Bcr-abl融合基因快速檢測(cè)方法的引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法的引物和試劑盒，本發(fā)明提供了用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)BCR-ABL基因的引物，建立了白血病微小殘留病BCR-ABL基因檢測(cè)新方法。擴(kuò)增效率高、特異性好、對(duì)儀器設(shè)備要求低，只需要恒溫水浴鍋即可，臨床上容易做到，檢測(cè)時(shí)間不超過1個(gè)小時(shí)，是一種快速、準(zhǔn)確診斷基因的新方法。本試劑盒實(shí)現(xiàn)了基因擴(kuò)增和結(jié)果判定一步完成，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確直觀、特異性與敏感性高、對(duì)人體安全、不污染環(huán)境，適合于各級(jí)醫(yī)院快速診斷白血病微小殘留病，排除了基層醫(yī)院難以開展此類檢查的障礙，患者可以就近檢查，而不用再長(zhǎng)途奔波到條件好的大醫(yī)院，方便了患者，節(jié)省了費(fèi)用，為救治生命節(jié)約了寶貴時(shí)間。
【專利說明】BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法的引物和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因的快速檢測(cè)方法，尤其涉及一種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法 的引物和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 白血病是一種造血系統(tǒng)惡性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)步，白血病經(jīng)過 積極治療，多數(shù)患者能取得緩解，但很多患者緩解后體內(nèi)仍殘留少量白血病細(xì)胞，即存在白 血病微小殘留?。∕RD)。白血病微小殘留病是白血病復(fù)發(fā)的首要原因。白血病患者完全緩 解后，檢測(cè)體內(nèi)殘留白血病細(xì)胞，可以預(yù)防及防止復(fù)發(fā)，指導(dǎo)個(gè)性化治療，因此，對(duì)患者進(jìn)行 白血病微小殘留病監(jiān)測(cè)具有重要意義。
[0003] 慢性粒細(xì)胞白血病（CML)是骨髓造血干細(xì)胞惡性克隆增生性疾病，約95% CML可 發(fā)生t (9 ;22) (q34 ;qll)基因易位，形成BCR-ABL融合基因，BCR-ABL融合基因編碼的蛋白 具有升高酪氨酸激酶活性，在CML的病理過程中起重要作用，其表達(dá)可作為微小殘留病的 標(biāo)志。既往多用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)檢測(cè)BCR-ABL融合基因。PCR存在反應(yīng)后 要開蓋進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，常存在污染和非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性，另外還存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作 復(fù)雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大、重復(fù)性差、定量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，并且檢測(cè)需要4-5個(gè)小時(shí)，而且PCR結(jié)束之 后需要通過電泳判斷結(jié)果，電泳所用DNA染料EB有劇毒等諸多缺點(diǎn)。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 2000 年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循 環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以不依賴任何專門的儀器 設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，該方法推廣期主要面對(duì)微 生物檢測(cè)，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，并有很多相關(guān)專利獲得授權(quán)，但因研究人 員了解不足，而且人體基因比微生物更復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)外均未見使用LAMP方法檢測(cè)白血病 BCR-ABL基因的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法 的引物和試劑盒。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法的引物，包括：引物Pl，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示；引物P2,其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；引物P3,其核苷酸序列如SEQID NO :3所示；引物P4,其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0008] 上述引物在檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病微小殘留病中的應(yīng)用。
