專利名稱：一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類 似物的基因以及該基因所編碼的多肽。更具體的說，是突變VEGF165的C末端融合有 VEGF183 (131-158)的氨基酸序列的多肽及它的制備方法及可能用途。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)特異地作用 于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是生血管作用特異的刺激劑。VEGF不僅能促進(jìn)新血管的生成(Science 246 1309-1312 J Clin Invest 84 :1470_1478.)，還能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，防止細(xì)胞調(diào)亡 (ExpCell Res 247 495-504 ；Circulation 91 :2802_2809.)，因此，VEGF 有希望成為治療 冠心病、創(chuàng)傷、糖尿病性下肢缺血的理想藥物。然而，美國基因技術(shù)公司(Genetech)用重 組的VEGF165治療心肌缺血時(shí)發(fā)現(xiàn)，VEGF165的全身用藥會(huì)舒張血管，引起病人血壓快速下 降。相反，用表達(dá)VEGF165的裸露DNA多位點(diǎn)注射在局部長(zhǎng)期持續(xù)性的低水平表達(dá)卻沒有 出現(xiàn)血壓下降，能成功治療下肢缺血和冠心病?？梢灶A(yù)測(cè)，對(duì)于VEGF這種開發(fā)前景誘人的 細(xì)胞因子而言，需要一種能將VEGF傳輸?shù)饺毖慕M織，并將VEGF滯留在局部緩慢釋放的方 法。這樣，既能在缺血組織局部促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、防止內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡、誘導(dǎo)新血管 的生成。將VEGF滯留在局部緩慢釋放的研究很多，總體上是通過化學(xué)偶聯(lián)將VEGF連接到 人工基質(zhì)上，通過酶解的方法使得VEGF從基質(zhì)上緩慢釋放。例如，Zisch AH等人建立的方 法較為典型(FASEB J.2003 Dec ；17(15) :2260_2.)，他們將VEGF化學(xué)偶聯(lián)到多分支聚乙二 醇上，并進(jìn)而偶聯(lián)上細(xì)胞黏附肽(R⑶三肽)和基質(zhì)金屬蛋白酶可切割的多肽，制作出生物 可降解的人工基質(zhì)。這種人工基質(zhì)可以黏附細(xì)胞，肌體在缺氧狀態(tài)下基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá) 上調(diào)，從而切割人工基質(zhì)釋放出PEG化的VEGF，在局部發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。類似的研 究還有將VEGF連接到纖維蛋白上，在肌體內(nèi)通過纖溶酶或基質(zhì)金屬蛋白酶水解纖維蛋白， 釋放出 VEGF (Circulation Research. 2004 ；94 1124.)。肌體內(nèi)通常僅發(fā)生局部的缺血，如心肌缺血、下肢缺血等，上述的方法不僅能 將VEGF限制在局部，而且能根據(jù)組織缺氧狀態(tài)釋放VEGF，因此稱為Ce 11-demanded liberation of VEGF(Circulation Research. 2004 ；94 1124.) ^ Cell-demanded release of VEGF (FASEB J. 2003 Dec ；17(15) :2260_2·)。然而，這些含 VEGF 的人工基質(zhì)制 作過程較為復(fù)雜，很難重復(fù)制作出均一的產(chǎn)品，由于涉及化學(xué)偶聯(lián)，產(chǎn)品的質(zhì)量很難保證， 偶聯(lián)的時(shí)間長(zhǎng)一些，VEGF失活多一些，偶聯(lián)時(shí)間短，VEGF失活少，但偶聯(lián)的VEGF也少。需研 制一種注射到缺血組織中能自主結(jié)合到細(xì)胞表面基質(zhì)或人工基質(zhì)上，并能根據(jù)肌體需要進(jìn) 行可控釋放的新型VEGF，將不需要制作人工基質(zhì)，也不需要化學(xué)偶聯(lián)，直接多位點(diǎn)注射到缺 血部位(如糖尿病下肢缺血病人的下肢多位點(diǎn)注射)，既能在缺血組織局部促進(jìn)血管內(nèi)皮 細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)新血管的生成。劉景晶等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)型的VEGF183與VEGF189相比，僅在外顯子6a的C端少了 6個(gè)氨
