生產(chǎn)自然殺傷細(xì)胞的方法、由該方法生產(chǎn)的自然殺傷細(xì)胞以及包含該自然殺傷細(xì)胞的用 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)自然殺傷細(xì)胞(下文中，簡稱“NK細(xì)胞”)的方法、由該方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞以及包含該NK細(xì)胞的用于治療癌癥和感染性疾病的組合物。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)NK細(xì)胞的方法，該NK細(xì)胞保持高細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性而對癌癥和感染性疾病展現(xiàn)高療效，并且能夠以高效率和高濃度在活體外培養(yǎng)。此外，將一種保持細(xì)胞濃度處于恒定水平的培養(yǎng)方法用于生產(chǎn)NK細(xì)胞，從而可防止細(xì)胞的過度生長，這樣可使細(xì)胞保持在最佳狀態(tài)。特別地，即使當(dāng)細(xì)胞被冷凍之后解凍時，細(xì)胞的功能也不會受損，并且NK細(xì)胞可保持高細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性。因此，能夠以液體狀態(tài)或冷凍狀態(tài)容易地存儲和提供NK細(xì)胞，而無需額外的處理過程。
【專利說明】生產(chǎn)自然殺傷細(xì)胞的方法、由該方法生產(chǎn)的自然殺傷細(xì)胞 以及包含該自然殺傷細(xì)胞的用于治療癌癥和感染性疾病的 組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)自然殺傷細(xì)胞（在下文中簡稱為"NK細(xì)胞"）的方法、由該方 法生產(chǎn)的NK細(xì)胞以及包含該NK細(xì)胞的用于治療癌癥和感染性疾病的組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 針對癌癥治療，已開發(fā)并采用了包括手術(shù)、放療和化療的多種治療方法。然而，在 特定的癌癥和患者的情況下，難以應(yīng)用這些治療方法而且復(fù)發(fā)的可能性很大。
[0003] 因此，利用患者的免疫功能的免疫療法日益受到關(guān)注，該免疫療法基于通過具有 各種功能的免疫細(xì)胞之間的復(fù)雜的相互作用來去除腫瘤。直接去除癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞包括 NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)，將抗原呈遞至這些效應(yīng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞包括樹突細(xì) 胞（DC)或B細(xì)胞。其他實例包括分泌各種細(xì)胞因子的輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg細(xì)胞）等。在這些免疫細(xì)胞中，NK細(xì)胞被認(rèn)為是最快速起效且高效的免疫細(xì)胞。
[0004] NK細(xì)胞是占血細(xì)胞的約10%的淋巴細(xì)胞且在免疫應(yīng)答中起重要作用。NK細(xì)胞具 有多種功能，特別是具有殺死癌細(xì)胞或感染了外部病原菌的細(xì)胞的能力，因此NK細(xì)胞的功 能是去除癌細(xì)胞或去除將發(fā)展成癌癥的細(xì)胞。
[0005] 大多數(shù)NK細(xì)胞在機體中通常以滅活狀態(tài)存在，但是為了將NK細(xì)胞用于治療目的， 需要活化NK細(xì)胞。因此，已積極進行了各種研究來活化來自患者的正常血液或滅活血液的 NK細(xì)胞。
[0006] 通過在活體外活化NK細(xì)胞獲得的NK細(xì)胞的高細(xì)胞毒性表明了將NK細(xì)胞用于免 疫細(xì)胞療法的可能性。據(jù)報道，在異基因骨髓移植之后施用在活體外活化的NK細(xì)胞時，對 多種癌癥具有治療作用，特別是諸如白血病的血癌（Blood Cells Molecules&Disease，33 :p261-266, 2004)。然而，臨床上尚未證明NK細(xì)胞對除了血癌以外的實體癌的明顯治療效 果。具體地，據(jù)報道，在癌形成之前施用NK細(xì)胞可干擾癌植入（Cancer Immunol. Immunoth er.，56(11) :pl733-1742, 2007)，但是這種治療模式似乎并不合適。此外，據(jù)報道，在動物試 驗中腹腔注射NK細(xì)胞抑制乳腺細(xì)胞的生長，但尚不清楚該抑制效果是否可歸因于NK細(xì)胞 (Breast Cancer Res. Treatment, 104(3):p267-275, 2007)〇
[0007] 同時，盡管NK細(xì)胞可能作為癌癥或感染性疾病的治療劑，但是體內(nèi)存在的NK細(xì)胞 數(shù)量并不多，因而需要一種生產(chǎn)大量的NK細(xì)胞同時保持足以用于治療目的療效的技術(shù)。然 而，NK細(xì)胞在體外不能被充分培養(yǎng)和擴增。因此，能在有用的水平上培養(yǎng)和擴增NK細(xì)胞的 技術(shù)已受到關(guān)注，但是研究結(jié)果尚不能在臨床上應(yīng)用。
[0008] 不僅利用用于T細(xì)胞增殖/活性的IL-2，而且利用IL_15(J. Immunol.，167(6):p3129-3138, 2001 ;Blood，106(1):pl58-166, 2005,KR2009-0121694 A)、刺激 CD3 的 0KT-3 抗體（Experimental Hematol.，29(1) :pl04-l 13, 2001)和1^5(工 Immunol.，165 (1) :pl39-147, 2000)對NK細(xì)胞的培養(yǎng)已進行了各種研究。然而，這些研究僅 僅發(fā)現(xiàn)了對IL-2應(yīng)用的修飾以及新型增殖物，并未提出用于增殖的具有劃時代意義的方 法。眾所周知，當(dāng)使用IL-2或其他細(xì)胞因子或化學(xué)物質(zhì)來培養(yǎng)NK細(xì)胞時，NK細(xì)胞的數(shù)量 比NK細(xì)胞的初始數(shù)量僅增加了約3-10倍。
