專利名稱：粗毛韌革菌發(fā)酵液和倍半萜及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說本發(fā)明涉及通過粗毛韌革菌培養(yǎng)生產(chǎn)含倍半萜的粗毛韌革菌培養(yǎng)液的方法，由該方法獲得的粗毛韌革菌培養(yǎng)液或倍半萜粗品，以及含有該發(fā)酵液或倍半萜粗品的藥物組合物和/或保健品具有預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物，特別是其具有降血糖功效，因此所述的粗毛韌革菌培養(yǎng)液或倍半萜粗品可以用于制備降低血糖的保健品和/或藥物，使其為降低血糖提供理想藥物。
背景技術(shù)：
糖尿病是目前中老年人的常見病和多發(fā)病，由糖尿病引起的并發(fā)癥嚴(yán)重危及人類的生命健康。現(xiàn)有西藥類降糖藥物難免有副作用，而天然中藥類降糖藥物大多數(shù)降糖不明顯，同時(shí)受物種資源的限制。而以藥用真菌液體培養(yǎng)生產(chǎn)降糖藥物則沒有上述缺點(diǎn)。粗毛韌革菌，是金耳的共生菌，與金耳菌種共同形成金耳子實(shí)體，并生長與海拔1900-3300米的櫟樹和樺樹樹干上。民間對金耳的認(rèn)識和藥用有著非常悠久的歷史，早在明朝時(shí)期，著名的藥物學(xué)家李時(shí)珍在他的《本草綱目》中詳細(xì)記載了金耳。如“其金色者(當(dāng)指金耳)治癖飲積聚，服痛金蒼”。另外，《中國藥用真菌》、《中國中藥大典宗旨》、《云南食用菌》對金耳的藥用價(jià)值均有詳細(xì)介紹。金耳性溫寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，調(diào)氣，平陰陽；臨床上治神經(jīng)衰弱，肺熱，哮喘，慢性支氣管炎，高血壓，肝炎等疾病。近代科學(xué)研究證明金耳子實(shí)體用水煮成粘稠狀后加白糖，制成的制劑可以治療“肺熱”、感冒、咳嗽、哮喘和高血壓。近年來對金耳的研究表明其能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)。Kiho等發(fā)現(xiàn)腹腔注射金耳子實(shí)體水溶性多糖和醇溶多糖對正常小鼠，鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠以及基因缺陷型糖尿病小鼠均具降血糖作用。毛述永等發(fā)現(xiàn)口服云南金耳子實(shí)體水溶性多糖對四氧嘧啶糖尿病模型大鼠具有顯著降血糖作用。目前由于對金耳野生資源的過度利用已經(jīng)對該資源形成了很大的威脅。而傳統(tǒng)人工栽培方式周期長，需要數(shù)月才能形成一代子實(shí)體。長期的栽培過程造成了子實(shí)體成分特別是那些生物活性物質(zhì)不穩(wěn)定，使得從子實(shí)體中提取活性成分缺少商業(yè)可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種以粗毛韌革菌為原料進(jìn)行液體深層培養(yǎng)的方法，以及由該發(fā)酵方法制備的粗毛韌革菌深層培養(yǎng)液，或稱粗毛韌革菌培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中含有倍半萜類化合物。本發(fā)明所使用的粗毛韌革菌菌種為市售的任意一種粗毛韌革菌菌種,也可選用自行從野生金耳中分離得到的菌種。該菌屬于真菌門，傘菌綱，非褶菌目(也叫多孔菌目)，革菌科，學(xué)名Stereum hirsutum (Wi I Id) Pers。不形成或很難形成子實(shí)體,菌絲體遇氫氧化鉀溶液變暗或變黑。生殖菌絲疏松地交織在一起，分枝，有鎖狀聯(lián)合，近無色。本發(fā)明含有倍半萜的粗毛韌革菌深層培養(yǎng)液的培養(yǎng)工藝包括以粗毛韌革菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、一 級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有倍半萜的粗毛韌革菌深層發(fā)酵液。具體的，在本發(fā)明所述的搖瓶培養(yǎng)工藝中，其搖瓶培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40,玉米粉5 25,蛋白胨I 20, KH2PO4I 6, MgSO4I 4,加水至適當(dāng)體積，起始PH值為5.0 8.0，其中所述的搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:裝液量為60 150mL/250mL，培養(yǎng)溫度22 30°C，轉(zhuǎn)速120 160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24 48小時(shí)；在本 發(fā)明所述種子罐培養(yǎng)工藝中，所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40,玉米粉5 25,蛋白胨I 10,KH2PO4I 6,MgSO4I 4,大豆油0.1
