專(zhuān)利名稱：一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，取材來(lái)源均為新生鼠(〈10天，35 50g)，幼年鼠(〈3weeks，80 IOOg)或2_3月年輕成年鼠(200g 300g)，而且培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞只能傳代一次，不能凍存，利用大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料導(dǎo)致時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)成本高的缺點(diǎn)。如Bowman PD, Betz AL, Ar D, Wolinsky JS, Penney JB, Shivers RR,Goldstein GW. 1981. Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.1NVITR0. 17(4),353-362。老年大鼠(19 22月，900g 1200g)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的先例至今未見(jiàn)報(bào)道；現(xiàn)有的取材對(duì)象和培養(yǎng)技術(shù)不能滿足體外建立老年血腦屏障模型，研究老年血腦屏障的生理特性，以及老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病與血腦屏障相關(guān)的退行性病變的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分20ml-30ml血漿來(lái) 源的血清，IOOul青霉素-鏈霉素溶液，1.0-1. 5ml L-谷氨酰胺，50-150 μ I硫駿慶大霉素，1. 0-1. 5ml肝素，150-300 μ I堿性纖維生子因子，1. 0-1. 5ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子，200-400 μ I維生素C，100-200 μ I血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，100-200 μ I胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，100-200 μ I內(nèi)皮生子因子。向DMEM培養(yǎng)基中加入上述組分即可。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分20ml血漿來(lái)源的血清，IOOul青霉素-鏈霉素溶液，1. 0ml L-谷氨酰胺，100 μ I硫駿慶大霉素，1. Oml肝素，150 μ I堿性纖維生子因子，1. Oml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子(ECGS)，300 μ I維生素C，150 μ I血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) ,150 μ I胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)，150 μ I內(nèi)皮生子因子(EGF)。 上述試劑均為本領(lǐng)域常用市售產(chǎn)品。有益效果1、本發(fā)明所述內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液采用PDS (血漿來(lái)源的血清)代替了傳統(tǒng)培養(yǎng)液中的FBS (胎牛血清)、小牛血清(BCS)或馬血清(HS)，使培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞純度增加30%;主要原因是由于FDS中不含TOGF (血小板源性生長(zhǎng)因子)，而I3DGF有利于混入腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的平滑肌細(xì)胞，纖維細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的分裂和增殖；用PDS消除了這一影響。2、本發(fā)明在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了維生素C和嘌呤霉素，這使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)更快更純。3、本發(fā)明在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中還加入了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，內(nèi)皮生子因子，這些因子可使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)得更快更健康，尤其是對(duì)老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)更為重要。


圖1、本發(fā)明制得的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)傳3代與傳統(tǒng)方法制備的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)傳3代的存活率的柱狀比較圖；圖2、本發(fā)明制得的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)凍存復(fù)蘇后與傳統(tǒng)方法制備的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)凍存復(fù)蘇后的存活率的柱狀比較圖；圖3:本發(fā)明制得的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與傳統(tǒng)方法制備的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞純度的柱狀比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。原料來(lái)源19-22月的老年大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)中心；配制老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基各種試劑的來(lái)源

DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibico公司，商品號(hào)11995-065 ；血衆(zhòng)來(lái)源的血清(PDS, Plasma-Derived Serum),購(gòu)自Bioquote公司，商品號(hào)BT-214-10 ；青霉素-鏈霉素溶液，購(gòu)自sigma公司，商品號(hào)p0718 ;L-谷氨酰胺,購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)G7513 ;硫駿慶大霉素，購(gòu)自sigma公司，商品號(hào)G1397 ；肝素,購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)H3149 ;堿性纖維生子因子(bFGF)，購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)F9786 ；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子(ECGS)，購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)E2759 ;維生素C，購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)C1768 ;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),購(gòu)自Lonza公司，商品號(hào)cc4176 ；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)購(gòu)自Lonza公司，商品號(hào)cc4176 ;內(nèi)皮生子因子(EGF)購(gòu)自Lonza公司，商品號(hào)cc4176 ；嘌呤霉素(Puromycin),購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)p8833。