[0009] -些研究人員報道，使用癌細(xì)胞系作為飼養(yǎng)細(xì)胞來擴增NK細(xì) 胞。據(jù)報道，使用白血病細(xì)胞系CTV-1在增殖方面顯示出改善很小或沒有改善 (J. Immunol.，178 (1) : p85-94, 2007)，而使用EBV-LCL培養(yǎng)21天后，細(xì)胞數(shù)量增加了平均約 490 倍（Cytotherapy, 11 (3) :p341-355, 2009)。此外，使用通過在 K562 細(xì)胞中表達 4-1BBL 和膜結(jié)合的IL-15所獲得的人工APC(抗原呈遞細(xì)胞）培養(yǎng)NK細(xì)胞3周后，NK細(xì)胞數(shù)量 增加了平均227倍，并在體外和體內(nèi)呈現(xiàn)高細(xì)胞毒性，但是顯示出由細(xì)胞死亡導(dǎo)致的有限 的增殖（Cancer Res. ,69(9) :p4010-4017, 2009)。最近有報道稱，在用 MICA、4-1BBL 和 IL-15轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞系中培養(yǎng)NK細(xì)胞3周后，NK細(xì)胞數(shù)量增加了平均350倍（Tissue Antigens, 76 (6) :p467-475, 2010)，并且有報道稱，當(dāng)使用用膜結(jié)合的IL-21轉(zhuǎn)染的K562細(xì) 胞系培養(yǎng)NK細(xì)胞2周同時每隔7天刺激NK細(xì)胞時，NK細(xì)胞數(shù)量增加了平均21，000倍。然 而，由于使用了所有癌細(xì)胞系，因此采用了不適合保證對臨床應(yīng)用非常重要的安全性的方 法。此外，由于使用特定的癌細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，因此生產(chǎn)的NK細(xì)胞對特定的癌細(xì)胞具有 啟動特異性。
[0010] 通過從未分離NK細(xì)胞的外周血白細(xì)胞（PBL)富集NK細(xì)胞而獲得的細(xì)胞相比于純 NK細(xì)胞具有低細(xì)胞毒性，并且包含被自體MHC分子識別自身細(xì)胞和非自身細(xì)胞的T細(xì)胞。 因此，只要未除去T細(xì)胞，這些細(xì)胞就僅限于自體移植。最近，開發(fā)了一種包括NK細(xì)胞分 離步驟并利用飼養(yǎng)細(xì)胞進行適當(dāng)刺激來擴增所分離的NK細(xì)胞的方法，以及一種利用全PBL 或外周血單核細(xì)胞（PBMC)選擇性擴增NK細(xì)胞的方法。此外，報道了一種培養(yǎng)NK細(xì)胞的方 法，所述方法包括在有外周血白細(xì)胞存在的情況下，使用包含抗-CD3抗體和白細(xì)胞介素蛋 白的培養(yǎng)基來培養(yǎng)NK細(xì)胞的過程（KR 10-2010-0011586 A)。
[0011] 一般的應(yīng)用于異基因的細(xì)胞擴增過程開始于兩個連續(xù)的步驟：磁性去除CD3+T細(xì) 胞和富集⑶56+NK細(xì)胞。為了刺激NK細(xì)胞增殖，通常使用被照射的諸如PBMC [Cytotherapy 12:750-763, 2010]、Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系（EBV-LCL) [Cytotherapy 11:341-55, 2009]這樣的飼養(yǎng)細(xì)胞。被照射的飼養(yǎng)細(xì)胞通過體液因子和直接 的細(xì)胞間接觸來刺激NK細(xì)胞[Blood 80:2221-2229,1992]。
[0012] 在本發(fā)明中，建立了一種大規(guī)模擴增和活化來自健康志愿者的用于臨床的NK 細(xì)胞的簡單而有效的方法。在單步磁性去除CD3+T細(xì)胞之后，在0KT3和IL-2存在的情 況下，用被照射的自體PBMC重復(fù)刺激并擴增去除的PBMC，得到異基因所需的高純度的 CD3-CD16+CD56+NK 細(xì)胞群。
[0013] 同時，白蛋白是構(gòu)成細(xì)胞的基本物質(zhì)的蛋白質(zhì)之一并且在自然界中存在的簡單蛋 白質(zhì)中具有最低的分子量。眾所周知，白蛋白通常被用作生物制劑的防腐劑，但是目前尚未 報道利用白蛋白來提高NK細(xì)胞的穩(wěn)定性。
[0014] 如上所述，已描述了用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的多種方法，但仍迫切需要一種技術(shù)，該技 術(shù)能夠采用臨床上友好的方法安全穩(wěn)定地培養(yǎng)并擴增足夠量的NK細(xì)胞用于免疫細(xì)胞療 法，并使生產(chǎn)的NK細(xì)胞穩(wěn)定地存儲很長一段時間并在需要時被提供。特別地，為了將活NK 細(xì)胞用于治療目的，需要克服NK細(xì)胞維持活性的周期（S卩，有效期）僅僅為幾天的缺點。因 此，迫切需要一種能夠通過培養(yǎng)和生產(chǎn)NK細(xì)胞、冷凍存儲所生產(chǎn)的NK細(xì)胞以及在需要時解 凍并提供所存儲的細(xì)胞而顯著提高免疫細(xì)胞的效用的技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種通過臨床上友好的方式，高效并安全地培養(yǎng)和增 殖NK細(xì)胞以在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量的細(xì)胞毒性NK細(xì)胞的方法。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種包含具有改進的長期存儲穩(wěn)定性的NK細(xì)胞的 組合物以及包括該組合物的藥物制劑。特別地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可作為冷凍產(chǎn)品提供， 并且即使在解凍時也可保持NK細(xì)胞的高細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞和包括該NK細(xì)胞的組合物能夠有效地用于治療癌 癥和感染性疾病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1示出了用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激引起的NK細(xì)胞的增殖變化。（a)示出了 NK細(xì)胞 隨重復(fù)刺激的次數(shù)的增殖率變化。（a)，一次：在第0天應(yīng)用一次刺激；兩次：在第0天和第 7天應(yīng)用兩次刺激；三次：在第0天、第7天和第14天應(yīng)用三次刺激。（b)示出了 NK細(xì)胞隨 應(yīng)用重復(fù)刺激的時間點的增殖率變化，其中D0 :在第0天應(yīng)用一次刺激；D0/D7 :在第0天和 第7天應(yīng)用兩次刺激；D0/D10 :在第0天和第10天應(yīng)用兩次刺激。
