢測rVSV 蛋白。結(jié)果顯示雖然存在使得rVSVInd在37° C下的裂解量降低的突變（G21E/L111F和 G21E/L111F/M51R中的L111F)，但是VSV的蛋白表達水平仍與野生型rVSVInd相當（圖6A)。 野生型和所有rVSV w的M突變體在31°C和37°C下均以相似的水平表達其蛋白（圖6B)。
[0174] 實施例5 - rVSVIndM基因中的組合突變G21E/L111F/M51R顯著降低在BHK21細 胞和人成神經(jīng)細胞瘤細胞SH-SY5Y中的細胞致病性。
[0175] 為了考察rVSVInd的M基因的LlllF和M5IR突變對細胞致病性的影響，發(fā)明人 以0· 1的rVSVInd MOI感染了 BHK21細胞（圖7)和人成神經(jīng)細胞瘤細胞（圖8)。VSV的典 型細胞病變效果是受感染細胞的聚集（rounding-up)和細胞裂解。感染20小時后，將由 rVSVInd-G21E/LlllF/M51R導(dǎo)致的細胞病變效果與其它rVSVInd導(dǎo)致的效果進行了對比。在 20小時感染中rVSV Ind-G21E/L111F/M5IR突變體表現(xiàn)出細胞病變效果減少最多，37° C下無 聚集細胞或少量聚集細胞，突變LlllF和M51R(圖7N和圖8L)的組合較之每種單一突變進 一步減輕了病毒在BHK21和SH-SY5Y細胞中的細胞致病性。
[0176] 實施例6 -具有M基因突變G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R的rVSVNJ 導(dǎo)致的BHK21細胞中減少的細胞病變效果。
[0177] 為了考察rVSVw的11基因的G22E、LllOF和M48R+M51R突變對細胞致病性的影 響，發(fā)明人以0.1的rVSV w MOI感染了 BHK21細胞（圖7)和人成神經(jīng)細胞瘤細胞。感染 20小時后，發(fā)明人比較了由rVSVw野生型和其它M突變體導(dǎo)致的細胞病變效果（細胞聚集 和裂解）。在20小時感染中G22E/M48R+M51R突變體和G22E/L110F/M48R+M51R突變體表 現(xiàn)出最小的37°C下細胞病變效果，突變G22E和M48R+M51R的組合進一步減輕了 rVSVNJ在 BHK21 (圖9L和9N)和SH-SY5Y細胞（圖IOL和10N)中的細胞致病性。
[0178] 實施例7 -在M蛋白具有G21E/L111F/M51R突變的rVSVInd和具有G22E/ M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R突變的rVSVw被減毒至在腦部注射該病毒的小鼠沒 有表現(xiàn)出神經(jīng)病學(xué)跡象或任何癥狀(例如體重減輕）的程度。
[0179] 在通過皮膚磨損或白蛉或蚊子叮咬導(dǎo)致的天然感染中，VSV在宿主動物中未表現(xiàn) 出趨向神經(jīng)性。然而，當野生型VSV被直接注射入小鼠或猴子的鼻子或腦部時，這些動物表 現(xiàn)出神經(jīng)病學(xué)癥狀。為了考察VSVs新型M突變體的神經(jīng)毒性，發(fā)明人在瑞士韋伯斯特小 鼠腦部的內(nèi)側(cè)（intralateral)腦室注射了 IXlO6 PFU的突變體VSV和IXlO3 PFU的野生型 VSV。發(fā)明人從Charles River實驗室購買了 5周大的具有內(nèi)側(cè)腦室移植的瑞士韋伯斯特小 鼠。在到達動物籠一周后用病毒注射三只小鼠/組。病毒注射后，觀察小鼠的神經(jīng)病學(xué)跡 象，并每兩天稱重，共4周。注射IXlO 3 PFU的野生型rVSVInd的小鼠在注射后4天死亡（圖 11B)。注射IXlO6 PFU的rVSVInd-M51R(圖11C)的兩只小鼠在注射6天后減輕了約20%的 體重，且在注射后約14天體重反彈回正常重量。注射rVSV Ind-M51R的1只小鼠在試驗中沒 有減輕體重。注射rVSVInd-G21E/LlllF/M51R的所有三只小鼠在直至小鼠被處死前的4周 內(nèi)均未表現(xiàn)出生病跡象，也沒有減輕體重（圖11D)，表明突變G21E/L111F和M51R的組合顯 著減毒了 rVSVInd并使其失去了在小鼠中的神經(jīng)毒性。注射rVSVw-WT的1只小鼠表現(xiàn)出兩 條后腿麻痹，其在注射后第6天被處死（圖12A)。注射rVSVw-WT的其它2只小鼠和注射 rVSVw-M48R+M51R、rVSVw-G22E/M48R+M51R 或 rVSVw-G22E/Ll 10F/M48R+M51R 的小鼠在注射 后4周內(nèi)均未表現(xiàn)出生病跡象，也沒有減輕體重（圖12B、12C和12D)。圖11和12中的誤 差條表不均值的標準差。
[0180] 實施例8 -表達HIV-I Gag蛋白作為目標基因的rVSVs的產(chǎn)生；HIV-I Gag蛋白 在31° C和37° C同等良好表達。
[0181] 新產(chǎn)生的 M 突變體，rVSVInd 的 G21E/L111F/M51R 突變體和 rVSVw 的 G22E/ M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R突變體表現(xiàn)出與野生型rVSV相比在37。C下的降低 的細胞致病性和相當?shù)牡鞍妆磉_。為了作為疫苗載體使用，rVSV的新型M突變體應(yīng)當在體 內(nèi)誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答，無論是體液還是細胞免疫應(yīng)答。當HIV-I gag蛋白在細胞中單獨 表達時，其產(chǎn)生病毒樣顆粒，且該病毒樣顆粒從細胞中分泌。從而，gag蛋白是適于從rVSV 的新型M突變體表達以考察細胞和體液免疫應(yīng)答的蛋白。此外，CD8+細胞毒性T細胞表位 HIV-I Gag 中的 H-2Kd-限制肽（Nh2-Amqmlketi-COOH) (SEQ ID NO :33)已在 Balb/c 小鼠 中充分研究。發(fā)明人插入了連接至來自Hiv-I的gp41、gpl20和nef蛋白的保守性人⑶8+ T細胞表位的全長HIV-I?基因（Gag-En)。Gag-En基因被插入至rVSVInd的野生型（WT) 和 G21E/L111F/M51R (GLM)以及 rVSVw 的野生型、G22E/M48R+M51R (GM)和 G22E/L110F/ M48R+M51R(GLM)的全長cDNA克隆中的G基因和L基因的連接處。按照圖3的描述利用反 向遺傳學(xué)從cDNA克隆回收rVSVs，通過蛋白質(zhì)印跡分析使用抗HIV-I p24單克隆抗體考察 Gag-En從rVSVs的表達。為了進行蛋白質(zhì)印跡分析，用MOI為6的rVSVs感染BHK21細胞并 在3Γ C和37° C下培養(yǎng)，感染后6小時制備細胞裂解物。對SDS-PAGE上載5 μ g的總蛋 白用于蛋白質(zhì)印跡分析。rVSVInd (GLM) -Gag-En、rVSVNJ (GM) -Gag-En 和 rVSVNJ(GLM) -Gag-En 在半允許的溫度下（37°C，圖13C)良好地表達了 Gag-En蛋白（64 kDa)，且表達水平與在允 許的溫度下（31°C，圖13B)相似。
