專利名稱：一株高效轉(zhuǎn)化黃姜皂苷的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及利用菌株海洋紅酵母( o￡/oiorw7a)ST_02高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
薯蕷皂苷元，Steroids留體類藥物，是生產(chǎn)留體激素類藥物的重要基礎(chǔ)原料，被醫(yī)藥界稱為“藥用黃金”，藥用價(jià)值非常重要和廣闊。在世界的甾體醫(yī)藥原料的行業(yè)的歷史中，我國的薯蕷皂苷元生產(chǎn)一直處于主導(dǎo)和壟斷的地位，占領(lǐng)全世界留體醫(yī)藥原料的90%以上市場份額。留體激素類藥物是在臨床上具有重要應(yīng)用的一類藥物，具有很強(qiáng)的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克的藥理作用，是治療風(fēng)濕、心血管、淋巴白血病、細(xì)胞性腦炎、皮膚病、抗腫瘤和搶救危重病人的重要用藥，也是僅次于抗生素的第二大類藥物。目前薯蕷皂苷元的常用工業(yè)生產(chǎn)方法是用酸解的方法從黃姜(盾葉薯蕷)中提取，這種方法最大的弊端在于造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。為響應(yīng)可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)要求，用微生物轉(zhuǎn)化法結(jié)合酶解法生產(chǎn)薯蕷皂苷元以成為清潔生產(chǎn)領(lǐng)域最大的熱門之一。經(jīng)過一系列研究，木霉屬和曲霉屬的一些微生物已被發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并且條件溫和，環(huán)境友好，但轉(zhuǎn)化效率低，副產(chǎn)物多，不符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。如何提高微生物轉(zhuǎn)化效率是目前清潔生產(chǎn)研究中的重大難題，海洋紅酵母ben thica) ST-02菌株高效率轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生成薯蕷皂苷元的特點(diǎn)，為工業(yè)生產(chǎn)薯蕷皂苷元帶來了福音和廣闊的市場前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提 供一株高效轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯蕷皂苷元的海洋紅酵母(.Rhodotorula benthica) ST-02,以及利用該菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯菌阜苷元的方法,滿足工業(yè)生
產(chǎn)高產(chǎn)率需求。本發(fā)明的發(fā)明人從實(shí)驗(yàn)室保存的真菌中篩選到一株轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯蕷皂苷元的微生物，該菌于2012年11月19日保藏在位于北京市朝陽區(qū)大屯路的中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6837，分類命名% Rhodo torula benthica。應(yīng)用上述微生物轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，其步驟如下:
(1)采用保藏號為CGMCCN0.6837的菌株海洋紅酵母benthica)
為生產(chǎn)菌種，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到查氏培養(yǎng)基上；
(2)制備ST-2菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物:挑取步驟(I)的查氏固體培養(yǎng)基上的ST-2菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有30-50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為30_40°C，置搖床上以150-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-24 h至對數(shù)生長中期，即得到ST-2菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以5-9%(w/w)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500 mL錐形瓶中裝50-100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25_40°C，在120-220 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20-24 h，得發(fā)酵液。(4)生物轉(zhuǎn)化:精確稱取適量黃姜皂苷，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使其終濃度為3-5 g/L，在轉(zhuǎn)化溫度30°C，200-220 r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化144-168 h，即得轉(zhuǎn)化液。(5)產(chǎn)物檢測:將步驟(4)的轉(zhuǎn)化液在10000-12000 r/min下離心10-15 min，沉淀用與轉(zhuǎn)化液同體積的60 0C _90°C石油醚抽提2次，合并抽提液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋至有晶體出現(xiàn)，乙腈復(fù)溶晶體并通過0.22 μ m的有機(jī)膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析薯蕷皂苷元的含量。其中步驟(I)中所述的查氏固體培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖30 g/L，硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L，水1000 mL,自然pH。在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;步驟(2)所述種子培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖20 g/L，硫酸銨2 g/L，硝酸鈉2 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 8/1，七水硫酸鐵0.01 g/L，水1000 mL，自然pH，在121°C高壓蒸汽下滅菌20 min;步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖20 8/1，硫酸銨2.5 g/L,硝酸鈉2.5 g/L，氯化鈉4 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，七水硫酸鎂1.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L，黃姜皂苷3 g/L，，水1000 mL，自然pH，121°C高壓蒸汽下滅菌20min。本發(fā)明所述的海洋紅酵母Ae/ iAica)ST-02菌株首次發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)化生成薯蕷皂苷元，并且能達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求，是一株極具開發(fā)研究價(jià)值的生產(chǎn)菌株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1醇提法得到黃姜皂苷