各種酶及其他相關(guān)試劑的來(lái)源胎牛血清(FBS)購(gòu)自Invitrogen公司，商品號(hào)10437-028 ；膠原酶(Collagenase)購(gòu)自Invitrogen 公司，商品號(hào) 17101 ；DNA 酶(DNase)購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司，商品號(hào) D4263 ;胰酶(Typsin)購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，商品號(hào) T3053 ;牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，商品號(hào)a3059 ;
膠原IV (Collagen IV)購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司，商品號(hào) C5533 :纖連蛋白(Fibronectin)購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，商品號(hào) F1141 ；Percoll 購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司，商品號(hào) 4937 ；腰椎穿刺針(Lumbarpuncture needle)購(gòu)自 BD 公司，商品號(hào) 405182。實(shí)施例1一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分30ml血漿來(lái)源的血清，100 μ I青霉素-鏈霉素溶液，1. Oml L-谷氨酰胺，100 μ I硫駿慶大霉素，1. 5ml肝素，150 μ I堿性纖維生子因子，1. Oml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子，400 μ I維生素C，200 μ I血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，200 μ I胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，200 μ I內(nèi)皮生子因子；向DMEM培養(yǎng)基中加入上述組分即可。
·
實(shí)施例2 一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分20ml血漿來(lái)源的血清，100 μ I青霉素-鏈霉素溶液，1. Oml L-谷氨酰胺，100 μ I硫駿慶大霉素，1. Oml肝素，100 μ I堿性纖維生子因子，1. Oml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子，200 μ I維生素C，100 μ I血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，100 μ I胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，100 μ I內(nèi)皮生子因子；向DMEM培養(yǎng)基中加入上述組分即可。對(duì)比例傳統(tǒng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液為在每100ml F12培養(yǎng)基(Ham’ s_F12培養(yǎng)基)的基礎(chǔ)上加入如下成分10_20ml小牛血清(BCS), 100 μ I青霉素-鏈霉素溶。(該配方記載于Bowman PD, etal. Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.1NVITRO. 1981. 17(4),353-362 中)?；蛘呤?4ml DMEM 培養(yǎng)基，44ml Ham，s_F12 培養(yǎng)基，10ml 胎牛血清(FBS)，100 μ I 青霉素-鏈霉素溶，1. Oml肝素鈉，1. Oml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子。(該配方記載于Tunkel AR etal. Blood—brain barrier alterations in bacterial meningitis development of an invitro model andobservations on the effects of lipopolysaccharide.1n Vitro CellDev Biol. 199127A(2) :113_20)。試驗(yàn)例將上述培養(yǎng)液按如下步驟實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)(I)將20月齡的老年大鼠斷頭后，剝?nèi)ゴ笫箢^部皮膚，然后把大鼠頭浸泡在0°C的含2% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清(FBS)分離液中5分鐘，取出，切開(kāi)兩個(gè)大腦半球，分別把兩個(gè)腦半球在消毒的普通濾紙上滾動(dòng)一周，然后去除腦干和白質(zhì)部分，保留灰質(zhì)部分，制得樣品組織；分離液為在DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每百毫升加入如下組分1ml青霉素-鏈霉素溶液；100 μ I硫駿慶大霉素；(2)把樣品組織置于5ml冰冷的含2% (體積百分?jǐn)?shù))FBS分離液的培養(yǎng)皿中剪成I 2mm3的樣品組織小塊，補(bǔ)加2% (體積百分?jǐn)?shù))FBS分離液至25ml，經(jīng)吹打分散，然后將吹打分散的樣品組織小塊加入2. 5ml的膠原酶和250 μ I的DNA酶溶液，在36°C的水浴搖床中100rpm/min消化90分鐘；然后吹打分散后，繼續(xù)消化30分鐘，制得分散細(xì)胞；(3)向步驟(2)制得的分散細(xì)胞補(bǔ)加10ml2% (體積百分?jǐn)?shù))FBS的分離液，混勻后在4°C，600g離心8分鐘；移去上清，加20ml含20% (體積百分?jǐn)?shù))BSA的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后，4°C，IOOOg離心20分鐘；取最下層的沉淀，制得毛細(xì)血管細(xì)胞；(4)將步驟(3)制得的毛細(xì)血管細(xì)胞重懸于Iml的分離液中，再加入7. 9ml的分離液，Iml的膠原酶和100 μ I的DNA酶溶液，混勻后在37°C水浴搖床中(100rpm/min)消化90分鐘，制得毛細(xì)血管懸液；(5)將步驟(4)制得的毛細(xì)血管懸液在4°C，600g離心5分鐘；移去上清，沉淀重懸于2ml的分離液中，然后輕輕地把懸液置于Percoll濃度梯度離心液的頂部；4°C，IOOOg離心10分鐘，分為六層(第一層透明的分離液；第二層透明的Percoll但在靠分離液處有些浮渣；第三層消化好的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞層；第四層透明的Percoll ;第五層紅細(xì)胞層；第六層=Percoll晶體)，用長(zhǎng)的腰椎穿刺針取第三層液體，第三層液體即為腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；(6)將步驟(5)制得的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞溶于Iml的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后轉(zhuǎn)移到IOcm的培養(yǎng)板或6孔板中，正常條件下培養(yǎng)I天，然后用IXPBS緩沖液洗兩次除去死亡的細(xì)胞，用含3 μ M/ml嘌呤霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液純化2天后,更換為正常的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)7天，用O. 01%胰酶(Typsin)消化傳代或凍存即可；