[0019] 圖2示出了通過用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激所培養(yǎng)的NK細(xì)胞的細(xì)胞活性變化，其中D0 : 在第0天應(yīng)用一次刺激；D0/D7 :在第0天和第7天應(yīng)用兩次刺激；D0/D10 :在第0天和第10 天應(yīng)用兩次刺激。
[0020] 圖3示出了通過用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激所培養(yǎng)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性變化，其中D0 : 在第0天應(yīng)用一次刺激；D0/D7 :在第0天和第7天應(yīng)用兩次刺激；D0/D10 :在第0天和第10 天應(yīng)用兩次刺激。
[0021] 圖4示出了對通過用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激所培養(yǎng)的NK細(xì)胞的表型分析結(jié)果，其中 (al&a2) :NK細(xì)胞的識別和純度；(bl&b2) :NK細(xì)胞的活化性受體；（cl&c2) :NK細(xì)胞的抑制 性受體。
[0022] 圖5示出了在包含NK細(xì)胞的組合物中，細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性隨白蛋白濃度的變 化，其中（a) NK細(xì)胞的細(xì)胞活性變化；(b) NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性變化。
[0023] 圖6示出了由白蛋白的加入引起的組合物中的NK細(xì)胞的細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性和表 型的變化，其中（a)NK細(xì)胞的細(xì)胞活性變化；(b)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性變化；（c)NK細(xì)胞的表 型變化。
[0024] 圖7示出了由冷凍引起的NK細(xì)胞的變化，其中（a)冷凍/解凍之后的細(xì)胞活性； (b)冷凍/解凍之后的復(fù)蘇；(c)冷凍/解凍之后的細(xì)胞毒性；（d)冷凍/解凍之后CD56+ 細(xì)胞的細(xì)胞表型的表達水平。
[0025] 圖8示出了 NK細(xì)胞在淋巴瘤動物模型中的抗癌作用，其中（a)在試驗?zāi)Ｐ椭袑?肢麻痹的緩解作用；(b)提高試驗?zāi)Ｐ偷拇婊畹淖饔谩?br> [0026] 圖9示出了顱內(nèi)施用時，NK細(xì)胞在腦癌（成膠質(zhì)細(xì)胞瘤）動物模型中的抗癌作用， 其中（a)通過組織學(xué)檢查觀察腫瘤體積的結(jié)果；(b)根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的TUNEL分析結(jié)果；（c) 腫瘤體積隨NK細(xì)胞數(shù)量的變化。
[0027] 圖10示出了靜脈施用時，NK細(xì)胞在腦癌動物模型中的抗癌作用，其中（a)通過組 織學(xué)檢查觀察腫瘤體積的結(jié)果；(b)腫瘤體積隨NK細(xì)胞數(shù)量的變化。
[0028] 圖11示出了當(dāng)與抗癌劑聯(lián)合施用時，NK細(xì)胞在腦癌動物模型中的抗癌作用。
[0029] 圖12示出了 NK細(xì)胞在卵巢癌動物模型中的抗癌作用，其中（a)作為NK細(xì)胞的施 用周期的函數(shù)的腫瘤大小的變化（體內(nèi)圖像）；(b)觀察由施用NK細(xì)胞引起的腫瘤大小的 變化結(jié)果。
[0030] 圖13示出了 NK細(xì)胞在肝癌動物模型中的抗癌作用。
[0031] 圖14示出了 NK細(xì)胞在神經(jīng)母細(xì)胞瘤動物模型中的抗癌作用。
[0032] 圖15示出了 NK細(xì)胞對各種癌細(xì)胞系和病毒感染的細(xì)胞系的體外療效。
[0033] (a)對K562細(xì)胞系（白血?。┑募?xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的能力
[0034] (b)對Raji細(xì)胞系（淋巴瘤）的細(xì)胞毒性
[0035] (c)對SK-N-SH細(xì)胞系（神經(jīng)母細(xì)胞瘤）的細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的能力
[0036] ⑷對SNUOT-Rbl細(xì)胞系（成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤）的細(xì)胞毒性
[0037] (e)對U87-MG細(xì)胞系（成膠質(zhì)細(xì)胞瘤）的細(xì)胞毒性
[0038] (f)對0VCAR-3細(xì)胞系（卵巢癌）的細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的能力
[0039] (g)對Huh-7細(xì)胞系（HCC，肝細(xì)胞癌）的細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的能力
[0040] (h)對SNU398細(xì)胞系（HBV感染的HCC)的細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的能力
[0041] (i)對Huh-7. 5細(xì)胞系（HCV感染的HCC)的細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的能力。
[0042] 用于實施本發(fā)明的最佳實施方式
[0043] 除非另有規(guī)定，本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。通常，本文中使用的術(shù)語是在本領(lǐng)域中是眾所 周知并普遍使用的。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)NK細(xì)胞的方法包括：
[0045] 在含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中，用抗-CD3抗體和飼養(yǎng)細(xì)胞刺激除去T細(xì)胞的單核細(xì) 胞，進行靜止培養(yǎng)幾天以刺激細(xì)胞間接觸，在保持細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃度處于恒定水平 同時，在反應(yīng)器中進行NK細(xì)胞的靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。