[0182] 實施例9 -在小鼠中的rVSV接種方案 對每組6只Balb/c小鼠接種圖14中描述的初免-加強方案。根據(jù)疫苗載體種類（野 生型vs.突變體）和方案對小鼠進行分組，例如，用相同血清型的rVSV進行初免和加強或 兩種血清型交替用于初免和加強。小鼠在6周大時用5X10 6 PFU的rVSVs進行肌肉內(nèi)初免 接種。初免后3周，用與初免接種相同的劑量對小鼠進行加強接種。加強注射后1周，收集 脾細胞和血清檢測HIV-I Gag特異性⑶8+ T細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。
[0183] 實施例 10 -用 rVSVInd (GLM)-HIV-I Gag-En 初免和 rVSVw (GLM)-HIV-I Gag-En 加強誘導(dǎo)了針對HIV-I Gag的最強⑶8+ T細胞免疫應(yīng)答。
[0184] 由與負載MHC I分子的抗原呈遞細胞上的所述肽相互作用所刺激的T細胞增 強了干擾素 -Y (IFN-γ)的分泌，其表明了抗原特異性T細胞免疫應(yīng)答。對脾細胞用 FITC-抗-⑶8和APC-抗-IFN-γ雙重染色用于具有增加的胞內(nèi)INF-γ的⑶8+ T細胞。 為了考察HIV-I Gag蛋白特異性CD8+ T細胞免疫應(yīng)答，將脾細胞分離，用H-2Kd-限制性 Hiv-I Gag 肽 nh2-amqmlketi-cooh (seq id no :33)刺激 IXio6 細胞，用 FiTC 大鼠抗-小 鼠 CD8染色細胞用于CD8分子，用APC大鼠抗-小鼠 IFN- γ染色用于胞內(nèi)IFN- γ。在染色 IFN-Y前用Brefeldin A封閉其分泌。使用核殼體特異性肽IN275:NH2-MPYLIDFGL-C00H (SEQ ID NO :32)考察VSV特異性CD8+ T細胞免疫應(yīng)答。用流式細胞儀FACSCalibur對 肽特異性CD8+-IFN- γ + T細胞計數(shù)。用DMSO (肽的溶劑，圖15)處理的脾細胞沒有刺激 ⑶8+ T細胞，表明用VSV N肽和HIV-I Gag肽處理脾細胞特異性刺激了圖16和圖17中的 ⑶8+ T細胞。通過交替rVSV (WT)或rVSV (GLM)突變體兩種血清型進行初免和加強免疫誘 導(dǎo)了比組1、2、5、6、9和10所示的使用單一 rVSV血清型的初免和加強免疫更強的針對VSV 以及HIV-I Gag蛋白的⑶8+ T細胞免疫應(yīng)答（圖16和圖17)。對于接種新型M突變體或 rVSV，當小鼠用rVSVInd (GLM)-Gag初免接種和rVSVw (GLM)-Gag加強時，較之相反順序而言 ⑶8+ T細胞針對HIV-I Gag蛋白的應(yīng)答被更好地誘導(dǎo)（圖17,組別6 vs組別10)。通過使 用雙方（two-sided)獨立樣本t檢驗計算圖17中組別6的P值，將結(jié)果與組別10的進行 對比。圖16和17中的誤差條表示均值的標準差。
[0185] 實施例11 - HIV-I Gag特異性體液免疫應(yīng)答 在加強免疫后一周收集血清考察HIV-I Gag特異性抗體的產(chǎn)生。通過間接的酶聯(lián)免疫 吸附分析（ELISA)測定Gag特異性抗體滴度。對于ELISA，用重組p55包被96孔ELISA板， 濃度125 ng/孔。小鼠血清稀釋1:100?？贵w結(jié)合至抗原，用第二抗體綿羊抗小鼠 IgG-HRP 檢測P55。通過加入底物過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺的混合物檢測HRP的酶活性。用酶標 儀在波長450處讀出每個樣品的0D。在用新型M突變體接種的小鼠中很好地誘導(dǎo)了針對 HIV-I Gag的體液免疫應(yīng)答（產(chǎn)生針對HIV-I Gag的抗體），當兩種血清型的rVSV (WT)或 rVSV(GLM)交替用于初免和加強注射時，誘導(dǎo)了針對HIV-I Gag最優(yōu)的體液免疫應(yīng)答（圖 18,組別5、6、9和10)。對于利用新型M突變體用于誘導(dǎo)針對外源蛋白的體液免疫應(yīng)答而言， 用rVSV Ind (GLM) -Gag進行初免和用rVSVw(GLM) -Gag進行加強較之相反順序表現(xiàn)更佳（圖 18,組別6 vs組別10)。圖18中的誤差條表示均值的標準差。
[0186] 實施例12 -接種增加劑量的rVSVInd(GLM)、rVSVw(GM)和rVSVw (GLM)在小鼠中 誘導(dǎo)了更強的免疫應(yīng)答。
[0187] 如圖17和圖18所示，當小鼠用rVSVInd(GLM) -Gag初免接種并用rVSVw(GLM) -Gag 進行加強接種時，誘導(dǎo)了更強的HIV-I Gag特異性CD8+ T細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。 然而該免疫應(yīng)答弱于用rVSVInd(WT)-Gag和rVSVw(WT)-Gag誘導(dǎo)的應(yīng)答。因此，發(fā)明人期望 考察如果他們增加 rVSVInd (GLM) -Gag和rVSVw (GLM) -Gag的劑量，其能否增強免疫應(yīng)答。用 rVSVInd (GLM) -Gag接種6周大的Balb/c小鼠，6只小鼠/組用于初免，用rVSVw (GLM) -Gag或 rVSVw(GM)-Gag用于加強。因為在體外和體內(nèi)rVSVw(GM)與rVSVw(GLM)同樣減毒，發(fā)明人 包括了 rVSVw (GM)-Gag作為加強病毒，并將其免疫應(yīng)答與通過rVSVw (GLM)-Gag誘導(dǎo)的免疫 應(yīng)答進行了對比。用各種劑量的 rVSVInd (GLM) -Gag、rVSVw (GLM) -Gag 和 rVSVw (GLM) -Gag 接 種小鼠組；5X106 PFU/ 小鼠、5X107 PFU/ 小鼠、5X108 PFU/ 小鼠和 5X109 PFU/ 小鼠（表 1)。