3基酸，我們稱之為 6a' (Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Mar ；40 (3) 752-9.) 研究證 實(shí)VEGF183在肌體內(nèi)仍可以借助外顯子6a'中富含堿性氨基酸殘基的肽段將自身錨定在 細(xì)胞外基質(zhì)的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(h印aran sulfate proteoglycan, HSPG)上，在肌體 需要的時(shí)候以一種類似于旁分泌的方式(Ectodomain shedding)從基質(zhì)中釋放出來并在 局部發(fā)揮作用。從基質(zhì)中的釋放主要通過酶的水解，在VEGF183的活性中心和細(xì)胞表面基 質(zhì)結(jié)合肽段之間即VEGF183 (132-158)中有纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶以及uPA的切割位點(diǎn) (Angiogenesis. 2002Jan ；4 (2) :103_12·)。所以我們將該肽段融合到突變的VEGF165C末 端，發(fā)現(xiàn)融合有VEGF183 (132-158)的VEGF類似物可原位在體內(nèi)結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)，又可以在 體內(nèi)纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶以及uPA的作用下進(jìn)行釋放，進(jìn)行作用。在VEGF165上同樣也有纖溶酶的切割位點(diǎn)，經(jīng)纖溶酶切割后，N端片段的生物活性 僅為切割前VEGF165的100分之1。通過點(diǎn)突變消除VEGF165的酶切割位點(diǎn)，其體內(nèi)促進(jìn)生 血管活性明顯增強(qiáng)(FEBS Lett. 2002Nov 6 ；531 (2) :309_13.)，表明雖然在體內(nèi)纖溶酶的 切割是細(xì)胞結(jié)合型VEGF(如VEGF183)的釋放機(jī)制，但對(duì)于可溶性的VEGF165而言，酶的切 割卻會(huì)使得活性大部分喪失。所以通過點(diǎn)突變消除VEGF165的纖溶酶的切割位點(diǎn)，生成具有更強(qiáng)生血管活性的 VEGF165突變體；再將VEGF183的外顯子6a肽段連同緊靠該肽段的N端含纖溶酶切割位點(diǎn) 和基質(zhì)金屬蛋白酶的切割位點(diǎn)的肽段移植到VEGF165突變體的C端，得到一種重構(gòu)的VEGF 類似物。本發(fā)明中涉及的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物可以自動(dòng)與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，與野生型 VEGF165相比有較長(zhǎng)的半衰期，且在纖溶酶作用下可釋放，刺激血管新生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種重構(gòu)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物。本發(fā)明的另一目的是提供該內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的制備方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了該血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的基本功能和可 能用途。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了一種可與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類 似物，具有SEQ ID :2所示的氨基酸序列。此類新型VEGF是由VEGF165的C末端加上VEGF183的細(xì)胞表面基質(zhì)結(jié)合肽段6a ‘ 和鄰近外顯子5中含有纖溶酶(plasmin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)以及尿激酶(uPA)的切割 位點(diǎn)的序列即VEGF183 (132-158)序列部分，其中VEGF165在110位置由Gly突變成Pro。 按照VEGF的命名法則(按照所含氨基酸數(shù)目命名)，將之命名為VEGF192。本發(fā)明的第二方面，提供了該類新型內(nèi)皮細(xì)胞因子的制備方法，步驟包括1.構(gòu)建了重構(gòu)新型VEGF192的基因；2.獲得了表達(dá)重構(gòu)新型VEGF192的畢赤酵母克??；3.分離出重構(gòu)VEGF192蛋白。本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供了該新型血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的可能用途?；蜣D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明VEGF192可與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合并可顯著刺激血管生成，大鼠體 內(nèi)ELISA檢測(cè)證明相較野生型的VEGF165，VEGF192有較長(zhǎng)的半衰期。


圖 1 質(zhì)粒 pPIC9K-VEGF192 結(jié)構(gòu)圖。圖2重組質(zhì)粒pPIC9K-VEGF192雙向測(cè)序結(jié)果。圖3SDS-PAGE非變性電泳顯示VEGF192的酵母優(yōu)化表達(dá)圖譜。1.表達(dá)第1天上 清；2.表達(dá)第2天上清；3表達(dá)第3天上清；4.表達(dá)第4天上清；M.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(kDa)。圖4變性與非變性狀態(tài)的SDS-PAGE電泳顯示純化的VEGF192。1.純化VEGF192 (非變性)；2.純化VEGF192 (變性)；3.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(kDa)。圖5SDS-PAGE顯示肝素作用下VEGF165與VEGF192的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合狀態(tài)。