[0046] 為了獲得提高的NK細(xì)胞量，在接下來的靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)之前，可重復(fù)刺激和 靜止培養(yǎng)。由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞保持高細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性而對癌癥和感染性 疾病展現(xiàn)高療效，并且能夠以高效率和高濃度在活體外培養(yǎng)。
[0047] 在本發(fā)明中，在初始刺激之后的靜止培養(yǎng)進行約2-15天，優(yōu)選為5-10天，在重復(fù) 刺激之后的靜止培養(yǎng)進行約2-7天，優(yōu)選為3-5天。
[0048] 完成靜止培養(yǎng)之后，在保持細(xì)胞因子的濃度處于恒定水平同時，優(yōu)選在培養(yǎng)箱中 靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)NK細(xì)胞的方法例如可包括以下步驟：
[0050] (i)從人外周血分離外周血白細(xì)胞和NK細(xì)胞；
[0051] (ii)將分離的NK細(xì)胞加入到含抗-⑶3抗體和細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中，通過加入飼 養(yǎng)細(xì)胞來刺激NK細(xì)胞并進行靜止培養(yǎng)2-15天（優(yōu)選為5-10天），以刺激細(xì)胞間接觸；
[0052] (iii)完成步驟（ii)中的靜止培養(yǎng)之后，通過加入細(xì)胞因子、抗-⑶3抗體和飼養(yǎng) 細(xì)胞來重復(fù)刺激細(xì)胞并進行靜止培養(yǎng)2-7天（優(yōu)選為3-5天），以刺激細(xì)胞間接觸；
[0053] (iv)完成靜止培養(yǎng)之后，加入含靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)所需的細(xì)胞因子等的培養(yǎng)基 并在保持細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃度處于恒定水平同時，進行靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。
[0054] 在生產(chǎn)NK細(xì)胞的方法中，重復(fù)刺激細(xì)胞和進行靜止培養(yǎng)的步驟（iii)可重復(fù)一次 或多次。本發(fā)明的方法可在步驟（ii)之前進一步包括制備飼養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
[0055] 如在此使用的，術(shù)語"靜止培養(yǎng)"是指在培養(yǎng)箱中以靜止?fàn)顟B(tài)培養(yǎng)細(xì)胞，而不攪拌 或振蕩，如在此使用的，術(shù)語"懸浮培養(yǎng)"是指通過通氣或攪拌以懸浮狀態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞，而不使 細(xì)胞貼附至反應(yīng)器的底部或側(cè)面。
[0056] 可用于本發(fā)明中的靜止培養(yǎng)的反應(yīng)器的實例包括但不限于燒瓶、方瓶（T-flask)、 一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋等?？捎糜诒景l(fā)明中的懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器的實例包括但不限于搖瓶、振 蕩培養(yǎng)箱、發(fā)酵罐、方瓶、一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋等。此外，可使用適于實現(xiàn)本發(fā)明目的的任何生 物反應(yīng)器，并且可由本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員很容易地選擇。
[0057] 此外，用于靜止培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器可以是相同的或不同的。例如，當(dāng)用于靜 止培養(yǎng)的反應(yīng)器和用于懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器相同時，完成靜止培養(yǎng)之后，可向相同的反應(yīng)器 中額外加入含必需營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，接著進行懸浮培養(yǎng)。當(dāng)使用不同的反應(yīng)器時，完成靜 止培養(yǎng)之后，可將培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到用于懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器中。
[0058] 用于懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器的實例包括但不限于搖袋生物反應(yīng)器（GEHealthcare)、一 次性生物反應(yīng)器（SUB ;Thermo Fisher)、一次性XDR生物反應(yīng)器（Xcellerex)、細(xì)胞培養(yǎng)袋 (Nipro)、PBS 系列細(xì)胞培養(yǎng)箱（PBS Biotech)(參見 WO 07/111677A、W0 08/133845A 和 W0 09/132192A)、細(xì)胞培養(yǎng)袋（Fujimori)、一次性搖瓶（Erlenmeyer)等。特別地，優(yōu)選PBS系 列細(xì)胞培養(yǎng)箱（PBS Biotech)。
[0059] 如在此使用的，術(shù)語"飼養(yǎng)細(xì)胞"是指不具有分裂增殖能力但具有代謝活性，從而 生產(chǎn)各種協(xié)助靶NK細(xì)胞增殖的代謝產(chǎn)物的細(xì)胞。可用在本發(fā)明中的飼養(yǎng)細(xì)胞的實例包括 但不限于導(dǎo)入了基因的動物細(xì)胞系、用各種細(xì)胞因子或化合物處理的外周血白細(xì)胞（PBL)、 自體或異基因外周血白細(xì)胞（PBL)、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞等。優(yōu)選地，可使用自體外周 血單核細(xì)胞。此外，只要符合本發(fā)明的目的，可使用本領(lǐng)域已知的其他飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0060] 為確保安全，用作飼養(yǎng)細(xì)胞的自體外周血單核細(xì)胞可以以滅活狀態(tài)使用，?？墒褂?本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法來滅活。例如，可使用Y射線照射。滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞包括分離的T 細(xì)胞。本發(fā)明所述的使用飼養(yǎng)細(xì)胞的方法是在分離之后擴增NK細(xì)胞的方法，該方法的優(yōu)點 在于只有純NK細(xì)胞不斷增殖。