[0009] 一種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法的試劑盒，內(nèi)含LAMP反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性 對(duì)照，所述 LAMP 反應(yīng)液的成分為：0. 04ymol/yL pH 為 8. 8 的 Tris-HCl，0. 02ymol/yL 的 KC1，0. 016μπιο1/μ L 的 MgS04,0 . 02μπιο1/μ L 的（HN4)2S04,0 . 00 2μ l/μ L 的 Tween20, 1.6ymol/yL WSf 0. 0028 μ mol/μ LX 4 ^ dNTPs, IOU/μ L ^g|, 8U/μ L ^Bst 0嫩聚合酶，0.00005以111〇1/^1^的鈣黃綠素，1.6?111〇1/^1^的引物？1，1.6?111〇1/^1^的引物 Ρ2,0· 2pmol/y L 的引物 Ρ3,0· 2pmol/y L 的引物 P4 ;
[0010] 所述陽(yáng)性對(duì)照為：反應(yīng)時(shí)在反應(yīng)液中加入BCR-ABL基因表達(dá)陽(yáng)性的Κ562細(xì)胞基因 組 RNA ;
[0011] 陰性對(duì)照為：反應(yīng)時(shí)在反應(yīng)液中加入超純水。
[0012] 上述試劑盒中LAMP反應(yīng)液為Iml、陽(yáng)性對(duì)照50 μ L、陰性對(duì)照Iml。
[0013] 上述試劑盒還包括：反應(yīng)管50個(gè)，1-10 μ L移液器頭100個(gè)。
[0014] 上述試劑盒的使用方法：取20 μ L反應(yīng)液置于反應(yīng)管中，將5 μ L待檢RNA加入反 應(yīng)液內(nèi)，用移液器吹打混勻，蓋好反應(yīng)管的蓋子，將反應(yīng)管置于水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條 件為：60-65°C水浴恒溫反應(yīng)40-45min，觀察顏色變化；用戶在初次使用時(shí)需要設(shè)置陰性對(duì) 照和陽(yáng)性對(duì)照。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 為了解決以往白血病微小殘留病檢測(cè)中易出現(xiàn)假陽(yáng)性、檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜、檢 測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問題，本發(fā)明提供了用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)BCR-ABL基因的引物，建立了 白血病微小殘留病BCR-ABL基因檢測(cè)新方法。
[0017] 該方法擴(kuò)增效率高、特異性好、對(duì)儀器設(shè)備要求低，只需要恒溫水浴鍋即可，臨床 上容易做到，檢測(cè)時(shí)間不超過1個(gè)小時(shí)，是一種快速、準(zhǔn)確診斷基因的新方法。
[0018] 反應(yīng)液中預(yù)先加有逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增一步完成，而不需要預(yù)先將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行DNA擴(kuò)增，簡(jiǎn)化了操作步驟。
[0019] 采用本試劑盒通過檢測(cè)BCR-ABL基因診斷CML微小殘留病，從取得樣本到結(jié)果判 定結(jié)束可以控制在2h內(nèi)，采用本試劑盒，實(shí)現(xiàn)了基因擴(kuò)增和結(jié)果判定一步完成，操作簡(jiǎn)單、 結(jié)果準(zhǔn)確直觀、特異性與敏感性高、對(duì)人體安全、不污染環(huán)境，適合于各級(jí)醫(yī)院快速診斷慢 性粒細(xì)胞白血病微小殘留病，排除了基層醫(yī)院難以開展此類檢查的障礙，患者可以就近檢 查，而不用再長(zhǎng)途奔波到條件好的大醫(yī)院，方便了患者，節(jié)省了費(fèi)用，為救治生命節(jié)約了寶 貴時(shí)間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為裸眼目視觀察反應(yīng)結(jié)果，其中，1號(hào)管為檢測(cè)管，2號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，3號(hào)管為 陰性對(duì)照；
[0021] 圖2為L(zhǎng)AMP法目視檢測(cè)試劑盒靈敏性結(jié)果，其中，1-5號(hào)管中加入的為倍比稀釋的 RNA，濃度依次為1000、100、10、1、0. Ing/μ 1，1-4號(hào)為陽(yáng)性，5號(hào)為陰性；
[0022] 圖3為L(zhǎng)AMP法目視檢測(cè)試劑盒特異性結(jié)果，1-5號(hào)管為CML患者樣本，6-10號(hào)管 為正常人樣本；1-5號(hào)為陽(yáng)性，6-10為陰性。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0024] 1.材料與方法
[0025] I. 1樣本：用培養(yǎng)的K562細(xì)胞（慢性髓原白血病細(xì)胞）的基因組總RNA作為標(biāo)準(zhǔn) 品用于本方法的建立，臨床樣本采用抗凝外周血或骨髓0. 2-1. Oml。
[0026] 1. 2基因組總RNA提?。豪蒙唐坊腞NA提取試劑盒（購(gòu)自北京天恩澤生物技 術(shù)有限公司，型號(hào)為3701-50)抽提總RNA，室溫操作。