1. EMT6細(xì)胞未加肝素的條件培養(yǎng)基；2. EMT6細(xì)胞加肝素的條件培養(yǎng)基；3.表達(dá) VEGF165的EMT6細(xì)胞未加肝素的條件培養(yǎng)基；4.表達(dá)VEGF165的EMT6細(xì)胞加肝素的條件 培養(yǎng)基；5.表達(dá)VEGF192的EMT6細(xì)胞未加肝素的條件培養(yǎng)基；6.表達(dá)VEGF192的EMT6細(xì) 胞加肝素的條件培養(yǎng)基。圖6VEGF192基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)腫瘤周邊血管生成。左圖為對(duì)照組轉(zhuǎn)染有空質(zhì)粒的EMT6細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成，右圖為轉(zhuǎn)染有VEGF192 的EMT6誘導(dǎo)的血管生成。圖7SDS-PAGE電泳顯示纖溶酶切結(jié)果。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(kDa) ；2.纖溶酶切 VEGF192 ；3. VEGF192 對(duì)照。圖8MTT顯示經(jīng)纖溶酶切割后的VEGF192蛋白對(duì)于HUVEC生長(zhǎng)的刺激結(jié)果。
具體實(shí)施例方式(1)菌株和質(zhì)粒宿主菌Escherichia coli (DH5 α )是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究 有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存；ρ⑶ΝΑ3. lplus、畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9K購自與美國 invitrogen 公司。(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑為BBI公司產(chǎn)品；PCR回收試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒均 為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為美國OMEGA公司產(chǎn)品。(3)培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn) Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning ；ALaboratory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。YPD> BMGY 與 BMMYPichia Expression Kit ；A Manual of Methods for Expression ofRecombinant Proteins in Pichia pastoris ；Catalog no. K1710-01 中的配方。其中YNB、生物素均為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。(4)肝素瓊脂糖樹脂為上海諾蕾公司(Novelab)產(chǎn)品。方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 這些在基因工程研究領(lǐng)域都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh EF, ManiatisT. MolecularCloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，pp.16—340。重組蛋白表達(dá)量的測(cè)定采用武漢博士德生物工程有限公司的人VEGF ELISA檢 測(cè)試劑盒。實(shí)施例1重組VEGF192基因的獲得1. VEGF192基因的獲得根據(jù)VEGF165 cDNA與VEGF183 (132-158)序列由01igo6軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，上游 引物，VEGF165ori 5' -GCCAAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3‘ (SEQ ID NO 4)MutllOpro 5' -ATTGTCTTGTCTTGGTCTATCTTTCTTTGGTC-3‘ (SEQ ID NO 5)VEGF165Mid 5' -CCAAGACAAGACAATCCCTGTGGGCCTTGCTCA-3‘ (SEQ ID NO 6)VEGFTerl 5' -TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCA-3‘ (SEQ ID NO 7)165JDP1 5' -GTTTTCTTGGCTTGCGCTATCTTTCTTCCGCCTCGGCTT-3‘ (SEQ ID NO 8)165JDP2 5' -ACCCTTACCCTTACCACGAACTGATTTGTTTTCTTGGCT-3‘ (SEQ ID NO 9)165JDP3 5-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGGATTTCTTGCGCTTGCGTTTTTGACCCTTACCCTT-3(SEQ IDNO 10)VEGF192的構(gòu)建；首先由引物VEGF165ori與VEGF165Mid組合，以基因VEGF165為 模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94°C 5min，94°C Imin，55 lmin，72°C Imin，30個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸lOmin?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物；然后由引物VEGF165ter與MutllOpro組合，以VEGF165 為模板，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C 5min，94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin0回收并純化PCR產(chǎn)物；以上述兩次擴(kuò)增回收片段為模板，以引物VEGF165ori與 VEGFTerl 為組合，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C 5min，94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin, 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物；然后以上次純化的PCR產(chǎn)物為模板，以 引物VEGF165ori與165JDP1組合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C 5min,94°C lmin, 60 °C lmin, 72 °C lmin，30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸lOmin?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物；然后以上次純 化的PCR產(chǎn)物為模板，以引物VEGF165ori與165JDP2組合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)參數(shù) 940C 5min，94°C lmin，57°C lmin, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin0 回收并純化 PCR 產(chǎn)物；以上述兩次擴(kuò)增回收片段為模板，以引物VEGF165ori與165JDP3為組合，進(jìn)行擴(kuò)增， 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)-MV 5min,94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin。回 收并純化PCR產(chǎn)物；用EcoRI和NotI分別對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切、純化，同時(shí)對(duì)Ppic9k用 EcoRI與NotI進(jìn)行雙酶切、純化；T4DNA連接酶4°C過夜連接。構(gòu)建成功的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見附 圖1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，并于含50mg/L氨芐霉素LB固體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 過夜；挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。用PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，送南京金思特公司測(cè)序， 測(cè)序圖見附圖2。實(shí)施例2VEGF192畢赤酵母高表達(dá)克隆的獲得1.大規(guī)模抽提質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確的克隆的DH5 α菌株轉(zhuǎn)接于200ml氨芐LB培養(yǎng)液中，37°C培 養(yǎng)過夜，離心收集菌體，采用OMEGA-midi質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。2.重組質(zhì)粒的線性化及回收
重組質(zhì)粒用Sal去離子水質(zhì)粒Sal IIOXbuffer
酶切，體系如下 76 μ 1 100 μ 1 4μ 1 20 μ 137°C水浴酶切3小時(shí)，65°C滅活20分鐘。酶切產(chǎn)物加入1/10倍體積的NaAc和2 倍體積的無水乙醇沉淀，12000rpm離心lOmin，沉淀溶于20 μ 1無菌去離子水。取1 μ 1檢 測(cè)，其余置-20°C保存?zhèn)溆谩?.GS115酵母感受態(tài)的制備從YPD平板上挑取一獨(dú)立GS115菌落，接種于3mlYPD培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)過 夜，次日轉(zhuǎn)接于IOOmlYPD培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD值為1. 3，菌液分裝于兩個(gè)50ml的離心管中， 1500g離心5min，棄上清，加入IOOml無菌預(yù)冷去離子水，槍吹打重懸。重復(fù)離心一次，再加 入50ml無菌去離子水，重懸菌體，1500g離心5min，再加入20ml IM山梨醇重懸酵母細(xì)胞， 重復(fù)離心一次，棄上清，最后將酵母細(xì)胞重懸于500 μ 1山梨醇中，置于冰上待用。4.線型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母把BIO-RAD電轉(zhuǎn)儀調(diào)好各項(xiàng)參數(shù)(電壓1500ν，電阻200 Ω，電容25uF)。將0. 