[0061] 本發(fā)明中的"抗-CD3抗體"是一種與CD3抗原特異性結(jié)合的抗體，CD3抗原是特異 性結(jié)合到T細(xì)胞受體（TCR)以形成抗體識別復(fù)合物的分子，其中CD3分子結(jié)合到TCR以將 抗原識別信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)。只要具有結(jié)合到CD3的特性，任何抗體可不受限制地用作本 發(fā)明中的抗-⑶3抗體?？?⑶3抗體優(yōu)選地選自由0KT3、UCHT1和HIT3a構(gòu)成的組，但不限 于此。
[0062] 在本發(fā)明中，可包括在培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子優(yōu)選為選自白細(xì)胞介素中的一種或 多種。如在此使用的，術(shù)語"白細(xì)胞介素"是由諸如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的免 疫細(xì)胞產(chǎn)生的生物活性蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。本發(fā)明中可使用的白細(xì)胞介素是選自由白細(xì)胞介 素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-12 (IL-12)、白細(xì)胞介素-15 (IL-15)、白細(xì)胞介素-18 (IL-8)和白 細(xì)胞介素-21(IL-21)構(gòu)成的組中的一種或多種。特別地，優(yōu)選使用IL-2,但不限于此。此 夕卜，只要符合本發(fā)明的目的，也可不受限制地使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的其他細(xì) 胞因子。
[0063] 在本發(fā)明中，抗-⑶3抗體用于靜止培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，抗-⑶3抗體在培養(yǎng)基中的濃 度為0. l-l，000ng/ml，優(yōu)選為l-100ng/ml，更優(yōu)選為5-20ng/ml，并且細(xì)胞因子在培養(yǎng)基中 的濃度為10-2,000IU，優(yōu)選為100-1，000IU，更優(yōu)選為約200-700IU。
[0064] 如在此使用的，術(shù)語"刺激"是指通過加入飼養(yǎng)細(xì)胞或類似物來誘導(dǎo)NK細(xì)胞的增 殖，也可將抗-⑶3抗體連同飼養(yǎng)細(xì)胞一起用于刺激。
[0065] 如在此使用的，術(shù)語"重復(fù)刺激"是指培養(yǎng)一定時間之后，通過加入飼養(yǎng)細(xì)胞和/ 或抗-⑶3抗體再次重新誘導(dǎo)NK細(xì)胞的增殖。
[0066] 在本發(fā)明中，用于生產(chǎn)NK細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基， 如CellGro培養(yǎng)基（Cellgenix)、AM-V培養(yǎng)基、RIMI-1640培養(yǎng)基或X-VIV020培養(yǎng)基。必 要時，該用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基可包含選自分離自人外周血的NK細(xì)胞、外周血單核細(xì) 胞、抗-CD3抗體和白細(xì)胞介素中的一種或多種成分。
[0067] 特別地，在根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)NK細(xì)胞的方法中，為了保持細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃度 處于恒定水平，可每隔一定時間測量培養(yǎng)基中細(xì)胞和細(xì)胞因子的濃度，并基于測量結(jié)果，可 根據(jù)細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃度提供含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。
[0068] 此外，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可包含血清、血漿或支持淋巴細(xì)胞增殖的額外的增殖因 子。加入到培養(yǎng)基中的血清或血漿沒有特別限制，可以是源自動物的商品。更優(yōu)選地，使用 人自體血清或血漿。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可使用誘導(dǎo)來自外周血單核細(xì)胞的淋 巴細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子的組合，或者使用刺激淋巴細(xì)胞增殖的凝集素。
[0069] 可使用合適的賦形劑和添加劑將根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞提供為治療組合 物。該組合物可施用給需要治療的患者，由此達到治療效果。
[0070] 特別地，當(dāng)向包含通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞的組合物中加入白蛋白時，可 大大提高NK細(xì)胞的長期存儲穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性和細(xì)胞活性。加入到本發(fā)明組合物中的 白蛋白的量沒有特別限制，但是基于本發(fā)明的組合物的總重量，加入白蛋白的量可以是 0· l-5wt%，優(yōu)選為 0· 5-2wt%。
[0071] 此外，當(dāng)采用保持細(xì)胞濃度處于恒定水平的生產(chǎn)NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法時，可防止細(xì) 胞的過度生長，這樣可使細(xì)胞保持在最佳狀態(tài)。特別地，即使當(dāng)細(xì)胞冷凍之后解凍，細(xì)胞的 功能也不會受損，并且NK細(xì)胞可保持高細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性。因此，能夠以液體狀態(tài)或冷 凍狀態(tài)容易地存儲和提供NK細(xì)胞，而無需額外的處理過程。