0.8，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;其中所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:接種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.3 lv/v/m,培養(yǎng)時(shí)間80 90小時(shí)；在本發(fā)明所述的發(fā)酵工藝中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20 80，玉米粉10 40，麩皮5 30，蛋白胨3 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，CaCO3O 10，大豆油0.2 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;其中所述發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:接種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.3 lv/v/m，培養(yǎng)時(shí)間120 180小時(shí)。按照該發(fā)酵工藝，其中在進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)之前，首先將粗毛韌革菌的斜面菌種接入新配制的土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 248小時(shí)；其中所述的土豆培養(yǎng)基的組成和所用可參見諸葛健和王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:P367。由本發(fā)明的方法獲得的粗毛韌革菌發(fā)酵液為淡黃色到棕色的、有一定粘度的粘稠液體，其中含有菌絲體殘?jiān)纬傻某恋?，該發(fā)酵液中倍半萜類化合物的含量可達(dá)0.4
4.0mg/mLo本發(fā)明的另一目的是提供了一種以粗毛韌革菌為原料通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)倍半萜的方法，用樹脂吸附本發(fā)明所描述的粗毛韌革菌的培養(yǎng)液，吸附后樹脂經(jīng)過水洗、解析、濃縮和凍干等提取步驟，得到倍半萜粗品。具體的，本發(fā)明制備倍半萜的方法包括以下步驟:(I)將用本發(fā)明所描述的方法生產(chǎn)的含有倍半萜的粗毛韌革菌培養(yǎng)液的酸度調(diào)節(jié)至pHl.0 3.0, 3000rpm離心30分鐘獲得上清液；(2)上清液用非極性大孔樹脂吸附，每分鐘流量為柱體積的(0.5 2)/20，所述大孔樹脂的用量為發(fā)酵液體積的1/40 ;(3)吸附結(jié)束后柱用大量水沖洗至無色后，用20 60%乙醇溶液洗脫；洗脫機(jī)體積大約是20-40個(gè)床體積；(4)洗脫液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后得到倍半萜粗品。本發(fā)明所得到的粗毛韌革菌發(fā)酵液中倍半萜類化合物的含量可達(dá)0.3 2mg/mL ；應(yīng)用本發(fā)明上述制備倍半萜的方法，倍半萜的總收率可達(dá)0.5 2克/升發(fā)酵液。所得到的倍半萜粗品中倍半萜類化合物的含量可達(dá)18-34%。本發(fā)明粗毛韌革菌深層發(fā)酵生產(chǎn)倍半萜的方法中，如果需要進(jìn)一步分離提純其中所含有的倍半萜化合物，可按照常規(guī)方法，例如重結(jié)晶、制備液相色譜等對上述倍半萜粗品進(jìn)行分離提純。
本發(fā)明的又一目的是提供了所述發(fā)酵液和倍半萜產(chǎn)品在藥物和保健品制備中的應(yīng)用。其中所述的藥品和保健品具有降低血糖的功能?？捎糜谥苽漕A(yù)防和/或治療糖尿病的藥物和/或保健品。本發(fā)明的藥物組合物可按照醫(yī)藥領(lǐng)域的常規(guī)方法，使用常規(guī)的藥用載體制成適于應(yīng)用的常規(guī)劑型，例如可以是液體或固體的劑型，優(yōu)選適于口服的劑型，例如片劑、膠囊、含片、口服液等。本發(fā)明的方法所制備的發(fā)酵液或倍半萜的降血降脂功能，可通過下面的藥劑實(shí)驗(yàn)證明:選取空腹小鼠，以無菌的PH4.6檸檬酸緩沖液配制的4%的四氧嘧啶(alloxan)注射液，按體重160mg/kg劑量一次性腹腔注射造型，120小時(shí)后,選擇血糖值大于13mmol/L的小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，組間差異小于0.5mmol/L,設(shè)陽性對照組(I，生理鹽水)、陽性藥物組(二甲雙胍，劑量120mg/kg體重)；粗毛韌革菌倍半萜粗品治療低、中、高三種劑量組(分別為111、1￥、￥組，劑量分別以40、80、16011^/1^體重，均采用灌胃給藥。上述試驗(yàn)給藥15d后，粗毛韌革菌倍半萜組與對照組相比，治療組血糖與果糖胺指標(biāo)均極顯著降低(pH < 0.01)，可見粗毛韌革菌倍半萜15d即能顯著降低高血糖小鼠血糖。因此證實(shí)了粗毛韌革菌發(fā)酵液和倍半萜具有制備具有降血糖功能的保健品和/或藥品的用途。應(yīng)用本發(fā)明的粗毛韌革菌培養(yǎng)方法，可以大規(guī)?；蚬I(yè)化生產(chǎn)粗毛韌革菌培養(yǎng)液，以及生產(chǎn)倍半萜類化合物和含有該混合物的藥物組合物。由于該藥物組合物中所含有的粗毛韌革菌培養(yǎng)液或由該培養(yǎng)液制備的倍半萜來源于天然菌種的培養(yǎng)，因此沒有任何毒副作用，從而為糖尿病患者提供了理想的藥物，并為粗毛韌革菌的應(yīng)用開創(chuàng)了廣闊的前景。
具體實(shí)施例方式
