專利名稱：一種通過(guò)bmp15基因高效快速檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及策勒黑羊BMP15基因編碼序列上的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(簡(jiǎn)稱SNP) 位點(diǎn)，可作為綿羊高繁殖性狀的一個(gè)分子標(biāo)記，建立了判定該SNP位點(diǎn)基因型的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
綿羊?qū)賳翁ゲ溉轭悇?dòng)物，但某些綿羊品種卻具有穩(wěn)定的多胎性能。研究認(rèn)為， BMPR-IB基因，⑶F9基因和BMP15基因?qū)刂凭d羊多胎性能有重要價(jià)值，尤其發(fā)現(xiàn)在以上 三個(gè)基因序列中的堿基改變，可以顯著影響綿羊的繁殖性狀。！^ecB基因是在綿羊上發(fā)現(xiàn)的 第一個(gè)多胎主效基因，該基因是BMPR-IB基因上的一個(gè)堿基發(fā)生突變產(chǎn)生，同樣在⑶F9和 BMP15上也發(fā)現(xiàn)能夠影響綿羊產(chǎn)羔性能的基因。在我國(guó)的多胎綿羊中，均發(fā)現(xiàn)了 !^ecB基因存在并顯著影響產(chǎn)羔數(shù)，該基因已經(jīng)作 為分子標(biāo)記在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用；但其他多胎主效基因研究還沒(méi)有明確的結(jié)論。本發(fā)明 研究綿羊多胎主效基因，有助于了解哺乳動(dòng)物繁殖性狀的作用機(jī)制，同時(shí)可以把多胎主效 基因作為分子標(biāo)記，迅速提高綿羊的繁殖性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的通過(guò)BMP15基因高效快速檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方 法，對(duì)甄別綿羊的繁殖率具有著重要的科學(xué)價(jià)值，并已得到實(shí)踐的驗(yàn)證。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種通過(guò)BMP15基因高效快速檢測(cè)綿羊高繁殖 性狀的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)SNP位點(diǎn)，其位 點(diǎn)位于Genebank序列(序列號(hào)為NM_001114767. 1)從BMP15基因序列的起始密碼子 ATG開(kāi)始+755位點(diǎn)，發(fā)生了 T —C突變(簡(jiǎn)稱T755C) ；2)人工合成一對(duì)核苷酸序列作為 檢測(cè)T755C位點(diǎn)的引物，其正向引物5' -gaagaccaaacctctccctaagg-3 ‘；反向引物 5' -tactttcaggcccatcatgctcc-3‘；上下游引物長(zhǎng)度均為23bp，將其結(jié)合到綿羊BMP15基 因相應(yīng)的模板鏈上，并擴(kuò)增到含有E+755位點(diǎn)的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴(kuò)增PCR， 將產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用溴化乙錠染色，以凝膠成像確定已擴(kuò)增的目的條帶； 4)利用限制性內(nèi)切酶Apa I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，消化后用8%丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀 染色，以凝膠成像鑒別該綿羊個(gè)體在T755C位點(diǎn)的基因型，將其不同的基因型作為綿羊高 繁殖性狀的分子標(biāo)記，用于輔助選擇育種；上步的T755C位點(diǎn)突變后，造成BMP15蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，顯著改變了母 羊的產(chǎn)羔數(shù)；上步酶切消化產(chǎn)物大小為140bp時(shí)，表示該個(gè)體沒(méi)有高繁殖性能；酶切消化產(chǎn)物 大小為120bp和140bp兩條帶時(shí)，表示該個(gè)體具有高繁殖性能。所述檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，利用限制性內(nèi)切酶Apa I識(shí)別T755C位點(diǎn)，此序 列為C時(shí)能切開(kāi)，序列為T時(shí)不能被切開(kāi)。所述檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，獲取的BMP15基因T755C位點(diǎn)，因不同基因型個(gè)體間具有不同的繁殖性狀，其不同的基因型可以作為綿羊高繁殖性狀的分子標(biāo)記。所述檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，實(shí)驗(yàn)選用的試劑與藥劑均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明構(gòu)思及作用機(jī)理利用DNA序列分析技術(shù)對(duì)策勒黑羊BMP15基因編碼區(qū)序 列進(jìn)行了分析，在E+755位點(diǎn)(Genebank序列Access number :NM_001114767. 