[0072] 由本發(fā)明方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞和包含該NK細(xì)胞的組合物可用于治療癌癥和感染性 疾病。由本發(fā)明方法生產(chǎn)的NK細(xì)胞可應(yīng)用于包括實體癌和血癌的各類癌癥。如在此使用 的，術(shù)語"實體癌"不同于血癌，是指形成于器官中的腫塊型癌。在大多數(shù)器官中形成的癌 對應(yīng)于實體癌?？墒褂帽景l(fā)明的NK細(xì)胞治療的癌癥是非限制性的，其優(yōu)選的實例包括但不 限于胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、 急性髓細(xì)胞性白血病、腦癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌、淋巴瘤等。 如在此使用的，術(shù)語"感染性疾病"是指包括由病毒或病原菌感染引起的并且可通過呼吸器 官、血液接觸或皮膚接觸感染的所有疾病。這些感染性疾病的非限制性的實例包括但不限 于乙型肝炎、丙型肝炎、人乳頭狀瘤病毒（HPV)感染、巨細(xì)胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病、 流感等。 實施例
[0073] 以下，將參照實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將顯而易 見的是，這些實施例僅是解釋性的目的，而不被理解為限制本發(fā)明的范圍。
[0074] 實施例1 :用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)地刺激（重復(fù)刺激）的NK細(xì)胞培養(yǎng)和特性評價
[0075] (1)用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)地刺激的NK細(xì)胞培養(yǎng)
[0076] 將從健康供體收集的外周血單核細(xì)胞（PBMC)分散到小瓶中并在液氮中冷凍。將 一個冷凍的PBMC小瓶解凍并轉(zhuǎn)移到50mL試管中，細(xì)胞懸浮于20mL含lvol % FBS (胎牛血 清）或自體血漿的PBS中，并在4°C以1200rpm離心10分鐘。
[0077] 將PBMC沉淀懸浮于10mL的MACS電泳緩沖液中，通過臺盼藍(lán)染色進行細(xì)胞計數(shù)。 為了制備PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞并除去CD3,將5X 107個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到各50mL新試管中并在4°C以 1200rpm離心10分鐘。
[0078] 將沉淀懸浮于10mL含lvol %自體血楽的CellGro培養(yǎng)基（Cellgenix)中來制備 PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞，接著用γ射線照射儀以2000cGy照射。
[0079] 為了得到除去⑶3的細(xì)胞，將400 μ 1電泳緩沖液和100 μ 1⑶3磁珠 （Miltenyi Biotech)加入到5X 107個細(xì)胞沉淀中，并在4°C反應(yīng)20分鐘。用20mL的MACS電泳緩沖液 洗滌反應(yīng)材料，然后在4°C以1200rpm離心10分鐘，并懸浮于2mL的MACS電泳緩沖液中。利 用配備有 VarioMACS(Miltenyi Biotech)的 CS 色譜柱（Miltenyi Biotech, 130-041-305) 將細(xì)胞與懸浮液分離，洗滌色譜柱至終體積達20mL，由此回收細(xì)胞。
[0080] 通過臺盼藍(lán)染色進行細(xì)胞計數(shù)，將IX 107個細(xì)胞分散到50mL新試管中，并在4°C 以1200rpm離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀懸浮于10mL含lvol%自體血漿的CellGro培養(yǎng)基 (Cellgenix)中。
[0081] 對于袋培養(yǎng)，向含PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞的試管中加入500IU的IL-2和10ng/mL的0KT-3。 向Nipro 350袋（Nipro)中加入含10mL的PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞、10mL的NK細(xì)胞和10mL的lvol % 自體血漿的CellGro培養(yǎng)基（Cellgenix)，在37°C的培養(yǎng)箱中進行靜止培養(yǎng)5天。在這里， Nipro 350袋從邊緣折疊6cm并從底部折疊5cm，以達到約70cm2的面積并用于靜止培養(yǎng)。 對于搖瓶培養(yǎng)，使用與袋培養(yǎng)相同的組成，在上述相同的條件下，用含〇. 5mL的PBMC飼養(yǎng)細(xì) 胞、0. 5mL的NK細(xì)胞和0. 5mL的lvol %自體血漿的CellGro培養(yǎng)基在12孔的孔板上進行 培養(yǎng)。在這里，12孔板具有3. 5-3. 8cm2的面積。
[0082] 在培養(yǎng)5天時，進行細(xì)胞計數(shù)，用含500IU的IL-2(Proleukin)和lvol%自體血漿 的CellGro培養(yǎng)基（Cellgenix)將細(xì)胞稀釋至約2X10 5個細(xì)胞/mL，并在合適的培養(yǎng)箱中 進行靜止培養(yǎng)。在這里，細(xì)胞濃度和面積調(diào)整為2 X 105個細(xì)胞/mL和3. 5cm2。
[0083] 自開始培養(yǎng)第7天、10天和14天時，進行細(xì)胞計數(shù)并用含lvol %自體血漿的 CellGro培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至2-5X 105個細(xì)胞/mL。制備1-10倍的飼養(yǎng)細(xì)胞并懸浮于含 lvol%自體血楽的CellGro培養(yǎng)基（Cellgenix)中，接著用γ射線照射器以2000cGy照射。 向其中加入500IU的IL-2和10ng/mL的0KT-3,共培養(yǎng)這兩類細(xì)胞。