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的材料及工藝，給出了下述的實(shí)施例。但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:粗毛韌革菌發(fā)酵液和倍半萜粗品的制備1、用新配置的土豆培養(yǎng)基斜面(葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:P367)轉(zhuǎn)接粗毛韌革菌菌種，培養(yǎng)溫度27°C，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有60mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶(共84瓶)，于22°C、90轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)24小時(shí)。其中所述搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨I，KH2P041，MgSO4I,起始PH值為5.0。2、將上述培養(yǎng)的菌種5000mL接入裝有45L種子培養(yǎng)基的75L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體為50L ;維持罐溫22°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度90轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.3v/v/m，發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。其中種子罐中的種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨I,KH2PO4I, MgSO4I,大豆油0.5，起始pH值為5.0。3、將50L種子罐菌種接入裝有600L發(fā)酵液培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的總體為650L ;維持罐溫22°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度90轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3v/v/m，發(fā)酵時(shí)間150小時(shí)，其中發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉10，麩皮5，蛋白胨3，KH2PO4I, MgSO4I, CaCO3O,大豆油0.5，起始pH值為5.0。經(jīng)上述步驟后得到粗毛韌革菌發(fā)酵液，該發(fā)酵液為桔黃色，具有香味，倍半萜含量
0.4mg/mL(測定方法見實(shí)施例4)。
4、將得到的發(fā)酵液的酸度調(diào)節(jié)至pH3.0，經(jīng)3000rpm離心30分鐘后，上清液用非極性大孔樹脂AB-8吸附，每分鐘的流量為1/20柱體積，吸附結(jié)束后樹脂柱用大量水沖洗至無色后，用20%乙醇溶液洗脫，洗脫后經(jīng)真空濃縮，濃縮液冷凍干燥得到倍半萜粗品，倍半萜粗品總收率為0.3克/升發(fā)酵液。該粗品為淡黃色粉末，溶于40%甲醇和乙醇的水溶液、熱水、吡啶、堿性溶液，熱水溶解后振蕩產(chǎn)生較為持久的泡沫。實(shí)驗(yàn)例2:粗毛韌革菌發(fā)酵液和倍半萜粗品的制備1、用新配置的土豆培養(yǎng)基斜面(葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:P367)轉(zhuǎn)接粗毛韌革菌菌種，培養(yǎng)溫度25°C，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有90mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶(共40瓶)，25°C、120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)36小時(shí)。2、將上述培養(yǎng)的菌種4000mL接入裝有50L種子培養(yǎng)基的100L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體為54L ;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度120轉(zhuǎn)每分鐘，通風(fēng)量1: 0.5v/v/m，培養(yǎng)時(shí)間90小時(shí)。3、將30L種子罐菌種接入裝有300L發(fā)酵液培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中，發(fā)酵液的總體為350L ;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度120轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.8v/v/m，發(fā)酵時(shí)間120小時(shí)，得到粗毛韌革菌培養(yǎng)液。上述步驟使用的各種培養(yǎng)基的配方如下:搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，起始 pH 值為 6.5。