專利名稱：牛體外胚胎兩段培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的體外胚胎培養(yǎng)方法，具體地說，涉及合成輸卵管液(SOF)在牛胚胎體外培養(yǎng)中的應(yīng)用，可用于利用超排的或屠宰場(chǎng)卵巢獲取的卵母細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆家畜、家畜育種及瀕危物種的保護(hù)。屬于應(yīng)用型胚胎生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)是胚胎移植技術(shù)中重要的環(huán)節(jié)。采用超排卵或屠宰場(chǎng)來源的卵巢卵母細(xì)胞體外受精后進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)，充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，為胚胎移植提供充足的胚源。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使得優(yōu)良后代數(shù)量成倍增長(zhǎng)，加快了優(yōu)良品種擴(kuò)繁和動(dòng)物育種的步伐?；谠擁?xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，其中在牛單胎動(dòng)物生產(chǎn)方面尤為突出。牛卵母細(xì)胞體外受精后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，同時(shí)結(jié)合胚胎移植集成的MOET技術(shù)，加速了優(yōu)良牛品種擴(kuò)繁，縮短了世代間隔，提高了畜牧業(yè)生產(chǎn)效率，獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。目前畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用SOF液進(jìn)行牛體外胚胎生產(chǎn)，SOF液培養(yǎng)方法為胚胎全程培養(yǎng)7d。在培養(yǎng)7d后將獲 取的囊胚進(jìn)行胚胎移植。盡管牛附植胚胎發(fā)育期間能夠利用葡萄糖，但是許多研究發(fā)現(xiàn)SOF液內(nèi)添加葡萄糖對(duì)早期胚胎發(fā)育有毒害作用，且一些研究表明體外培養(yǎng)期間葡萄糖降低了囊胚率。但是不添加葡萄糖或者葡萄糖濃度過低，同樣不利于牛胚胎的發(fā)育。因此，體外培養(yǎng)期間如何通過合理的使用葡萄糖作為能源提高胚胎發(fā)育能力是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛體外胚胎兩段培養(yǎng)的方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于牛體外胚胎兩段培養(yǎng)的培養(yǎng)試劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:牛體外胚胎兩段培養(yǎng)方法，該方法首先將牛受精卵在含0.12 0.16mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)2 3天，然后在含1.8 2.2mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)4 5天。優(yōu)選地，該方法首先將牛受精卵在含0.15mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)2天，然后在含2mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)5天。上述培養(yǎng)條件優(yōu)選為含5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度。本發(fā)明還包括在牛受精卵培養(yǎng)前進(jìn)行牛卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的步驟。其中，卵母細(xì)胞體外成熟的方法是:將挑選出的A、B級(jí)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體在洗卵液中清洗3次，成熟液清洗2次，然后放入預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡2h以上的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為含5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為24h。其中，體外受精的方法是:采用培養(yǎng)皿微滴法，首先將成熟的卵母細(xì)胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中；然后采用上浮法處理冷凍精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800 μ I放入1.5ml離心管離心2次，離心后除去上清加入洗精液最終體積為250 μ 1，取50 μ I處理后的精液加入已放入卵母細(xì)胞的受精液中，精子終濃度為IX IO6精子/ml，培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，受精時(shí)間為8h。本發(fā)明還提供一種用于牛體外胚胎培養(yǎng)的試劑，其包括A液:含0.12 0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液:1.8 2.2mM葡萄糖的SOF液。優(yōu)選地，所述A液為含0.15mM葡萄糖的SOF液。所述B液為含2mM葡萄糖的SOF液。本發(fā)明研究人員經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)的SOF液的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整葡萄糖的濃度和培養(yǎng)時(shí)間提高了囊胚發(fā)育率，能夠成為體外胚胎培養(yǎng)液在畜牧業(yè)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1牛胚胎體外培養(yǎng)本發(fā)明通過采用兩種含有不同濃度葡萄糖的SOF培養(yǎng)液培養(yǎng)牛胚胎建立新型的牛胚胎體外培養(yǎng)體系。主要采用兩段培養(yǎng)方法:首先在胚胎含有0.15mM濃度的SOF液內(nèi)培養(yǎng)5天，然后在含有2mM濃度的SOF液內(nèi)培養(yǎng)2天后計(jì)數(shù)囊胚率，同時(shí)以含有0.15mM低濃度和2mM高濃度葡萄糖的SOF液標(biāo)準(zhǔn)一段培養(yǎng)為對(duì)照，培養(yǎng)7天計(jì)數(shù)囊胚率。