一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，取7～10日齡SD大鼠分離的大腦皮質(zhì)，經(jīng)Ⅱ型分散酶消化、兩次加入15％葡聚糖溶液三次離心后獲得大鼠腦微血管段，用膠原酶/分散酶消化后，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，簡(jiǎn)易可行、獲得細(xì)胞純度較高，成功分離培養(yǎng)了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，倒置顯微鏡下單個(gè)細(xì)胞呈短梭形或多角形，匯合后呈鋪路石樣，單層貼壁生長(zhǎng)；經(jīng)免疫熒光檢測(cè)第Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性。
【專利說明】一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BrainMicrovascular Endothelial Cells, BMECs)是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，是各種生理、病理因素作用的靶細(xì)胞。BMECs能通過選擇性雙向跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及細(xì)胞間的緊密連接將腦組織與血液分開，限制大多數(shù)極性分子和蛋白質(zhì)進(jìn)入腦組織，只有少部分蛋白質(zhì)和多肽能通過轉(zhuǎn)胞吞作用通過血腦屏障進(jìn)入血液。BMECs具有不同于外周內(nèi)皮細(xì)胞的特性:細(xì)胞間連接緊密，跨膜電阻高，延遲細(xì)胞旁的通量；細(xì)胞缺乏孔窗結(jié)構(gòu)，胞飲作用弱，毒素不易通過血腦屏障；細(xì)胞具有不對(duì)稱定位酶和載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，產(chǎn)生“兩極分化”的表現(xiàn)型。為了更好地在體外研究血腦屏障和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，原代培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞越來越重要。由于目前現(xiàn)有報(bào)道的體外培養(yǎng)方法雖然能夠培養(yǎng)出腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，但都有一定的缺陷，本發(fā)明通過反復(fù)試驗(yàn)和改進(jìn)，成功摸索出相對(duì)簡(jiǎn)單，純度較高的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞RBMECs的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明 解決的一個(gè)技術(shù)問題就是，提供一種簡(jiǎn)易可行、獲得細(xì)胞純度較高的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。
[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0005]—種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，取7~10日齡SD大鼠分離的大腦皮質(zhì)，經(jīng)II型分散酶消化、兩次加入15%葡聚糖溶液三次離心后獲得大鼠腦微血管段，用膠原酶/分散酶消化后，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
[0006]所述方法還包括對(duì)得到的原代細(xì)胞進(jìn)行純化并傳代培養(yǎng)的步驟。
[0007]所述方法還包括對(duì)純化并傳代培養(yǎng)得到的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定的方法，所述鑒定方法是利用第珊因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。所述第珊因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)法的步驟包括:將細(xì)胞傳代至共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)板中，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%匯合狀態(tài)時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預(yù)熱的PBS輕輕清洗3次，加入預(yù)冷的95%乙醇；于-20°C固定20min，吸去乙醇，用PBS連續(xù)漂洗3次，每次3min ;向培養(yǎng)孔中滴加ImL兔抗人第珊因子相關(guān)抗原抗血清，陰性對(duì)照不加，37°C孵育4h ;用PBS漂洗3次，每次3min ;滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgGlmL, 37°C孵育1.5h ;用PBS液漂洗3次，每次3min ;用去離子水沖洗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。
[0008]本發(fā)明的方法，其中體外分離并原代培養(yǎng)階段具體包括以下步驟:無菌取5只7~10日齡SD大鼠的大腦，D-Hank’s清洗3次，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)去除軟腦膜及大血管,剝離大腦皮質(zhì)；將分離得到的大腦皮質(zhì)在D-Hank’s中清洗3次，100rpm離心2min棄上清液；加入15% II型分散酶，用5mL移液槍吹打，吹成勻漿狀；37°C水浴消化lOmin，每隔3min用移液槍吹打數(shù)次，800g4°C離心5min，棄上清；加入15%葡聚糖溶液，渦旋2min充分混勻，4500g4°C離心10min，將上層神經(jīng)及大血管移入另一離心管，加入15%葡聚糖溶液，潤(rùn)旋2min,4500g4°C離心8min ;合并兩次離心得到的紅色沉淀物,4500g4°C再次離心6min,棄去上層神經(jīng)組織和大血管,保留底部紅色沉淀；用D_Hank’ s重懸沉淀,800g4°C離心5min,棄上清；加入ImL膠原酶/分散酶,37°C水浴消化20min,每隔5min吹打數(shù)次,取1yL消化液于載玻片在顯微鏡下觀察，可見串珠狀微血管段；加入等量的完全培養(yǎng)基終止消化，800g4°C離心5min，加入完全培養(yǎng)基重懸，接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中；在37°C、5% CO2恒濕恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換完全培養(yǎng)基，得到原代細(xì)胞。對(duì)得到的原代細(xì)胞可再進(jìn)行純化并傳代培養(yǎng)。并通過第珊因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行鑒定。