[0188] 根據(jù)圖14所示日程接種小鼠，在加強接種一周后處死獲得脾細胞和血清。對脾細 胞用FITC-抗-⑶8和APC-抗-IFN- γ雙重染色用于具有增加的胞內(nèi)INF- γ的⑶8+ T細 胞。為了考察HIV-I Gag蛋白特異性⑶8+ T細胞免疫應(yīng)答，將脾細胞分離，用H-2Kd-限制 性Hiv-I Gag肽nh2-amqmlketi-cooh (seq id no :33)刺激IXio6細胞，用FiTC大鼠抗-小 鼠 CD8染色細胞用于CD8分子，用APC大鼠抗-小鼠 IFN- γ染色用于胞內(nèi)IFN- γ。在染色 IFN-Y前用Brefeldin A封閉其分泌。使用核殼體特異性肽IN275:NH2-MPYLIDFGL-C00H (SEQ ID NO :32)考察VSV特異性CD8+ T細胞免疫應(yīng)答。用流式細胞儀FACSCalibur對肽 特異性⑶8+-IFN- γ + T細胞計數(shù)。
[0189] 在接種不同劑量的 rVSVInd (GLM) -Gag、rVSVw (GLM) -Gag 或 rVSVw (GM) -Gag 的所有 接種組中，針對VSV N蛋白的CD8+ T細胞免疫應(yīng)答都非常相似（圖19)。用rVSVInd(GLM)-Gag 初免接種和rVSVw (GLM) -Gag加強后的HIV-I Gag特異性⑶8+ T細胞免疫應(yīng)答在增加疫苗 劑量時看起來有所增加，但區(qū)別不是統(tǒng)計學(xué)顯著的（圖20,組別2、3、4、5)。然而，當小鼠用 rVSVInd(GLM) -Gag初免和用rVSVw (GM) -Gag加強接種時，HIV-I Gag特異性CD8+ T細胞的 頻率隨著增加的劑量（5X108 PFU)而顯著增加。在用5X109 PFU/小鼠接種的組別中HIV-I Gag特異性⑶8+ T細胞應(yīng)答最強（圖20,組別6、7、8、9)。使用雙方獨立樣本t檢驗計算 圖20中組別8和9的P值，將組別8的結(jié)果與組別7對比，組別9的結(jié)果與組別8對比。圖 19和20中的誤差條表不均值的標準差。
[0190] 針對HIV-I Gag蛋白的抗體的產(chǎn)生隨著用于初免的rVSVInd (GLM) -Gag和用于加強 的 rVSVw (GLM) -Gag 或 rVSVw (GM) -Gag 劑量的增加而增加（圖 21)。用 rVSVw (GLM) -Gag 或 用rVSVw(GM)-Gag加強接種在病毒的各種劑量中產(chǎn)生了相似水平的Gag特異性抗體。圖21 中的誤差條代表均值的標準差。
[0191] 實施例 13 -表達 HIV-I 蛋白 Gag、Pol、Env 和 RT 的 rVSVInd (GLM)和 rVSVNJ (GM) 的產(chǎn)生 對于利用rVSVInd(GLM)和rVSVw(GM)作為疫苗載體的HIV-I疫苗，發(fā)明人包括了編碼 大部分大聚蛋白（large polyprotein)的HIV基因，其被裂解為功能蛋白Gag和Env以及 具有酶活性的蛋白基因產(chǎn)物）。此外，HIV-I ?基因被連接至人體內(nèi)編碼T細胞和 B細胞的肽表位的核苷酸。發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了具有編碼HIV-I Gag的盒（cassettes)的 rVSVInd(GLM)和rVSVw(GM)，所述HIV-I Gag連接至源于多病毒外殼的HIV Env蛋白的B細 胞表位（圖22)。發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了 rVSVInd(GLM) -Gag-En和rVSVw(GM) -Gag-En，其表達濟設(shè) 基因和來自Nef、Gpl20和Gp41的T細胞肽表位（圖23)。發(fā)明人產(chǎn)生了具有HIV-I Gag-RT 的rVSVInd (GLM)和rVSVw (GM)，其編碼具有來自RT、Tat和Rev蛋白的肽表位的gag蛋白（圖 23)。此外，發(fā)明人產(chǎn)生了分別具有基因和基因的rVSV Ind(GLM)和rVSVw(GM)(圖 23)。之前，發(fā)明人已證實用蜜蜂蜂毒信號肽替換HIV-I包膜蛋白的信號肽顯著增加 Gpl20 表達、糖基化和分泌的比率（Yan Li等人，PNAS，93 :9606-9611,1996)。Gpl20增加的表達和 分泌被期望能增強針對HIV-I gpl20的T細胞和B細胞免疫應(yīng)答誘導(dǎo)。因此，發(fā)明人產(chǎn)生了 具有具有蜂毒信號序列（gpl60mss)的HIV-I env基因的rVSVs。對具有HIV-I蛋白的重組 VSVs進行噬菌斑純化并擴增以儲存病毒。HIV-I蛋白在31 °C和37 °C下從突變體VSV的 表達通過蛋白質(zhì)印跡分析進行檢測。用來自多種HIV-I蛋白的T細胞和B細胞表位標記的 Gag蛋白在31°C和37°C下均從rVSVInd(GLM)和rVSVw(GM)中良好表達（圖24和圖25)。 rVSV基因組中克隆的HIV-I 基因編碼聚蛋白，其被裂解為蛋白酶（PR, pll)、逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT，p66/p51)和整合酶（IN，p31)。發(fā)明人檢測了 RT產(chǎn)物的兩個亞單位，p66和p51。p51 通過蛋白水解裂解一個位于羧基端的pl5的片段產(chǎn)生自p66。RT產(chǎn)物p66和p51在31 °C 和37 °C下從rVSVInd(GLM)和rVSVw(GM)中同等良好表達（圖26)?；蚓幋a糖蛋白 Gpl60,其被裂解為受體結(jié)合蛋白Gpl20和融合誘導(dǎo)細胞質(zhì)和跨膜蛋白gp41。Gpl60由細胞 轉(zhuǎn)運高爾基體停留蛋白酶furin裂解。在BHK21細胞中從rVSV Ind(GLM)和rVSVw(GM)表達 的Gpl60不被裂解為Gpl20和Gp41，或裂解不是非常有效，雖然在31 °C和37 °C下表達水 平均良好（圖27)。我們之前關(guān)于Gpl60在BHK21細胞中表達和裂解為Gpl20和Gp41的數(shù) 據(jù)表明該過程不是非常有效（Kunyu Wu 等，Journal of General Virol. ,90:1135-1140， 2009)。