2cm 的電轉(zhuǎn)杯置80°c烘箱烘干，并放冰上預(yù)冷，加15 μ 1線性化質(zhì)粒于新制100 μ 1感受態(tài)酵母 細(xì)胞中混勻，置冰上預(yù)冷5min，將混勻的質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞加到電轉(zhuǎn)杯的小槽中，點(diǎn)擊，脈 沖為4. 35ms，迅速加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇混勻，吸取200 μ 1涂布于MD平板上，30°C培養(yǎng) 2天，挑選長(zhǎng)出的His+陽性克隆。5. G418高拷貝抗性克隆的篩選將MD平板上長(zhǎng)出的菌落用YPD培養(yǎng)液沖洗下來，測(cè)定酵母菌懸液的OD值，按照 IOD約等于5XlO7ceIVml的量，將其稀釋至每200 μ 1中含有細(xì)胞數(shù)量級(jí)為105。然后涂布 于不同G418濃度梯度的G418-YPD平板上(設(shè)定濃度為0. 5、2、4mg/ml)。30°C培養(yǎng)2天， 挑選最高濃度板上長(zhǎng)出的陽性克隆。實(shí)施例3高拷貝Mut+基因型酵母的表達(dá)與VEGF192的分離純化1. VEGF192的誘導(dǎo)表達(dá)接種篩選出的高拷貝Mut+基因型酵母菌株于YPD培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜， 次日吸取100 μ 1過夜培養(yǎng)物接種于25ml BMGY培養(yǎng)液中，28-30°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至OD = 3.6時(shí)，3500g離心收集菌體，重懸于200ml BMMY培養(yǎng)液中，加入甲醇2ml至濃度為1%， 28-30°C振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)VEGF，連續(xù)4天在固定時(shí)間補(bǔ)加甲醇2ml，發(fā)酵4天后，8000rpm 離心lOmin，每天收集上清lmL，TCA沉淀后用SDS-PAGE檢測(cè)，見附圖3。2. VEGF192的分離純化酵母發(fā)酵上清在0. IMNacl 20mmol/LTris-HCl (PH8. 0)中4°C透析平衡過夜，經(jīng) 0. 45 μ m濾器過濾，上樣于H印arin-s印harose CL6B親和柱，用含0. 5M NaCl的20mmol/L Tris-HCl (PH8. 0)溶液進(jìn)行洗脫，流速lml/min，0D28(1nm檢測(cè)出峰情況，收集最后一個(gè)出峰 組分。變性與非變性SDS-PAGE檢測(cè)，見附圖4。實(shí)施例4VEGF192半衰期測(cè)定通過ELISA方法研究了 VEGF突變體的半衰期，結(jié)果顯示VEGF突變體大鼠體內(nèi)的
7代謝速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于野生型的VEGF165。野生型VEGF165半衰期在45分鐘以內(nèi)，20 μ g在大 鼠體內(nèi)1.5小時(shí)已經(jīng)檢測(cè)不到，而VEGF突變體半衰期在8小時(shí)；20 μ g VEGF192在大鼠體 內(nèi)8小時(shí)血液濃度仍達(dá)322pg/ml。實(shí)施例5細(xì)胞外基質(zhì)的粘附實(shí)驗(yàn)按照Invitrogen說明書將重構(gòu)的VEGF192基因與野生型的VEGF165瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小 鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6轉(zhuǎn)染24孔板4個(gè)孔，培養(yǎng)1天后，棄去培養(yǎng)液，然后4個(gè)孔中每?jī)蓚€(gè)孔 分別添加含肝素50 μ g/mL1640培養(yǎng)基(不含血清)與不含肝素的1640培養(yǎng)基500 μ L，另 外2個(gè)對(duì)照ΕΜΤ6孔(未轉(zhuǎn)染)同上操作，超濾管濃縮50倍，進(jìn)行western blot，見附圖5。實(shí)施例6VEGF192體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)將VEGF192穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6，并篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF192的細(xì)胞 單克隆，25000個(gè)細(xì)胞注射BAL\B小鼠皮內(nèi)，5天后剝皮檢查它對(duì)瘤周邊血管生成的影響，見 附圖6。實(shí)施例7VEGF192的纖溶酶切依據(jù)Roche 纖溶酶說明書，將 1. 6mL solution 1,0. 2mL solution II， 0. 4mL solutionIILO. 2mLsolutionIV,混勻，37 °C 酶切 4h，其中 2μ g VEGF 溶于 0. 4mL solutionIILO. OlU 纖溶酶溶于 0. 2mLsolutionIV，超濾管濃縮至 100 μ L，SDS-PAGE 電泳檢 測(cè)，見附圖7所示。實(shí)施例8VEGF192活性鑒定5000個(gè)左右HUVEC細(xì)胞接種于鋪有明膠的96孔板中，在含20%胎牛血清的Μ199 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)，然后100 μ 1換成5 %胎牛血清培養(yǎng)過夜，2 μ g VEGF165與突變體 VEGF經(jīng)纖溶酶24小時(shí)酶切后，置換于20毫升的含5% FBS的M199培養(yǎng)基中，MTT法檢測(cè)對(duì) HUVEC的增殖刺激。