1起始密碼子 ATG開(kāi)始+755個(gè)堿基)首次發(fā)現(xiàn)了堿基T — C的突變(簡(jiǎn)稱T755C)；該核苷酸突變后，造 成三聯(lián)密碼子由CTG突變?yōu)镃CG，從而導(dǎo)致編碼亮氨酸的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?，引起B(yǎng)MP15 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，并顯著影響了母羊的產(chǎn)羔數(shù)。該方法由于E+755位點(diǎn)不同的基因型，可以作為判斷綿羊個(gè)體是否具有高繁殖性 狀的一個(gè)分子標(biāo)記；建立的檢測(cè)該位點(diǎn)的高效快速檢測(cè)方法，對(duì)提高畜牧業(yè)種群的繁育及 優(yōu)選有著重要的實(shí)用價(jià)值，彰顯技術(shù)進(jìn)步。


本發(fā)明對(duì)照說(shuō)明書(shū)附圖作進(jìn)一步闡述。附圖1為本方法擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的電泳圖；如圖所示泳道1為150bp Marker, 2-8為PCR產(chǎn)物，大小為140bp附圖2為本方法的內(nèi)酶切消化后的電泳圖；如圖所示泳道13 為 IOObp Marker，1，2，3，4，5，7，9，10，11，12 泳道為 140bp，6 和 8泳道為120bp和140bp
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對(duì)照實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。一、體外擴(kuò)增(1)采集羊外周血液1. 5ml，使用肝素納抗凝，經(jīng)過(guò)凍融和離心后，收集沉淀的白 細(xì)胞，用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA ；(2)采用位于 Genebank 序列(Access number :NM_001114767. 1)從 ATG 開(kāi)始第 +729bp到+751bp作為上游引物，并在引物1的第22個(gè)堿基由A改為G，增加了內(nèi)切酶Apa I的一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，從ATG開(kāi)始第+846bp到+848bp作為下游引物，以上引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 可以得到長(zhǎng)度為140bp的特異性核酸序列；(3) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, 25mM MgCl 1. 5uL, lOmmol/L dNTP 混合物 2 μ L，10 μ mol/L 上游引物 1 μ L，10 μ mo 1/L 下游引物 1 μ L，Taq 酶 1. 25U, 50ng/ μ L 綿羊基因組 DNA 1 μ L, DMSOl μ L, ddH20 補(bǔ)足 20 μ L ；G) PCR 反應(yīng)循環(huán)程序95°C 5min 1 個(gè)循環(huán)；95°C 30s，58°C退火 90s，72°C 90s 共 ；35個(gè)循環(huán)；72°C 5min 1個(gè)循環(huán)；(5)通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR產(chǎn)物擴(kuò)增出目的條帶的質(zhì)量(見(jiàn)附圖 1)。二、擴(kuò)增片段的限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)分析(1)用內(nèi)切酶Apa I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化反應(yīng)。反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物4 μ L， IOXbuffer 1 μ L，內(nèi)切酶5U，用雙蒸水補(bǔ)足至10yL，37°C水浴10h。(2)檢測(cè)酶切產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺處置上凝膠電泳，硝酸銀染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(見(jiàn)附圖2)。三、BMP15基因E+755位基因型的判斷標(biāo)準(zhǔn)(1)BMP15基因E+755位的堿基為T，則酶切消化產(chǎn)物大小為140bp ；(2)堿基為C，則酶切消化產(chǎn)物大小為120bp ；(3)堿基是雜合子，則酶切產(chǎn)物有140bp和120bp兩條帶；通過(guò)觀測(cè)聚丙烯酰胺凝膠電泳后的染色結(jié)果，判定酶切消化產(chǎn)物的帶型，可以確 定該綿羊個(gè)體中BMP15基因+755位置的基因型。