[0192] 實施例 14 -具有 HIV-I 蛋白 Gag、Gpl60 和 RT 的 rVSVInd(GLM)和 rVSVNJ(GM)在 小鼠中的免疫研究 對rVSVs新型M突變體rVSVInd (GLM)和rVSVw (GM)進行的初步初免-加強免疫研究表 明，用rVSVInd(GLM)初免小鼠并用rVSVw(GM)加強免疫較之相反方式誘導(dǎo)了更好的針對外 源基因的CD8+ T細胞免疫應(yīng)答（圖17)和體液免疫應(yīng)答（圖18)。用rVSVInd (GLM)-Gag初 免和rVSVw (GM)-Gag加強，每種病毒5X108 pfu的劑量比更低劑量誘導(dǎo)了更好的Gag特異 性CD8+ T細胞應(yīng)答，雖然針對Gag的B細胞應(yīng)答與低劑量誘導(dǎo)的相當（圖20和圖21)。發(fā) 明人選擇了 5X108 pfu 作為用于表達 HIV-I Gag、Gpl60 和 RT 的 rVSVInd(GLM)和 rVSVw(GM) 的免疫研究的劑量。
[0193] 發(fā)明人用表達HIV-I蛋白的rVSVInd(GLM)初免Balb/c小鼠，并在初免3周后用表 達HIV-I蛋白的rVSV w(GM)進行加強免疫，如表6所述。發(fā)明人考察了針對個別HIV-I蛋 白的免疫應(yīng)答是如何由表達分離蛋白的三種不同病毒的個別注射或混合注射誘導(dǎo)的。加強 免疫后一周，發(fā)明人將受免疫小鼠處死取脾細胞和血清。用H-2K d-限制性HIV-I蛋白特異 性肽Gag、Env P18、RT354、RT464和RT472刺激IXlO6的脾細胞。肽序列示于圖29。受刺 激的脾細胞用FITC大鼠抗-小鼠⑶8和APC大鼠抗-小鼠 IFN- γ雙重染色用于細胞表面 CD8分子和T細胞的胞內(nèi)IFN- γ。該方案，用rVSVInd(GLM)和rVSVw(GM)進行初免-加強免 疫誘導(dǎo)肽特異性CD8+ T細胞免疫應(yīng)答，其程度根據(jù)發(fā)明人用作刺激的肽而不同。針對Env 肽的⑶8+ T細胞刺激了最大的⑶8+ T細胞，高達19%-23%的平均⑶8+ T細胞（圖28,G3 和G5)。用只表達Gag的rVSV免疫（圖28, G2)或用混合的三種表達與多種HIV-I Gpl20 和Gp41的B和T細胞表位相連的Gag A、Gag B和Gag C的rVSVs免疫（圖29，G6)的小鼠 中，約4. 5%或3%的⑶8+ T細胞應(yīng)答了 Gag蛋白。在注射具有基因的rVSV的小鼠中 約2%的⑶8+ T細胞中產(chǎn)生了 RT特異性⑶8+ T細胞（圖28, G4)。當小鼠用表達個體蛋 白（圖28, G2和G4)的單一 rVSV注射時，⑶8+ T細胞針對個體HIV-I蛋白、Gag和RT的 應(yīng)答比用混合的表達單一蛋白（圖28，G5)的rVSVs更強。Env特異性⑶8+ T細胞應(yīng)答是 最強的，且在單一注射和混合注射中相似。CD8+ T細胞針對Env肽表位的應(yīng)答是Balb/c小 鼠中的主要免疫。目前，發(fā)明人不確定為何混合注射表達Gag、Env和RT的三種不同rVSVs 誘導(dǎo)了相對單一病毒注射較低的針對VSV N、gag和RT的⑶8+ T細胞應(yīng)答。有可能在混 合病毒注射中每種病毒對抗原呈遞細胞的競爭降低了針對Gag和RT的CD8+ T細胞。由于 rVSV是小鼠中與單一 rVSV或混合rVSVs注射的HIV-I蛋白的常見載體，預(yù)計VSV N在混 合注射中能誘導(dǎo)相似或更好的CD8+ T細胞應(yīng)答。然而，當表達Env時，小鼠中CD8+ T細胞 針對VSV N的應(yīng)答即使以單一注射（圖28, G3)也比混合注射更低（圖28, G5)。因此，其 可能是由于Env蛋白在Balb/c小鼠中的免疫優(yōu)勢的結(jié)果，當Env共同表達時其負面影響了 其它蛋白在CD8+ T細胞中的呈遞。對于小鼠中的組合免疫，所有三種rVSVs在單一位點注 射，其可能導(dǎo)致不同蛋白在相同抗原呈遞細胞中競爭抗原呈遞。發(fā)明人將在多于一個注射 位置混合注射誘導(dǎo)CD8+ T細胞應(yīng)答來測試免疫。
[0194] 細胞中表達的HIV-I Gag蛋白可形成病毒樣顆粒（VLP)，VLP可從細胞中被釋放。 釋放的VLPs可誘導(dǎo)針對Gag蛋白的體液免疫應(yīng)答。HIV-I 基因編碼糖基化表面蛋白， 其通過ER-高爾基體網(wǎng)加工進行適當折疊，并裂解為跨膜亞單位Gp41和表面單位Gpl20。 Gp41和Gpl20由非共價鍵連接并成熟形成Gp41和Gpl20異二聚體的三聚體。成熟的Gp41 和Gpl20三聚體被傳輸至細胞表面。由于Gp41和Gpl20之間的弱鍵，Gpl20易于從細胞 表面脫落。因此，針對Gpl20的抗體可以被誘導(dǎo)至細胞表面的Gpl20或脫落的Gpl20。針 對HIV-I Gag蛋白和Gpl20的抗體滴度通過ELISA檢測。對于Gag抗體，用125 ng/孔的 重組 p55 (Pierce Biotechnology，RP-4921)包被微板，50 μ 1 小鼠血清以 1:100、1:200 和1:400的稀釋度檢測。在注射單獨的rVSV Gag-En(圖30A，G2)和混合的病毒rVSV-Gag A+rVSV Gag B+rVSV Gag C (圖 30A，G6)的小鼠中產(chǎn)生了 Gag 抗體。對于 Gpl20 ELISA，用 250 ng/孔的來自B亞型的HIV-I SF162 GpHO三聚體（NIH AIDS試劑程序，編號12026) 包被96孔微板。小鼠血清以1:100、1:200和1:400稀釋，50 μ 1稀釋的血清被添加至微板 進行ELISA。在單獨注射rVSV-HIV-1 Gpl60的小鼠中和注射表達Gag、Gpl60和RT每種蛋 白（圖30B，G3和G5)的混合病毒的小鼠中產(chǎn)生了 Gpl20特異性抗體。在注射混合病毒的 小鼠中的Gpl20抗體滴度略低于注射表達Gpl60的單一病毒的，雖然其并非統(tǒng)計學(xué)顯著的。