[0009]所述純化并傳代培養(yǎng)的步驟包括:原代培養(yǎng)細(xì)胞，用37°C預(yù)熱的D-Hank’ s清洗3次，然后加入含0.005% EDT A的0.05%胰蛋白酶，37°C消化2~3min，待大部分細(xì)胞收縮變圓時(shí)，棄去胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打使細(xì)胞脫壁，吸取細(xì)胞懸液，添加等量的完全培養(yǎng)基，混勻，按照1: 2接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)箱靜置孵育2h更換完全培養(yǎng)基。
[0010]上述步驟中提及的完全培養(yǎng)基優(yōu)選為:20% FBS、1% L-谷氨酰胺、青霉素I X 14U.mr1、鏈霉素 I X 14U.πm1、ECGS15 μ g.mL'
[0011]本發(fā)明的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，成功分離培養(yǎng)了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，倒置顯微鏡下單個(gè)細(xì)胞呈短梭形或多角形，匯合后呈鋪路石樣，單層貼壁生長(zhǎng)；經(jīng)免疫熒光檢測(cè)第VDI因子相關(guān)抗原呈陽性。 [0012]本發(fā)明的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，采用15%葡聚糖三次離心，簡(jiǎn)便易行且能獲得較高純度BMECs ;培養(yǎng)大鼠BMECs的重要步驟之一是分離出較純的大腦皮質(zhì)微血管段。常規(guī)方法采用組織勻漿和過篩的方式，該方法能有效除去雜細(xì)胞，獲得純度較高的微血管段，但這種方法大大降低了微血管段的活性，細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，一次需要消耗大量大鼠；也有試驗(yàn)表明percoll梯度離心能夠純化微血管段，但經(jīng)過多次嘗試發(fā)現(xiàn)，percoll離心過后得到的微血管段活性比離心前大大降低，不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，且會(huì)損耗一部分微血管段，舍去此步驟能夠減少純化微血管段的時(shí)間和離心次數(shù)，對(duì)微血管段的活性損傷小，并且對(duì)其純度影響不大。本發(fā)明采用15%葡聚糖4°C三次離心的方法能獲得較大量的較純的微血管段，此前發(fā)現(xiàn)采用葡聚糖離心時(shí)間均為15min，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此方法很容易使神經(jīng)組織和大血管混入微血管段，所得腦微血管段純度不高，本發(fā)明最后確定的最優(yōu)條件是:三次離心時(shí)間分別為10min、8min、6min,每次離心前都潤(rùn)旋使其充分混合。采用水平轉(zhuǎn)子離心，能避免上層神經(jīng)組織和大血管混入微血管中，縮短離心時(shí)間也有利于保護(hù)微血管的活性，方法簡(jiǎn)單易行，對(duì)試驗(yàn)條件要求不高。大鼠BMECs相對(duì)其他微血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂能力較弱，生長(zhǎng)條件要求較高，第2~4代細(xì)胞活性都比較高，形態(tài)也比較穩(wěn)定，可選用此階段的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
[0013]另外本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)板上不鋪布明膠、鼠尾膠等物質(zhì)不影響B(tài)MECs貼壁及生長(zhǎng)，在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)加入適量的ECGS能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，如不添加ECGS，采用含有25%~30% FBS的培養(yǎng)基也能促進(jìn)大鼠BMECs的生長(zhǎng)，但其效果較ECGS差?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0014]圖1為原代及傳代培養(yǎng)的RBMECs，其中:
[0015]A.分離的大鼠腦皮質(zhì)微血管段(40 X) ；B.1d后從微血管段長(zhǎng)出的RBMECs (40 X)；C.微血管段周圍生長(zhǎng)的RBMECs (40 X) ;D.7d左右的RBMECs (40 X) ；E.生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)的RBMECs (40 X) ;F.2 代 RBMECs (40 X) ;G.2 代 RBMECs (100 X) ;Η.3 代 RBMECs (100 X) ;1.6 代衰老的 RBMECs (100Χ) J.7 代 RBMECs (200 X)；
[0016]圖2為RBMECs第VDI因子鑒定結(jié)果(400Χ)，其中:
[0017]A.RBMECs第VDI因子鑒定陽性；B.RBMECs第VDI因子鑒定對(duì)照組陰性。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下文中將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互任意組合。
[0019]實(shí)施例:
[0020]I 方法
[0021]1.1 動(dòng)物
[0022]7~10日齡SD大鼠，雌雄均可，購(gòu)自中科院遺傳所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0023]1.2主要儀器和器材