具體地說，使用本發(fā)明SOF液的牛胚胎體外培養(yǎng)方案:(I)卵母細(xì)胞體外成熟:將挑選出的A、B級(jí)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)在洗卵液(TCM199-Hepes)中清洗 3 次，成熟液(含 FSHlO μ g/ml，LHl μ g/ml，E21 μ g/ml，EGF10ng/ml，10%FBS的TCM199培養(yǎng)液)清洗2次，然后放入預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡2h以上的成熟培養(yǎng)液(含 FSHlOy g/ml, LHl μ g/ml，E21 μ g/ml, EGF10ng/ml, 10%FBS 的 TCM199 培養(yǎng)液)中培養(yǎng)(四孔板培養(yǎng)，500ul體積成熟液，50枚左右卵母)培養(yǎng)條件為含5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為24h。(2)體外受精采用培養(yǎng)皿微滴法，首先將成熟的卵母細(xì)胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中(50ul受精液，15枚卵母細(xì)胞)；然后采用上浮法處理冷凍精液，精子在洗精液上浮20_30min,然后取上清600-800 μ I放入1.5ml離心管離心(1500轉(zhuǎn),離心5min)2次，離心后除去上清加入洗精液最終體積為250 μ 1，取50 μ I處理后的精液加入已放入卵母細(xì)胞的受精液中，精子終濃度為I X IO6精子/ml，培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，受精時(shí)間為8h。(3)體外胚胎生產(chǎn)受精后的合子在前期發(fā)育液洗滌3次(發(fā)育液2ml)后采用四孔板兩步法培養(yǎng):首先在500 μ I前期發(fā)育液(含0.15mM葡萄糖的SOF液)(50枚左右合子)培養(yǎng)2d，計(jì)數(shù)卵裂胚胎后移入500ul后期發(fā)育液(含2mM葡萄糖的SOF液)培養(yǎng)5d，間隔2d半量換液，胚胎發(fā)育第2天計(jì)數(shù)卵裂胚胎，7天 計(jì)數(shù)囊胚。培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度。一段SOF培養(yǎng)計(jì)數(shù)卵裂和囊胚同兩段法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表I )，兩段SOF胚胎培養(yǎng)方法相對(duì)一段SOF液含有低濃度(0.15mM)和高濃度葡萄糖(2mM)培養(yǎng)方法顯著提高了囊胚率(P〈0.05)。表1不同的SOF液對(duì)牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響(平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤)
權(quán)利要求
1.牛體外胚胎兩段培養(yǎng)方法，該方法首先將牛受精卵在含0.12 0.16mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)2 3天，然后在含1.8 2.2mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)4 5天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法首先將牛受精卵在含0.15mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)2天，然后在含2mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)5天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)條件均為含5%C02的空氣，溫度39 °C，飽和濕度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，該方法還包括在牛受精卵培養(yǎng)前進(jìn)行牛卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，卵母細(xì)胞體外成熟的方法是:將挑選出的A、B級(jí)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體在洗卵液中清洗3次，成熟液清洗2次，然后放入預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡2h以上的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為含5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，體外受精的方法是:采用培養(yǎng)皿微滴法，首先將成熟的卵母細(xì)胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中；然后采用上浮法處理冷凍精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800 μ I放入1.5ml離心管離心2次，離心后除去上清加入洗精液最終體積為250 μ 1，取50 μ I處理后的精液加入已放入卵母細(xì)胞的受精液中，精子終濃度為I X IO6精子/ml，培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，受精時(shí)間為8h。
7.一種用于牛體外胚胎培養(yǎng)的試劑，其包括A液:含0.12 0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液:1.8 2.2mM葡萄糖的SOF液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試`劑，其特征在于，所述A液為含0.15mM葡萄糖的SOF液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑，其特征在于，所述B液為含2mM葡萄糖的SOF液。
全文摘要
本發(fā)明公開了牛體外胚胎兩段培養(yǎng)方法，該方法首先將牛受精卵在含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)2～3天，然后在含1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液中培養(yǎng)4～5天。本發(fā)明還提供了一種用于牛體外胚胎培養(yǎng)的試劑，其包括A液含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液。本發(fā)明在傳統(tǒng)的SOF液的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整葡萄糖的濃度和培養(yǎng)時(shí)間提高了囊胚發(fā)育率，能夠成為體外胚胎培養(yǎng)液在畜牧業(yè)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/073GK103103160SQ20131002945
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者賈振偉, 張顯華, 張穎 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古民族大學(xué)