[0195] 在用表達單一病毒的個體病毒或表達多種HIV-I蛋白的混合病毒注射小鼠后，新 產(chǎn)生的rVSVs M突變體rVSVInd(GLM)和rVSVw(GM)誘導(dǎo)了針對多種從載體中表達的HIV-I 蛋白的⑶8+ T細胞和體液免疫應(yīng)答。
[0196] 實施例15 -具有丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的rVSVInd (GLM)、rVSVw (GM)和rVSVw (GLM) 的產(chǎn)生 通常，體液免疫應(yīng)答是通過針對任何病原體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的第一條防線。雖 然針對HCV的體液免疫應(yīng)答及其在預(yù)防HCV感染中的作用較之HCV特異性細胞免疫應(yīng)答而 言沒有充分研究，但還是值得包括能夠誘導(dǎo)HCV特異性抗體的疫苗。已證實核殼蛋白核心 和表面糖蛋白El和E2形成了可從細胞中釋放的病毒樣顆粒（VLP) (Blanchard，E.等人， J. Virol. 76:4073-4079,2002)。此外，已證實HCV蛋白p7, 一種在ER膜上形成離子通道 的病毒孔蛋白（viroporin)，參與從受感染細胞中釋放HCV顆粒（Steinmann，E.等人，PLoS Pathogens 3:962-972,2007)。另一 HCV跨膜蛋白蛋白NS4B形成了一種膜狀網(wǎng)結(jié)構(gòu)，其主 要由ER膜組成。由NS4B形成的膜狀網(wǎng)是一種用于后代HCV生產(chǎn)的微結(jié)構(gòu)。不是非常清楚 NS4B在HCV復(fù)制中具有何種功能，但僅僅由于其形成集中其它HCV蛋白，特別是Core、E1、 E2、p7的ER膜狀結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，在候選疫苗中包括NS4B是有吸引力的。因此，在疫苗中一起 包括Core、El、E2、P7和NS4B可能誘導(dǎo)體液和細胞免疫應(yīng)答。
[0197] 對于使用新型rVSVsM突變體的HCV結(jié)構(gòu)蛋白疫苗，發(fā)明人將HCV core基因、 萬7^^7和#5湖基因一起（由VSV基因間接頭序列連接），和和#5湖基因一 起（由VSV基因間接頭序列連接）插入至VSV G基因和L的接頭處（圖31)。通過反向 遺傳學(xué)產(chǎn)生了下述 rVSVs :rVSVInd(GLM)-FC、rVSVInd(GLM)-CElE2P7/NS4B、rVSV w(GM)-FC 和 rVSVw(GLM)-ElE2P7/NS4B。發(fā)明人在從質(zhì)粒 DNA 產(chǎn)生具有 CE1E2P7/NS4B 的 rVSVw(GM)時 遇到困難，因此，發(fā)明人去除了核，并將E1E2P7/NS4B克隆入rVSV w(GLM)質(zhì)粒中，產(chǎn)生了 rVSVw(GLM)-ElE2P7/NS4B。使用針對每種蛋白的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析考察了在31°C 和37°C下Core、El、E2和NS4B從重組VSV中的表達（圖32)。在兩種溫度下蛋白表達量 相似。Core (圖 32A)、E1 (圖 32B)和 E2 (圖 32C)從 rVSVInd(GLM)-CElE2P7/NS4B 中良好 表達，但NB4B的表達低于其它蛋白（圖32D)。
[0198] 實施例 16 -具有 HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白的 rVSVInd (GLM)、rVSVNJ (GM)和 rVSVNJ (GLM)的 產(chǎn)生 發(fā)明人期望靶向大多數(shù)HCV蛋白，包括core、El、E2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B 蛋白，以針對多種蛋白誘導(dǎo)HCV特異性CD8+ T細胞和CD4+ T細胞免疫應(yīng)答。HCV非結(jié)構(gòu) (NS)蛋白-NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B涵蓋了超過一半的HCV聚蛋白。NS蛋白被NS3 在NS4A的幫助下裂解為個體蛋白。幾項研究證實從急性HCV感染恢復(fù)的患者針對NS3蛋 白中的多表位發(fā)展了強CD4+T細胞和CD8+T細胞應(yīng)答（Di印〇1(^1'，！1.1了.￥化〇1· 71:6011-6019,1997 ;Lamonaca， V.等人，Hepatology 30:1088-1098,1999 ;Shoukry， N. Η.等人，J. Immunol. 172:483-492,2004)，表明在候選疫苗中包括NS3對于找出針對HCV 的成功細胞免疫應(yīng)答是重要的。NS3蛋白，一種絲氨酸蛋白酶和RNA螺旋酶，其與NS4A關(guān)聯(lián) 并位于 ER 膜上（Sato，S.等人，J. Virol. 69:4255-4260，1995;Failla，C.等人，了.￥化〇1· 69:1769-1777,1995)。NS5A蛋白，一種磷蛋白，被認為與NS5B蛋白，一種RNA依賴的RNA聚 合酶一起涉及 HCV RNA 合成（Shirota，Y.等人，J. Biol. Chem. ,277:11149-11155, 2002; Shimakami，等人，J. Virol. 78:2738-2748,2004)。NS5B 蛋白是 RNA 依賴的 RNA 聚合酶， 其合成正義HCV基因組RNA并介導(dǎo)反義基因組RNA (Beherens，S. E. EMBO J. 15:12-22， 1996KNS5B蛋白是尾錨定蛋白并通過其羧端20個氨基酸與ER膜關(guān)聯(lián)（Yamashita，T. J. Biol. Chem. 273:15479-15486,1998 ；Hagedorn,C. H. Curr. Top. MicroBiol. Tmmunol · 242:225-260,2000)〇