所述培養(yǎng)板或6孔板制備方法如下先用IXCollagen IV鋪板30分鐘,然后再用I XFibronectin 鋪板 30 分鐘。結(jié)果分析1、本發(fā)明在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中除了加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子(ECGS)夕卜，還加入了堿性纖維生子因子(bFGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)，內(nèi)皮生子因子(EGF)及維生素C。這些因子可保證腦血管內(nèi)皮保持健康的細(xì)胞形態(tài)、生物特性及生理功能和較快的生長(zhǎng)速度；尤其是對(duì)老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)更為重要。如果不加這些因子，老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，細(xì)胞比較脆弱，容易死亡，只能傳一代，不能凍存和復(fù)蘇。2、本發(fā)明所述內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液采用PDS (血漿來(lái)源的血清)代替了傳統(tǒng)培養(yǎng)液中的FBS (胎牛血清)、小牛血清(BCS)或馬血清(HS)，使培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞純度增加30%;主要原因是由于FDS中不含TOGF (血小板源性生長(zhǎng)因子)，而I3DGF有利于混入腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的平滑肌細(xì)胞，纖維細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的分裂和增殖；用PDS消除了這一影響。3、本發(fā)明在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了維生素C，肝素和嘌呤霉素，這使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)得更快更純；主要原因是維生素C和肝素刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)；嘌呤霉素可抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些因子保證了培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的純度。實(shí)施例1所述更新培養(yǎng)液與傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞傳3代存實(shí)施例1對(duì)比例
原始代的存活率 100%100%
活率的比較(見(jiàn)圖1)第_代的丨7:沽.中.(80.12±6.5)%(40.24±7.3)%
笫.代的忭沾■申.(70.34±7.1)%(20.34±4.7)%
第三代的存活率(65.78±5.8)%(10.12±6.1)%實(shí)施例2所述老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)方法凍存/復(fù)蘇后存活率的比較(見(jiàn)圖2)實(shí)施例2對(duì)比例原始代的存活率100%凍存/ 復(fù)蘇存活率 (78. 53 ±7. 76) %(12. 45 ±5. 9)%實(shí)施例1所述老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)液及方法細(xì)胞純度比較(見(jiàn)圖3)實(shí)施例1對(duì)比例細(xì)胞純度(98. 26 ±1. 8) %(68. 32 ±3.2)%由上述結(jié)果可知，本發(fā)明所述的老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法無(wú)論在傳3代存活率、凍存/復(fù)蘇后存活率和細(xì) 胞純度均較現(xiàn)有技術(shù)有大幅提高。
權(quán)利要求
1.一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于，在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分20ml-30ml血漿來(lái)源的血清，IOOul青霉素-鏈霉素溶液，1. 0-1. 5ml L-谷氨酰胺， 50-150 μ I硫駿慶大霉素，1. 0-1. 5ml肝素，150-300 μ I堿性纖維生子因子，1. 0-1. 5ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子，200-400 μ I維生素C，100-200 μ I血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，100-200 μ I胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，100-200 μ I內(nèi)皮生子因子。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分20ml血漿來(lái)源的血清，IOOul青霉素-鏈霉素溶液，1. Oml L-谷氨酰胺，100 μ I硫駿慶大霉素，1. Oml肝素，150 μ I堿性纖維生子因子，1. Oml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子，300 μ I維生素C, 150 μ I血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，150 μ I胰島素樣生長(zhǎng)因子_1，150 μ I內(nèi)皮生子因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種老年大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在每百毫升DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入如下組分血漿來(lái)源的血清，青霉素-鏈霉素溶液，L-谷氨酰胺，硫駿慶大霉素，肝素，堿性纖維生子因子，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子，維生素C，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，內(nèi)皮生子因子。本發(fā)明所述內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液采用PDS代替了傳統(tǒng)培養(yǎng)液中的FBS、小牛血清或馬血清，使培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞純度增加30％；并且加入了維生素C和嘌呤霉素，這使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)更快更純。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103045534SQ20131002594
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者王麗梅, 崔敏, 王越, 陳哲宇 申請(qǐng)人:山東大學(xué)