加10μ 1 MTT培養(yǎng)三小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)基，加100 μ 1 DMSO混勻，490nm 下測(cè)其吸光度(OD)，結(jié)果見附圖8。SEQUENCE LISTING<110>中國藥科大學(xué)<120> —種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物<160>10<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>27<212>PRT<213> 人工的<400>1Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly151015Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg2025<210>2<211>1920101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108]
0109]
0110] 0111] 0112]
0113]
0114]
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126] 0127]
<212>PRT <213>融合蛋白 <400>2
Ala Pro Met Ala
1
Phe
Met Asp
Val Asp
Pro
Gly
65
Met
Ser
50
Leu
lie
35
Cys
Glu
lie
Val 20 Phe
Arg Leu Gln His Glu
Gln
Val
Arg 145 Asp
Gln 130
Cys Lys
Asn 115
Asp Pro
Lys Val Arg Gly
Glu 5
Tyr
Gly Gln Gln Glu
Gly Gly Gln Arg Ser Tyr
Val Pro Leu Met 55 Thr
Cys Val Lys
Asn 100
Pro
Ala Pro Arg
Lys 180
Pro
85
Lys
Cys
Gln
Arg
Arg 165 Gly
Pro
70
His
Gln Glu
Cys Gly Pro Thr
Gln 150
Lys
Cys 135 Leu
Pro
40
Arg
Glu
Gly
Cys
Cys 120 Lys
Tyr
25
Asp
Asn His His 10
Cys His Pro
Glu Val lie
Glu Gly
Cys Glu Ser Gln
lie Glu Gly
Arg 105
Ser
His
90
Pro
Asn
75
lie
Lys Glu Arg Cys Ser Cys
Lys Lys Gly
Glu Leu Asn Asp Arg Gln
Cys
60
lie
Gly
Lys
Arg
Lys 140 Arg
Tyr
45
Cys
Glu 30
lie
Val
15
Thr
Thr Glu Met Asp
Phe Asn Asp Met Gln
Glu 155
Lys Pro
Lys 125 Asn
Thr
Glu
Lys 185
Thr 170
Arg Lys Arg Lys
Arg 110 His
Thr
Cys
Asn
Lys 190
Ser
95
Ala
Lys
Leu
Lys
Glu
lie 80 Phe
Arg
Leu Phe
Asp Ser
Arg Cys 160 Lys Ser 175
Ser Arg
0128]<210>30129]<211>5760130]<212>DNA0131]<213>融合基因0132]<400>30133]gcacccatggcagaaggagg0134]tatcagcgcagctactgcca0135]gatgagatcgagtacatctt0136]tgcaatgacgagggcctgga0137]atgcggatcaaacctcacca0138]aaatgtgaatgcagaccaaa0139]tcagagcggagaaagcattt
agggcagaat catcacgaag tccaatcgag accctggtgg caagccatcc tgtgtgcccc gtgtgtgccc actgaggagt aggccagcac ataggagaga gaaagataga ccaagacaag gtttgtacaa gatccgcaga
tggtgaagtt catggatgtc60
acatcttcca ggagtaccct120
tgatgcgatg cgggggctgc180
ccaacatcac catgcagatt240
tgagcttcct acagcacaac300
acaatccctg tgggccttgc360
cgtgtaaatg ttcctgcaaa420
9
aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt 480gacaagccga ggcggaagaa agatagcgca agccaagaaa acaaatcagt tcgtggtaag 540ggtaagggtc aaaaacgcaa gcgcaagaaa tcccgt576<210>4<211>33<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>4GCCAAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG<210>5<211>32<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>5ATTGTCTTGTCTTGGTCTATCTTTCTTTGGTC<210>6<211>33<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>6CCAAGACAAGACAATCCCTGTGGGCCTTGCTCA<210>7<211>27<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>7TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCA<210>8<211>39<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>8GTTTTCTTGGCTTGCGCTATCTTTCTTCCGCCTCGGCTT<210>9