[0024]CO2 培養(yǎng)箱(SANYO，型號(hào):MC0217AC)，倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號(hào):IX71_A21PH)，高速低溫離心機(jī)(SIGMA6-16K)，酸度計(jì)(賽多利斯，型號(hào):UB_7)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)，激光共聚焦顯微鏡LEICA等。
[0025]1.3 試劑
[0026]HankcJ s(GIBC0,批號(hào):H2387)，胎牛血清(FBS，PAA Laboratories Gmbh,批號(hào):A04105-1121)，DMEM 高糖培養(yǎng)基(SIGMA，批號(hào):1136551)，胰蛋白酶(1:250，GIBC0，批號(hào):2750018), II 型膠原酶(SIGMA，批號(hào):30H6812), L-谷氨酰胺(SIGMA，批號(hào):G_3126)，兔抗人第VDI因子相關(guān)抗原抗血清(SIGMA，批號(hào):30677904)，羊抗兔IgG-FITC(SIGMA，批號(hào):58630)，膠原酶/分散酶(Roche，貨號(hào):10269638001)，ECGS(內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑)(Millipore，批號(hào):02-102)。
[0027]1.4RBMECS的原代培養(yǎng)
[0028]取5只7~10日齡SD大鼠，脫頸椎處死，75 %酒精浸泡消毒，無菌取出大腦，D-Hank’s清洗3次，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)去除軟腦膜及大血管，剝離大腦皮質(zhì)。將大腦皮質(zhì)在D-Hank’s中清洗3次，100rpm離心2min棄上清液。加入15% dispase II ,用5mL移液槍吹打，吹成勻漿狀。37°C水浴消化lOmin，每隔3min用移液槍吹打數(shù)次，800g4°C離心5min,棄上清。加入15% dextran溶液,潤(rùn)旋2min充分混勻,4500g4°C離心1min,將上層神經(jīng)及大血管移入另一離心管，加入15% dextran溶液，禍旋2min,4500g4°C離心8min。合并兩次離心紅色沉淀物，4500g4°C離心6min，棄去上層神經(jīng)組織和大血管，保留底部紅色沉淀。用D-Hank’s重懸沉淀，800g4°C離心5min,棄上清。加入ImL膠原酶/分散酶,37°C水浴消化20min，每隔5min吹打數(shù)次，取10 μ L消化液于載玻片在顯微鏡下觀察，可見串珠狀微血管段。加入等量的完全培養(yǎng)基終止消化，800g4°C離心5min，加入完全培養(yǎng)基(20%FBSU % L-谷氨酰胺、青霉素 I X 14U^ml'鏈霉素 I X 14U.mr\ECGS15 μ g.ι?-1)重懸，接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中。在37°C、5% CO2恒濕恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換完全培養(yǎng)基。第7~10天細(xì)胞匯合鋪滿后，消化傳代。
[0029]1.5RBMECS的純化與傳代培養(yǎng)
[0030]選取生長(zhǎng)至近完全匯合狀態(tài)的培養(yǎng)孔，吸棄原培養(yǎng)基，用37°C預(yù)熱的D-Hank’s清洗3次，然后加入的0.05%胰蛋白酶(含0.005% EDT A)，37°C消化2~3min，待大部分細(xì)胞收縮變圓時(shí)，棄去胰酶，加入的完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打使細(xì)胞脫壁，吸取細(xì)胞懸液，添加等量的完全培養(yǎng)基，混勻，按照1:2接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱靜置孵育2h更換完
全培養(yǎng)基。
[0031]1.6RBMECS 的鑒定
[0032]1.6.1倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察
[0033]將培養(yǎng)有原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)情況及其形態(tài)，并拍照記錄。
[0034]1.6.2第VDI因子免疫熒光鑒定
[0035]將細(xì)胞傳代至共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)板中，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%匯合狀態(tài)時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預(yù)熱的PBS輕輕清洗3次，加入預(yù)冷的95%乙醇；于_20°C固定20min，吸去乙醇，用PBS連續(xù)漂洗3次，每次3min ;向培養(yǎng)孔中滴加ImL兔抗人第VDI因子相關(guān)抗原抗血清(陰性對(duì)照不加)，37°C孵育4h ;用PBS漂洗3次，每次3min ;滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgGlmL，37°C孵育1. 5h ;用PBS液漂洗3次，每次3min ;用去離子水沖洗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。
[0036]2 結(jié)果
[0037]2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
[0038]取10 μ L消化液于載玻片在倒置顯微鏡下觀察，可見大量微血管段，呈串珠樣，管壁較光滑、清晰、長(zhǎng)度不等，呈單枝或多分枝狀，并散在許多微血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈小圓形，分布不規(guī)則。培養(yǎng)24h后，可見大量細(xì)胞從微血管段游出，呈短梭形或多角形。培養(yǎng)7~10天，可見細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔，生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)，形成典型的鋪路石樣外觀。細(xì)胞經(jīng)傳代至2代、3代后形態(tài)沒有明顯變化，分裂活性高。細(xì)胞經(jīng)傳代至6~7代時(shí)細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，分裂能力降低，折光性降低。(見圖1)