四、酶切消化產(chǎn)物大小為140bp時(shí)，該個(gè)體沒(méi)有高繁殖性能，酶切消化產(chǎn)物大小為 120bp和140bp兩條帶時(shí)，該個(gè)體具有高繁殖性能。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)BMP15基因高效快速檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，其特征在于包括1)在 策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)SNP位點(diǎn)，其位點(diǎn)位于Genebank序列(序列 號(hào)為NM_001114767. 1)從BMP15基因序列的起始密碼子ATG開(kāi)始+755位點(diǎn)，發(fā)生了 T — C 突變(簡(jiǎn)稱T755C) ；2)人工合成一對(duì)核苷酸序列作為檢測(cè)T755C位點(diǎn)的引物，其正向引物 5‘ -gaagaccaaacctctccctaagg-3‘；反向弓丨物5‘ _tactttcaggcccatcatgctcc_3‘；上下 游引物長(zhǎng)度均為23bp，將其結(jié)合到綿羊BMP15基因相應(yīng)的模板鏈上，并擴(kuò)增到含有E+755位 點(diǎn)的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴(kuò)增PCR，將產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用溴化 乙錠染色，以凝膠成像確定已擴(kuò)增的目的條帶；4)利用限制性內(nèi)切酶ApaI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行 消化，消化后用8%丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，以凝膠成像鑒別該綿羊個(gè)體在T755C 位點(diǎn)的基因型，將其不同的基因型作為綿羊高繁殖性狀的分子標(biāo)記，用于輔助選擇育種；上步的T755C位點(diǎn)突變后，造成BMP15蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，顯著改變了母羊的 產(chǎn)羔數(shù)；上步酶切消化產(chǎn)物大小為140bp時(shí)，表示該個(gè)體沒(méi)有高繁殖性能；酶切消化產(chǎn)物大小 為120bp和140bp兩條帶時(shí)，表示該個(gè)體具有高繁殖性能。
2.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，其特征在于利用限制性內(nèi)切酶 Apa I識(shí)別T755C位點(diǎn)，此序列為C時(shí)能切開(kāi)，序列為T時(shí)不能被切開(kāi)。
3.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，其特征在于獲取的BMP15基因 T755C位點(diǎn)，因不同基因型個(gè)體間具有不同的繁殖性狀，其不同的基因型可以作為綿羊高繁 殖性狀的分子標(biāo)記。
4.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)選用的試劑與 藥劑均為市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種通過(guò)BMP15基因高效快速檢測(cè)綿羊高繁殖性狀的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)SNP位點(diǎn)，位點(diǎn)位于Genebank序列，從BMP15基因序列的起始密碼子ATG開(kāi)始+755位點(diǎn)，發(fā)生T-C突變(簡(jiǎn)稱T755C)；2)合成一對(duì)核苷酸序列作為檢測(cè)T755C位點(diǎn)的引物，其正向引物5′-gaagaccaaacctctccctaagg-3′；反向引物5′-tactttcaggcccatcatgctcc-3′；上下游引物長(zhǎng)度均為23bp，將其結(jié)合到綿羊BMP15基因相應(yīng)的模板鏈上，并擴(kuò)增到含有E+755位點(diǎn)的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴(kuò)增PCR，將產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用溴化乙錠染色，以凝膠成像確定已擴(kuò)增的目的條帶；4)利用限制性內(nèi)切酶ApaI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，酶切消化產(chǎn)物為120bp和140bp兩條帶時(shí)，表示個(gè)體具有高繁殖性能。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102051411SQ201010517378
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者馮利君, 史洪才, 楊丹, 梁慶玲, 牛志剛, 白杰 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)—澳大利亞綿羊育種研究中心