種子罐培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，大豆油0.1，起始pH值為6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖50，玉米粉25，麩皮20，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，CaCO3I,大豆油 0.1，起始 pH 值為 6.5。經(jīng)上述步驟后得到粗毛韌革菌發(fā)酵液，該發(fā)酵液為桔黃色，具有香味，倍半萜含量2mg/mL (測定方法見實(shí)施例5)。4、將得到的發(fā)酵液的酸度調(diào)節(jié)至pH2.0，經(jīng)3000rpm離心30分鐘后，上清液用非極性大孔樹脂AB-8吸附，每分鐘的流量為1.5/20柱體積，吸附結(jié)束后樹脂柱用大量水沖洗至無色后，用50%乙醇溶液洗脫，洗脫后經(jīng)真空濃縮，濃縮液冷凍干燥得到倍半萜粗品，倍半萜粗品總收率為1克/升發(fā)酵液。該粗品為淡黃色粉末，溶于40%甲醇和乙醇的水溶液、熱水、吡啶、堿性溶液，熱水溶解后振蕩產(chǎn)生較為持久的泡沫。實(shí)施例3:粗毛韌革菌發(fā)酵液和倍半萜粗品的制備1、用新配置的土豆培養(yǎng)基斜面(葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:P367)轉(zhuǎn)接粗毛韌革菌菌種，培養(yǎng)溫度30°C，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有150mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶(共10瓶)，30°C、150轉(zhuǎn)每分鐘搖床培養(yǎng)46小時(shí)。2、將此液體搖瓶培養(yǎng)的菌種3000mL接入裝有50L —級種子培養(yǎng)基的30L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體為31.5L ;維持罐溫30°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度150轉(zhuǎn)每分鐘，通風(fēng)量1: lv/v/m，發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。3、將15L —級種子菌種接入裝有320L發(fā)酵液培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的總體為335L ;維持罐溫30°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度150轉(zhuǎn)每分鐘，通風(fēng)量1: Olv/v/m，發(fā)酵時(shí)間180小時(shí)，得到粗毛韌革菌發(fā)酵液。該培養(yǎng)液，倍半萜含量為4.0mg/mL0上述步驟使用的各種培養(yǎng)基的配方如下:搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046，MgS044，起始 pH 值為 8.0。種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046，MgS044,大豆油0.8，起始pH值為8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖80，玉米粉40，麩皮30，蛋白胨10，KH2P046, MgS044, CaCO3IO,大豆油 0.8，起始 pH 值為 8.0。4、將上述發(fā)酵液的酸度調(diào)節(jié)至pHL 0，經(jīng)3000rpm離心30分鐘后，上清液用非極性大孔樹脂AB-8吸附，每分鐘的流量為2/20柱體積，吸附結(jié)束后樹脂柱用大量水沖洗至無色后，用60 %乙醇溶液洗脫，洗脫后經(jīng)真空濃縮，濃縮液冷凍干燥得到倍半萜粗品，其中所含成分及含量類似于實(shí)施例3的倍半萜粗品。最終獲得的倍半萜組合物的總收率為2克/升(測定方法見實(shí)施例4)。該粗品為黃色粉末，溶于40%甲醇和乙醇的水溶液、熱水、吡啶、堿性溶液，熱水溶解后振蕩產(chǎn)生較為持久的泡沫。 實(shí)施例4:倍半萜粗品的測定將實(shí)施例1、2和3得到的倍半萜粗品溶于分別無水乙醇溶液:配制100 μ g/mL香草醛溶液 IOOmL,分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 和 ImL 置于試管中，補(bǔ)充無水乙醇至ImL,分別加入0.2mL堿性輕胺溶液混合,反應(yīng)5min后,各加入3mol/L HCl溶液0.2mL,6% FeCl3溶液0.lmL，搖勻，用70%乙醇定容至7.0mL，搖勻后，用Icm比色皿以未加堿性羥胺的樣品溶液為參比溶液，于514nm波長處測定吸光度值。根據(jù)吸光光度值和香草醛濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出香草醛濃度與吸光光度值關(guān)系公式。量取IOmL發(fā)酵液蒸發(fā)干燥后用IOmL酒精溶 解，或者稱取IOmg的粗毛韌革菌培養(yǎng)液的粗提物溶解于IOmL酒精，過濾，吸取ImL濾液兩份，一份加入0.2mL堿性羥胺溶液混合；另一份以水代替羥胺溶液作為空白。反應(yīng)5min后，各加入3mol/L HCl溶液0.2mL，6% FeCl3溶液0.lmL，搖勻，用70%乙醇定容至7.0mL，搖勻后，用Icm比色皿以未加堿性羥胺的樣品溶液為參比溶液，于514nm波長處測定吸光度值。