[0084] 用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激這些細(xì)胞，接著靜止培養(yǎng)。然后，每隔2-3天進行細(xì)胞計數(shù) 并進行懸浮培養(yǎng)直到21天，同時用含500IU的IL-2和lvol%自體血漿的CellGro培養(yǎng)基 (Cellgenix)將細(xì)胞稀釋至5-10X105個細(xì)胞/mL。在懸浮培養(yǎng)21天時，收集NK細(xì)胞。
[0085] 將收集的NK細(xì)胞懸浮于含lwt %白蛋白（Green Cross Corp.)的哈特曼氏液 (Hatmann，s solution，Choongwae Pharmaceutical Corp.,韓國）中達 1-5X107 個細(xì)胞 / mL，并在4°C存儲。
[0086] 用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激的結(jié)果在圖1(a)中示出。從中可以看出，當(dāng)施用兩次或三次 刺激時，NK細(xì)胞的增殖相比于施用一次刺激時大大增加。現(xiàn)有的生產(chǎn)方法顯示NK細(xì)胞增 殖約161倍，而在用飼養(yǎng)細(xì)胞刺激兩次時，NK細(xì)胞增殖增加425倍，在用飼養(yǎng)細(xì)胞刺激三次 時，NK細(xì)胞增殖增加1，320倍。如圖1 (b)所示，當(dāng)用飼養(yǎng)細(xì)胞額外進行刺激7天或10天 時，NK細(xì)胞增殖比未額外刺激培養(yǎng)情況下的NK細(xì)胞的增殖高。因此發(fā)現(xiàn)，與在初始階段施 用一次刺激且基于培養(yǎng)基的量而非細(xì)胞數(shù)量來增殖NK細(xì)胞的方法相比，用飼養(yǎng)細(xì)胞額外 進行刺激并調(diào)整培養(yǎng)基的量同時保持細(xì)胞數(shù)量處于恒定水平的新培養(yǎng)方法對于NK細(xì)胞增 殖非常有效。
[0087] ⑵NK細(xì)胞的體外細(xì)胞活性
[0088] 為了比較評價體外細(xì)胞活性，采用細(xì)胞計數(shù)（NucleoCounter)系統(tǒng) (Chemometec)，該系統(tǒng)利用能夠結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)核的PI染色液的細(xì)胞計數(shù)方法。
[0089] 將未經(jīng)重復(fù)刺激的細(xì)胞和重復(fù)刺激培養(yǎng)了 7天和10天的細(xì)胞用PBS稀釋，然后利 用細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)測量總細(xì)胞計數(shù)和死細(xì)胞計數(shù)。將1〇〇 μ 1稀釋10倍的細(xì)胞與1〇〇 μ 1裂 解緩沖液Α-100 (Chemometec)混合，向其中加入100 μ 1穩(wěn)定緩沖液B (Chemometec),然后利 用NucleoCasette的活塞測量總細(xì)胞計數(shù)。利用NucleoCasette的活塞測量未經(jīng)10倍稀 釋處理的細(xì)胞的死細(xì)胞計數(shù)。
[0090] 通過將測得的總細(xì)胞計數(shù)減去測得的死細(xì)胞計數(shù)來確定活細(xì)胞的數(shù)量，然后利用 下式計算細(xì)胞活性。
[0091] 細(xì)胞活性（％ )=(活細(xì)胞計數(shù)/總細(xì)胞計數(shù)）X 100
[0092] 結(jié)果如圖2所示，與未經(jīng)重復(fù)刺激培養(yǎng)的細(xì)胞相比，由飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激培養(yǎng)21 天的NK細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖率，同時這些NK細(xì)胞表現(xiàn)出約90%的高細(xì)胞活性。
[0093] (3)體外細(xì)胞毒性
[0094] 回收靶癌細(xì)胞系（K562等），將3X106個細(xì)胞置于15mL試管中并離心。將細(xì)胞沉 淀懸浮于600 μ 1的RPMI培養(yǎng)基中，并將400 μ 1懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL新試管中，向其中加入 濃度為50nM的Calcein-AM(分子探針，C34852)。然后用銀箔阻擋光的同時將細(xì)胞懸浮液 于37°C在培養(yǎng)箱中染色20分鐘。同時，將200 μ 1剩余的細(xì)胞懸浮液以IX 106個細(xì)胞/mL 的濃度加入到800 μ 1的RPMI培養(yǎng)基中。用15mL RPMI培養(yǎng)基洗滌經(jīng)Calcein-AM染色的 癌細(xì)胞系并離心，并將沉淀以1 X 1〇6個細(xì)胞/mL的濃度懸浮于2mL的RPMI培養(yǎng)基中。
[0095] 將3X 106個NK細(xì)胞置于15mL試管中并離心，并將沉淀以相對于靶癌細(xì)胞系的所 需比例懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。將100 μ 1所制備的靶癌細(xì)胞系和NK細(xì)胞系的混合物分散 到圓底96孔板的各孔中。各孔是重復(fù)制備的。將該孔板在37°C避光狀態(tài)下培養(yǎng)2小時，然 后以2000rpm離心3分鐘。除去上清液，向孔板的每孔中加入100 μ 1的FACS緩沖液（在 PBS中2. 5wt%FBS)以使細(xì)胞懸浮，之后將孔板轉(zhuǎn)移到含5μ 1的7-AAD(BD，559925)的FACS 中。在室溫條件下培養(yǎng)20分鐘之后，對NK細(xì)胞的癌細(xì)胞毒性分析如下：
[0096] 細(xì)胞毒性=A值一B值
[0097] "A值"是指當(dāng)NK細(xì)胞與靶癌細(xì)胞培養(yǎng)時，殺傷的靶癌細(xì)胞的比例（用鈣黃綠素 -AM 和7-AAD染色的死亡靶癌細(xì)胞的平均值一僅用鈣黃綠素-AM染色的對照）
[0098] "B值"是指基本上死亡的靶癌細(xì)胞的比例（用鈣黃綠素-AM和7-AAD染色的死亡 靶癌細(xì)胞一僅用鈣黃綠素-AM染色的對照）
[0099] 結(jié)果如圖3所示，與未經(jīng)重復(fù)刺激培養(yǎng)的細(xì)胞相比，用飼養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)刺激培養(yǎng)21 天的NK細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖率，同時這些NK細(xì)胞在E:T比例=3:1時表現(xiàn)出約90%的高細(xì) 胞毒性。