[0039]2.2第VDI因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定結(jié)果
[0040]細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，細(xì)胞核周圍均出現(xiàn)黃綠色熒光，表明培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞第珊因子相關(guān)抗原染色為陽性，顯微鏡下計(jì)數(shù)，陽性率達(dá)90%，胞質(zhì)與胞核間界限明顯，而對(duì)照組細(xì)胞不染色(陰性)，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為RBMECs (見圖 2)。
[0041]發(fā)明人曾多次嘗試貼塊法、非連續(xù)梯度的percoll分離微血管段法等方法對(duì)BMECs進(jìn)行分離培養(yǎng)，效果不甚理想，經(jīng)過改良和總結(jié)，最后采用15%葡聚糖三次離心，摸索出了這種簡(jiǎn)便易行且能獲得較高純度BMECs的培養(yǎng)方法。
[0042]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法,其特征在于:取7~10日齡SD大鼠分離的大腦皮質(zhì)，經(jīng)II型分散酶消化、兩次加入15%葡聚糖溶液三次離心后獲得大鼠腦微血管段，用膠原酶/分散酶消化后，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對(duì)得到的原代細(xì)胞進(jìn)行純化并傳代培養(yǎng)的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對(duì)純化并傳代培養(yǎng)得到的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定的方法，所述鑒定方法是利用第珊因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法具體包括以下步驟:無菌取5只7~10日齡SD大鼠的大腦，D-HankJ s清洗3次，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)去除軟腦膜及大血管，剝離大腦皮質(zhì)；將分離得到的大腦皮質(zhì)在D-Hank’s中清洗3次，100rpm離心2min棄上清液；加入15% II型分散酶，用5mL移液槍吹打，吹成勻漿狀；37°C水浴消化lOmin，每隔3min用移液槍吹打數(shù)次，800g4°C離心5min，棄上清；加入15%葡聚糖溶液，渦旋2min充分混勻，4500g4°C離心10min，將上層神經(jīng)及大血管移入另一離心管，加入15%葡聚糖溶液，渦旋2min，4500g4°C離心8min ;合并兩次離心得到的紅色沉淀物，4500g4°C再次離心6min,棄去上層神經(jīng)組織和大血管,保留底部紅色沉淀；用D_Hank’ s重懸沉淀，800g4°C離心5min,棄上清；加入ImL膠原酶/分散酶,37°C水浴消化20min,每隔5min吹打數(shù)次，取10 μ L消化液于載玻片在顯微鏡下觀察，可見串珠狀微血管段；加入等量的完全培養(yǎng)基終止消化，800g4°C離心5min，加入完全培養(yǎng)基重懸，接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中；在37°C、5% CO2恒濕恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換完全培養(yǎng)基，得到原代細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要 求4所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對(duì)得到的原代細(xì)胞進(jìn)行純化并傳代培養(yǎng)的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述純化并傳代培養(yǎng)的步驟包括:原代培養(yǎng)細(xì)胞，用37°C預(yù)熱的D-Hank’s清洗3次，然后加入含0.005% EDT A的0.05%胰蛋白酶，37°C消化2~3min，待大部分細(xì)胞收縮變圓時(shí)，棄去胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打使細(xì)胞脫壁，吸取細(xì)胞懸液，添加等量的完全培養(yǎng)基，混勻，按照1:2接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱靜置孵育2h更換完全培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于:所述完全培養(yǎng)基為:20%FBSU % L-谷氨酰胺、青霉素 IXlO4U.ml-1、鏈霉素 I X 14U.mr\ECGS15y g.mL'
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述第珊因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)法的步驟包括:將細(xì)胞傳代至共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)板中，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%匯合狀態(tài)時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預(yù)熱的PBS輕輕清洗3次，加入預(yù)冷的95%乙醇；于_20°C固定20min，吸去乙醇，用PBS連續(xù)漂洗3次，每次3min ;向培養(yǎng)孔中滴加ImL兔抗人第VDI因子相關(guān)抗原抗血清，陰性對(duì)照不加，37°C孵育4h ;用PBS漂洗3次，每次3min ;滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgGlmL，37°C孵育1.5h ;用PBS液漂洗3次，每次3min ;用去離子水沖洗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104031879SQ201410214962
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】董虹, 胡格, 張濤, 姜代勛, 段慧琴, 穆祥, 張倩, 馮波, 王鑫 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院