根據(jù)上述求出的香草醛濃度與吸光光度值關(guān)系公式，計(jì)算培養(yǎng)液中倍半萜的含量(以香草醛計(jì))，其中倍半萜主要活性成分見表1:表1:粗毛韌革菌發(fā)酵液中倍半萜主要成分的分子量及氣質(zhì)聯(lián)用分析保留時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種粗毛韌革菌發(fā)酵液，其特征在于，其制備方法包括以下步驟:以粗毛韌革菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有倍半萜的粗毛韌革菌發(fā)酵液； 所述的搖瓶培養(yǎng)中，其搖瓶培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40，玉米粉5 25，蛋白胨I 20，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，起始pH值為5.0 8.0，培養(yǎng)條件是:裝液量為60 150mL/250mL，培養(yǎng)溫度22 30°C，轉(zhuǎn)速120 160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24 48小時(shí)； 所述一級種子培養(yǎng)中，所述一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40，玉米粉5 25，蛋白胨I 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，大豆油0.1 0.8，起始pH值為5.0 8.0 ;培養(yǎng)條件是:接種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3 lv/v/m，培養(yǎng)時(shí)間80 90小時(shí)； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20 80，玉米粉10 40，麩皮5 30，蛋白胨3 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，CaCO3O 10，大豆油0.2 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;培養(yǎng)條件是:接種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3 lv/v/m，培養(yǎng)時(shí)間120 180小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗毛韌革菌發(fā)酵液，其特征在于，在進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)之前，首先將粗毛韌革菌的斜面菌種接入新配制的土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 248小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的粗毛韌革菌發(fā)酵液生產(chǎn)倍半萜的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將所述的粗毛韌革菌發(fā)酵液的酸度調(diào)節(jié)至PH1.0 3.0，3000rpm離心30分鐘獲得上清液； (2)上清液用非極性大孔樹脂吸附，每分鐘流量為柱體積的(0.5 2)/20，所述大孔樹脂的用量為發(fā)酵液體積的1/40 ; (3)吸附結(jié)束后柱用大量水沖洗至無色后，用20 60%乙醇溶液洗脫；洗脫機(jī)體積大約是20-40個(gè)床體積； (4)洗脫液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后得到倍半萜粗品。
4.權(quán)利要求1或2所述發(fā)酵液在制備藥物和保健品中的應(yīng)用，所述的藥物和保健品具有降低血糖的功能。
5.權(quán)利要求3所述的倍半萜在制備藥物和保健品中的應(yīng)用，所述的藥物和保健品具有降低血糖的功能。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過粗毛韌革菌液體發(fā)酵生產(chǎn)的粗毛韌革菌發(fā)酵液和倍半萜及其應(yīng)用，具體的說本發(fā)明涉及通過粗毛韌革菌液體培養(yǎng)獲取倍半萜生產(chǎn)工藝流程，以及該倍半萜的降血糖功效。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的培養(yǎng)液含有倍半萜，經(jīng)口服途徑給予高血糖小鼠可顯著降低其血糖和果糖胺，因此證實(shí)含有倍半萜的粗毛韌革菌培養(yǎng)液具有制備降低血糖保健飲品及藥物的用途。本發(fā)明的培養(yǎng)液為桔黃色至黃褐色液體，培養(yǎng)液中倍半萜含量為0.4～4.0mg/mL。本發(fā)明不僅為深度開發(fā)利用粗毛韌革菌打開了一條嶄新的途徑，而且為控制血糖提供理想的中藥。
文檔編號A23L1/29GK103141300SQ20131006020
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者張志才, 王永生 申請人:北京綠科天成生物科技有限公司