將鮮黃姜切成I Cm左右小塊，80 °C烘干，粉碎機(jī)粉碎。圓底燒瓶中加入1000 ml無水乙醇，再倒入100 g黃姜粉末，加熱至微沸，回流提取2次，每次4 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到醇溶皂苷。稱取圓底燒瓶和皂苷的重量a，加入300 mL去離子水，超聲使皂苷與水充分混溶，倒出皂苷，稱量圓底燒瓶的重量b，a-b即是醇溶皂苷的重量。實(shí)施例2酶解法得到黃姜皂苷
稱取100 g干黃姜粉，加入1000 mL水中，煮沸I h，冷卻，調(diào)整pH為6.5，加入中溫淀粉酶1.5 mL,65 °C溫育I h。冷卻后調(diào)整pH為6.0，加入耐高溫淀粉酶1.0 mL,80 °C溫育I h。冷卻，調(diào)整pH為5.5，加入液體糖化酶2 mL，60 °C溫育8 h。冷卻，4000 rpm離心30min,取沉淀，60°C烘干至恒重，稱重。實(shí)施例3得到黃姜皂苷
稱取鮮黃姜312 g (約合100 g干黃姜)粉碎，磨漿。加去離子水300 mL洗滌，經(jīng)兩層紗布擠壓過濾。濾渣加300 mL去離子水洗滌，重復(fù)過濾。①濾液靜置6 h，物料分為3層，上層為清液(紅褐色)，中間層為黃姜懸濁液，下層為淀粉(白色)。吸取上清液，傾倒懸濁液，可得到下層的淀粉，60 °C烘干稱重。②濾渣，即纖維渣，重復(fù)水洗6次(每次用水200 mL)，得纖維素，105°C烘干，稱重。水洗液抽濾，濾渣與①所得懸濁液合并。調(diào)整懸濁液PH為6，加入耐高溫淀粉酶0.5 mL和糖化酶2 mL,60 °C酶解6 h。酶解結(jié)束后8000 rpm離心10 min，取沉淀60 °C干燥得皂苷，稱重。
實(shí)施例4利用海洋紅酵母(7 Ao￡/oiorw7a AefliAica ) ST-02轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯菌阜苷元
(I)制備海洋紅酵母0 oi/oioiT/7a ben thi ca) ST-02菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物
挑取固體查氏培養(yǎng)基上的海洋紅酵母( o￡/oiorw7a ben thica ) ST-02菌株一環(huán),接種在裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30°C置于搖床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)
24-28 h至對數(shù)期，即制得該菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)按以下配方及配比制備發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖20 8/1，硫酸銨2.5 g/L，硝酸鈉2.5g/L，氯化鈉4 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，七水硫酸鎂1.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L,水1000 mL ,pH自然，121°C高壓蒸汽下滅菌20 min。(3)搖瓶發(fā)酵:將上述步驟(I)制備的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以5-9% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30-40°C條件下，置于搖床上以150-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵12-24 h，菌體進(jìn)入對數(shù)中后期。(4)生物轉(zhuǎn)化:精確稱取適量黃姜皂苷，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使黃姜皂苷終濃度為4 g/L，在轉(zhuǎn)化溫度30°C，200-220 r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化100-120 h。實(shí)施例5石油醚提取轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的薯蕷皂苷元
10000-12000 r/min離心轉(zhuǎn)化液15 min，取沉淀，加入石油醚(沸點(diǎn)60 °C 90 °C ) 20mL超聲提取兩次，每次4 h， 合并提取液，80 °C濃縮至20 mL左右。得到薯蕷皂苷元的石油醚溶液。
權(quán)利要求
1.一株高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的菌株，該菌株為海洋紅酵母iRhodo torula ben thica ) ST-02,保藏在位于北京市朝陽區(qū)大屯路的中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6837，分類命名％ Rhodotorula AefliAica，保藏日期為2012年11月19日。
2.利用海洋紅酵母知/ iAica)ST-02(保藏編號為CGMCC N0.6837)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，其特征為:500 mL三角瓶裝50-100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量按體積比為5-9%，培養(yǎng)溫度30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速150-200 r/min，培養(yǎng)24 h后投入一定量的底物黃姜皂苷，繼續(xù)轉(zhuǎn)120 h ;所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖20-40 g/L，NaNo3 0.3-1.7 g/L, (NH4)2SO4 0.3-1.7 g/L, NaCl 1.5-3 g/L, MgSO4 0.1-1 g/L, K2HPO4 0.1-1.0 g/L，F(xiàn)eS04.7H2O 0.01-0.10 g/L, pH 6.5-7.5，121°C 高壓蒸汽下滅菌 20 min。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及利用菌株海洋紅酵母(Rhodotorulabenthica)ST-02高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，并且能達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求，是一株極具開發(fā)研究價(jià)值的生產(chǎn)菌株。
文檔編號C12R1/645GK103114047SQ201310040600
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月3日
發(fā)明者馬洋, 許正宏, 史勁松, 徐起, 李會, 張佳佳, 張曉梅, 李恒 申請人:江南大學(xué)