[0027] 抽提總RNA具體操作步驟：
[0028] (1)將0· 2-1. 5mL抗凝全血13000g離心3分鐘，棄上清；
[0029] (2)將ImL溶液A加入到血液細(xì)胞沉淀中，用移液槍吹打沉淀使細(xì)胞裂解；
[0030] (3)將〇· 3mL的溶液B和0· 2mL氯仿加入離心管，劇烈震蕩30秒，13000g離心5 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；
[0031] (4)加入0· 5mL的溶液C和0· 2mL的氯仿到上清液中，劇烈搖晃30秒，13000g室 溫離心3分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；
[0032] (5)在上清液中加入體積為其1/2的溶液D，劇烈搖晃30秒，13000g離心5分鐘， 移棄上清液；
[0033] (6)在離心管中加入ImL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒，離心 13000g 1分鐘，吸棄上清液；
[0034] (7)室溫放置2分鐘，加入10-30 μ L無(wú) RNase水使RNA沉淀溶解，即為總RNA。
[0035] 1.3引物設(shè)計(jì)及篩選
[0036] 根據(jù) BCR-ABL 融合基因 mRNA 序列，利用 Primer Explorer V4 軟件（https:// primerexplorer. jp)設(shè)計(jì)多組引物，每引物組包括4條，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間及特異性對(duì)不同引 物的反應(yīng)進(jìn)程和結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測(cè)、篩選，確定反應(yīng)快、特異性高的最佳引物。篩選到的引物序 列見表1。
[0037] 表1篩選到的BCR-ABL融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的最佳引物名稱與 序列
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法的引物，其特征在于，包括：引物P1，其核苷酸 序列如SEQ ID N0:1所示；引物P2,其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；引物P3,其核苷酸 序列如SEQ ID NO :3所示；引物P4,其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
2. -種BCR-ABL融合基因快速檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于，內(nèi)含LAMP反應(yīng)液、 陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，所述LAMP反應(yīng)液的成分為：0. 04 ii mol/ ii L的pH 8. 8的Tris-HCl， 0? 02iimol/ii L 的 KC1，0. 016iimol/ii L 的 MgS04,0 . 02iimol/ii L 的（HN4)2S04,0 . 00 2ii 1/ ii L 的 Tween2(l，1. 6 y mol/ y L 的甜菜喊，0? 0028 y mol/ y L 的 X 4 種 dNTPs，10U/ y L 的逆轉(zhuǎn) 錄酶，8"1^的88七0嫩聚合酶，0.0000511111〇1/1^的鈣黃綠素，1.6?111〇1/1^的引物？1， 1. 6pmol/ii L 的引物 P2,0. 2pmol/ii L 的引物 P3,0. 2pmol/ii L 的引物 P4 ; 所述陽(yáng)性對(duì)照為：反應(yīng)時(shí)在反應(yīng)液中加入BCR-ABL基因表達(dá)陽(yáng)性的K562細(xì)胞基因組 RNA ;陰性對(duì)照為：反應(yīng)時(shí)在反應(yīng)液中加入超純水。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，LAMP反應(yīng)液為lml、陽(yáng)性對(duì)照50 ii L、陰性 對(duì)照l(shuí)ml。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，上述試劑盒還包括：反應(yīng)管50個(gè)， 1-10 iiL移液器頭100個(gè)。
5. 如權(quán)利要求2-4任一所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，取20 y L反應(yīng)液置于反 應(yīng)管中，將5 ii L待檢RNA加入反應(yīng)液內(nèi)，用移液器吹打混勻，蓋好反應(yīng)管的蓋子，將反應(yīng)管 置于水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：60_65°C水浴恒溫反應(yīng)40-45min,觀察顏色變化。
6. 如權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于，初次使用本試劑盒時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和 陽(yáng)性對(duì)照。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328213SQ201410682584
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】楊煒華, 汪運(yùn)山 申請(qǐng)人:濟(jì)南市中心醫(yī)院