[0199] 發(fā)明人克隆了 HCV NS基因作為用于單一蛋白的基因或用于2或3個NS蛋白的聚 蛋白的基因 。NS 基因 NS3、NS34AB、NS5A、NS5B、NS5AB 被克隆入 pVSVInd (GLM)和 pVSVw (GM)的 G基因和L基因的接頭處（圖33)。發(fā)明人產(chǎn)生了 rVSVInd(GLM)-NS3、rVSVInd(GLM)-NS34AB、 rVSVInd (GLM) -NS5A、rVSVInd (GLM) -NS5B 和 rVSVInd (GLM) -NS5AB，使用針對每種 NS 蛋白的抗 體進行蛋白質(zhì)印跡分析考察了在3Γ C和37° C下NS蛋白的表達（圖34)。發(fā)明人產(chǎn)生了 rVSVNJ (GM) -NS3、rVSVNJ (GM) -NS4B、rVSVNJ (GM) -NS34AB、rVSVNJ (GM) -NS5A、rVSVNJ (GM) -NS5B 和rVSVNJ (GM)-NS5AB。使用針對每種NS蛋白的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析考察了在37° C下 每種蛋白從rVSVw載體的表達（圖35)。雖然NS蛋白從rVSVInd和rVSV w中的表達水平不 同，但是足以使用它們作為HCV疫苗。
[0200] 表1.小鼠接種組和接種方案
【權(quán)利要求】
1. 一種水皰性口炎病毒（VSV)的改性的基質(zhì)（Μ)蛋白，其特征在于該改性的Μ蛋白包 含選自由下述組成的氨基酸序列：（i) SEQ ID Ν0:3,其至少包括下述取代物：G21E/L111F/ M51R;和（ii) SEQ ID Ν0:8,其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
2. 權(quán)利要求1的改性的Μ蛋白，其特征在于SEQ ID Ν0:8進一步包括以下取代物： L110F。
3. 權(quán)利要求1的改性的Μ蛋白，其特征在于所述改性的Μ蛋白包含選自由下述組成的 氨基酸序列：SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:9 和 SEQ ID Ν0:10。
4. 一種重組VSV (rVSV)，其特征在于所述rVSV包含改性的基質(zhì)（M)蛋白，該改性的Μ 蛋白包含選自由下述組成的氨基酸序列：（i) SEQ ID NO :3,其至少包括下述取代物：G21E/ L111F/M51R;和（ii) SEQ ID N0:8,其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
5. 權(quán)利要求4的rVSV，其特征在于該rVSV是表達外源病原體的蛋白的嵌合rVSV，且其 中所述嵌合rVSV能夠針對所述蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
6. 權(quán)利要求5的rVSV，其特征在于所述病原體是病毒、真菌、細菌或寄生蟲病原體。
7. 權(quán)利要求4的rVSV，其特征在于該rVSV基本上是非細胞溶解的和無致病性的。
8. 權(quán)利要求4的rVSV，其特征在于所述rVSV是重組水皰性口炎病毒印第安納血清型 (rVSVInd)，且其中改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，該SEQ ID NO :3至少包括 下述取代物：G21E/L111F/M51R。
9. 權(quán)利要求8的rVSV，其特征在于該改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列。
10. 權(quán)利要求8的rVSV，其特征在于該改性的Μ蛋白由包含SEQ ID NO :2的核苷酸序 列的基因編碼。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項的rVSV，其特征在于該rVSVInd能夠在允許的溫度下產(chǎn) 生VSV Ind顆粒，且不能在非允許的溫度下產(chǎn)生顆粒。
12. 權(quán)利要求4的rVSV，其特征在于所述rVSV是重組水皰性口炎病毒新澤西血清型 (rVSVw)，且其中改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該SEQ ID NO :8至少包括 下述取代物：G22E/M48R+M51R。
13. 權(quán)利要求12的rVSV，其特征在于改性的Μ蛋白由具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列 的基因編碼。
14. 權(quán)利要求12的rVSV，其特征在于改性的Μ蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :9。
15. 權(quán)利要求12的rVSV，其特征在于改性的Μ蛋白進一步包括以下取代物：L110F。
16. 權(quán)利要求15的rVSV，其特征在于改性的Μ蛋白由具有SEQ ID NO :7的核苷酸序列 的基因編碼。
17. 權(quán)利要求15的rVSV，其特征在于改性的Μ蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。
18. -種疫苗，其特征在于該疫苗包含有效量的一種或多種減毒rVSVs，該一種或多種 減毒rVSVs包括改性的基質(zhì)（M)蛋白，該改性的Μ蛋白包含選自由下述組成的氨基酸序列： (i) SEQ ID Ν0:3,其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R;和（ii) SEQ ID Ν0:8,其至 少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
19. 權(quán)利要求18的疫苗，其特征在于所述rVSV是重組水皰性口炎病毒印第安納血清型 (rVSVInd)，且其中改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，該SEQ ID NO :3至少包括 下述取代物：G21E/L111F/M51R。
20. 權(quán)利要求19的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列。