<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>9ACCCTTACCCTTACCACGAACTGATTTGTTTTCTTGGCT<210>10<211>58<212>DNA<213> 人工的<223> 引物<400>10ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGGATTTCTTGCGCTTGCGTTTTTGACCCTTACCCTT
1權(quán)利要求
一種人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物，具特征在于其由突變VEGF165的完整序列在其碳末端融合有肽段VEGF183(131 158)。
2.權(quán)利要求1中肽段VEGF183(131-158)的氨基酸序列，其特征在于包含SEQ N0:1所 示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1中含有的突變VEGF165是指VEGF165蛋白中110的Gly突變成Pro。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物，其特征在于，它包含SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。
5.一種設(shè)計(jì)合成的多核苷酸，其特征在于該核苷酸具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸 序列，該核苷酸序列編碼權(quán)利要求4所示氨基酸序列的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所示的人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的制備方法，其步驟包括(1)構(gòu)建一種可復(fù)制的表達(dá)載體，該載體包含一段編碼具有SEQID NO :2的人內(nèi)皮細(xì) 胞生長(zhǎng)因子類似物的DNA序列。(2)人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的表達(dá)，其中宿主選用優(yōu)選的宿主菌，檢測(cè)方法用 SDS-PAGE ；(3)分離得到人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的制備方法，其特征在于用優(yōu)選 的宿主菌為酵母菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于步驟(3)中采 用層析方法為瓊脂糖肝素柱親和層析法，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)達(dá)到電泳純。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物，具有較長(zhǎng)的半衰期，與細(xì)胞外 基質(zhì)較強(qiáng)的親和力，在體內(nèi)有刺激血管生成的功能，經(jīng)纖溶酶切割后體外可刺激人血管內(nèi) 皮細(xì)胞生長(zhǎng)。
10.權(quán)利要求4中重組蛋白在預(yù)防或治療缺血性疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物的構(gòu)建及制備方法。發(fā)明的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子類似物VEGF192是通過將VEGF165中110位置的Gly突變成Pro，且在其C末端融合有VEGF183(131-158)的氨基酸序列，使之即能與細(xì)胞外基質(zhì)緊密結(jié)合，又可在纖溶酶的作用下進(jìn)行釋放。通過畢赤酵母表達(dá)的方法進(jìn)行了制備，用親和層析的方法進(jìn)行了純化，并證明了其具有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合活性且在體外能被纖溶酶切割釋放。測(cè)定VEGF192在體內(nèi)的半衰期達(dá)到8小時(shí)，而野生型VEGF165僅為45分鐘左右，說明VEGF192在體內(nèi)作用時(shí)間顯著延長(zhǎng)。體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示VEGF192具有刺激HUVEC增殖的功能，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明VEGF192可刺激血管生成，可應(yīng)用于血管再生及相關(guān)的生物工程領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K38/18GK101935351SQ201010018358
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者劉景晶, 孟雨涵, 張會(huì)勇, 張宇, 曹榮月, 李泰明, 胡向兵, 魯勇 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)