[0100] (4)體外細(xì)胞表型分析
[0101] 收集在實施例1(1)中培養(yǎng)前后的NK細(xì)胞，以1200rpm離心5分鐘，通過抽吸除去 培養(yǎng)基。用lmL的FACS緩沖液（含2. 5% FBS的PBS)稀釋細(xì)胞，進行計數(shù)并用FACS緩沖 液稀釋為5 X 106個細(xì)胞/mL的濃度。向各5mL FACS試管（Falcon, 352052)中加入100 μ 1 稀釋的細(xì)胞液，向其中加入下表1中所示的抗體。
[0102] 表 1
[0103] 【表1】加入到各試管中的抗體
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)NK細(xì)胞的方法，包括以下步驟： (i) 從人外周血分離外周血白細(xì)胞和NK細(xì)胞； (ii) 在含抗-CD3抗體、細(xì)胞因子和飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)NK細(xì)胞，以通過細(xì)胞 間接觸來刺激； (iii) 完成步驟（ii)中的靜止培養(yǎng)之后，通過加入細(xì)胞因子、抗-CD3抗體和飼養(yǎng)細(xì)胞 重復(fù)刺激細(xì)胞，并進行靜止培養(yǎng)以刺激，引起細(xì)胞間接觸； (iv) 完成靜止培養(yǎng)之后，向細(xì)胞中加入含靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)所需的細(xì)胞因子和類似 物的培養(yǎng)基，在保持細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃度處于恒定水平的同時，進行靜止培養(yǎng)或懸浮 培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中將重復(fù)刺激細(xì)胞和進行靜止培養(yǎng)的步驟（iii)重復(fù) 兩次或更多次。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（ii)中的靜止培養(yǎng)進行2-15天，而步驟（iii) 中的靜止培養(yǎng)進行2-7天。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（iv)中的懸浮培養(yǎng)是使用選自搖瓶、振蕩培養(yǎng) 箱、發(fā)酵罐、方瓶和一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋的反應(yīng)器進行。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（ii)或步驟（iii)中的靜止培養(yǎng)與步驟（iv) 中的靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)在相同的反應(yīng)器或不同的反應(yīng)器中進行。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，在步驟（iv)中的靜止培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)期間，測量培養(yǎng)基 中的細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃度，并加入含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子濃 度處于恒定水平。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗-⑶3抗體選自0KT3、UCHT1和HIT3a中的一 種或多種。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗-CD3抗體是0KT-3抗體。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素_2 (IL-2)、白細(xì)胞介 素-12 (IL-12)、白細(xì)胞介素-15 (IL-15)、白細(xì)胞介素-18 (IL-8)和白細(xì)胞介素-21 (IL-21) 中的一種或多種。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是IL-2。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述飼養(yǎng)細(xì)胞是滅活的外周血單核細(xì)胞。
12. -種NK細(xì)胞，通過如權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法生產(chǎn)。
13. -種治療癌癥或感染性疾病的組合物，包括如權(quán)利要求12所述的NK細(xì)胞。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，進一步包括白蛋白。
15. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其中基于組合物的總重量，包括0. l-5wt%的量的白 蛋白。
16. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述癌癥選自由胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳腺 癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性髓細(xì)胞性白血病、腦癌、神經(jīng)母 細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌和淋巴瘤構(gòu)成的組。
17. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述感染性疾病選自由乙型肝炎、丙型肝炎、人 乳頭狀瘤病毒（HPV)感染、巨細(xì)胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病和流感構(gòu)成的組。
18. -種液態(tài)或冷凍制劑，包括如權(quán)利要求13所述的組合物。
【文檔編號】C12N5/02GK104204194SQ201280070546
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】閔普慶, 崔哈娜, 林玉宰, 許正賢, 姜常美, 李恩京, 鄭惠真, 黃琉炅 申請人:財團法人牧巖生命工學(xué)研究所, Gc細(xì)胞治療