21. 權(quán)利要求19的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白由包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列 的基因編碼。
22. 權(quán)利要求19-20任一項的疫苗，其特征在于該rVSVInd能夠在允許的溫度下產(chǎn)生 VSVInd顆粒，且不能在非允許的溫度下產(chǎn)生顆粒。
23. 權(quán)利要求18的疫苗，其特征在于所述rVSV是重組水皰性口炎病毒新澤西血清型 (rVSVw)，且其中改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該SEQ ID NO :8至少包括 下述取代物：G22E/M48R+M51R。
24. 權(quán)利要求23的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白由具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列 的基因編碼。
25. 權(quán)利要求23的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :9。
26. 權(quán)利要求23的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白進一步包括以下取代物：L110F。
27. 權(quán)利要求26的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白由具有SEQ ID NO :7的核苷酸序列 的基因編碼。
28. 權(quán)利要求26的疫苗，其特征在于改性的Μ蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。
29. 權(quán)利要求18-28任一項的疫苗，其特征在于rVSV是表達外源病原體的蛋白的嵌合 rVSV，且其中所述嵌合rVSV能夠針對所述蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
30. 權(quán)利要求29的疫苗，其特征在于疫苗包含減毒嵌合rVSVs的混合物，其中混合物中 的至少兩種嵌合rVSVs表達外源病原體的不同蛋白。
31. 權(quán)利要求29的疫苗，其特征在于病原體是病毒、真菌、細菌或寄生蟲病原體。
32. 權(quán)利要求29的疫苗，其特征在于病原體是慢病毒。
33. 根據(jù)權(quán)利要求33的疫苗，其特征在于慢病毒是HIV且表位是HIV蛋白。
34. 權(quán)利要求29的疫苗，其特征在于病原體是HCV且表位是HCV蛋白。
35. 權(quán)利要求18-34任一項的疫苗，其特征在于所述疫苗能夠誘導(dǎo)體液、細胞和粘膜免 疫應(yīng)答。
36. 權(quán)利要求18-35任一項的疫苗，其特征在于所述疫苗進一步包括佐劑。
37. -種在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其特征在于該方法包含對受試者施用：(a) 有效量的包含一種血清型的減毒rVSV的一種疫苗，該一種血清型的減毒rVSV具有第一改 性的Μ蛋白，該第一改性的Μ蛋白包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，該SEQ ID NO :3至少 包括下述取代物：G21E/L111F/M51R;和（b)有效量的包含另一種血清型的減毒rVSV的另 一種疫苗，該另一種血清型的減毒rVSV具有第二改性的Μ蛋白，該第二改性的Μ蛋白包含 SEQ ID NO :8的氨基酸序列，該SEQ ID NO :8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
38. 權(quán)利要求37的方法，其特征在于第二Μ蛋白進一步包括以下取代物：L110F。
39. 權(quán)利要求37的方法，其特征在于在對患者施用（b)前對受試者施用（a)。
40. 權(quán)利要求39的方法，其特征在于在誘導(dǎo)過程中對受試者施用（b)多于一次。
41. 權(quán)利要求37的方法，其特征在于對受試者施用（a)和在施用（a)后約第3周、第8 周和第16周時對受試者施用（b)。
42. 權(quán)利要求37的方法，其特征在于在對受試者施用（a)前對受試者施用（b)。
43. 權(quán)利要求42的方法，其特征在于在誘導(dǎo)過程中對受試者施用（a)多于一次。
44. 權(quán)利要求42的方法，其特征在于對受試者施用（b)且在施用（b)后約第3周、第8 周和第16周時對受試者施用（a)。
45. 權(quán)利要求37的方法，其特征在于該兩種rVSVs是表達外源病原體的蛋白的嵌合 rVSV，且其中該兩種rVSVs能夠針對蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
46. 權(quán)利要求45的方法，其特征在于病原體是病毒、真菌、細菌或寄生蟲病原體。
47. 權(quán)利要求45的方法，其特征在于病原體是慢病毒。
48. 根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其特征在于慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。
49. 權(quán)利要求48的方法，其特征在于一種血清型的rVSV和另一種血清型的rVSV包括 表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于表達HIV蛋白的基因 是插入G基因和L基因之間的HIV基因。
50. 權(quán)利要求49的方法，其特征在于HIV基因選自由濟設(shè)、和組成的一組HIV 基因。
51. 權(quán)利要求45的方法，其特征在于病原體是HCV且蛋白是HCV蛋白。
52. 權(quán)利要求51的方法，其特征在于一種血清型的rVSV和另一種血清型的rVSV包括 表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于表達HCV蛋白的基因 被插入rVSV的G基因和L基因之間。
53. 權(quán)利要求45的方法，其特征在于該兩種疫苗包含減毒嵌合rVSVs的混合物，其中混 合物中的至少兩種減毒嵌合rVSVs表達病原體的不同蛋白。
54. 權(quán)利要求37-53任一項的方法，其特征在于兩種疫苗（a)和（b)的每一種都誘導(dǎo)體 液、細胞和粘膜免疫應(yīng)答。
55. 權(quán)利要求37-54任一項的方法，其特征在于疫苗（a)的一種血清型是印第安納且疫 苗（b)的另一種血清型是新澤西。
56. 權(quán)利要求37-54任一項的方法，其特征在于疫苗（a)和疫苗（b)的每一種進一步包 含佐劑。
57. -種初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于該初免-加強聯(lián)合疫苗包含：(a)有效量的 包含一種血清型的減毒rVSV的疫苗，該一種血清型的減毒rVSV具有包含SEQ ID NO:4的 氨基酸序列的第一改性的Μ蛋白；和（b)有效量的包含另一種血清型的rVSV的疫苗，該另 一種血清型的rVSV具有包含SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二改性的Μ 蛋白。
58. 權(quán)利要求57的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于第二Μ蛋白進一步包括以下取代 物：L110F。
59. 權(quán)利要求57的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于（a)是初免疫苗且（b)是加強疫 苗。
60. 權(quán)利要求57的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于（b)是初免疫苗且（a)是加強疫 苗。
61. 權(quán)利要求57的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于該兩種減毒rVSVs是表達外源病 原體的蛋白的嵌合rVSV，且其中該兩種嵌合rVSVs能夠針對蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
62. 權(quán)利要求61的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于病原體是病毒、真菌、細菌或寄生 蟲病原體。
63. 權(quán)利要求61的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于病原體是慢病毒。
64. 權(quán)利要求63的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。
65. 權(quán)利要求64的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于一種血清型的rVSV和另一種血 清型的rVSV包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于表達 HIV蛋白的基因被插入G基因和L基因之間。
66. 權(quán)利要求65的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于HIV基因選自由mr、?和/70/ 組成的一組HIV基因。
67. 權(quán)利要求61的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于病原體是HCV且表位是HCV蛋白。
68. 權(quán)利要求67的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于一種血清型的rVSV和另一種血 清型的rVSV包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴的RNA聚合酶（L)基因，且其中用于表達 HCV蛋白的基因被插入G基因和L基因之間。
69. 權(quán)利要求67的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于該HCV蛋白是結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)的HCV 蛋白。
70. 權(quán)利要求61-69任一項的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于兩種疫苗的每一種都包 含減毒嵌合rVSVs的混合物，且其中混合物中的至少兩種減毒嵌合rVSVs具有病原體的不 冋蛋白。
71. 權(quán)利要求57-70任一項的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于兩種疫苗的每一種都能 夠誘導(dǎo)體液、細胞和粘膜免疫應(yīng)答。
72. 權(quán)利要求57-71任一項的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于疫苗（a)的血清型是印 第安納且疫苗（b)的血清型是新澤西。
73. 權(quán)利要求57-72任一項的初免-加強聯(lián)合疫苗，其特征在于疫苗（a)和疫苗（b)的 每一種進一步包含佐劑。
74. -種試劑盒，包含：(a)至少一種劑量的有效量的包含rVSVInd的疫苗，該rVSV Ind具 有包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的改性的Μ蛋白，和（b)至少一種劑量的有效量的包含 rVSVw的疫苗，該rVSVw具有包含SEQ ID N0:9或SEQ ID N0:10的氨基酸序列的改性的Μ 蛋白。
75. 權(quán)利要求62的試劑盒，其特征在于（a)和（b)配制于一種藥學(xué)可接受的載體中。
76. -種分離的肽，其包含選自如SEQ ID N0s:4、9和10列出的氨基酸序列的組的氨 基酸序列。
77. -種用于編碼權(quán)利要求76的分離的肽的分離的核苷酸序列。
【文檔編號】C12N7/01GK104271594SQ201280070598
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月23日
【發(fā)明者】童勇·康, 京永·金 申請人:西安大略大學(xué)