專利名稱：一種蚓激酶干粉制作工藝的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領域，尤其涉及一種蚓激酶干粉制作工藝。
背景技術(shù)：
蚓激酶是一種從蚯蚓體內(nèi)提取分離而得的一組蛋白水解酶類，其主要成分為纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原激活劑，這兩種成分通過直接降解纖維蛋白原和激活纖溶酶的雙重作用，能夠降低纖維蛋白原含量和血小板的聚集率，增強纖溶系統(tǒng)活性，糾正腦梗死后的凝血和纖溶異常，對治療心絞痛、急性腦梗、高血脂、高血壓等疾病，減輕患者病痛都具有良好的療效。蚓激酶是目前最有開發(fā)前景的纖溶藥物之一，無論靜脈注射還是口服給藥，溶栓效果都很明顯。目前，制作蚓激酶干粉首先需要提取蚓激酶，常用的提取蚓激酶的方法有鹽析，繼而采用多種層析及HPLC、FPLC、親和層析、或離子交換、分子篩、凝膠電泳等手段從不同品系的蚯蚓中獲得多種蚓激酶，但此類提取方法操作麻煩，流程長，對酶活力的損失也較大，提取的蚓激酶質(zhì)量標準低，這些特點限制了蚓激酶干粉的工業(yè)化生產(chǎn)，不能很好的滿足我國重大疾病防治和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題而提供一種有效成分含量高、質(zhì)量易控、且利于工業(yè)化生產(chǎn)的蚓激酶干粉制作工藝。本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是:
一種蚓激酶干粉制作工藝，其特征在于包括以下步驟:
1)鮮蚓處理:在地面或筐中將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然后將蚯蚓鋪成薄層，光照射10-18h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經(jīng)上述處理的蚯蚓，然后放入冷庫中貯存?zhèn)溆茫?br> 2)制漿:加入蚯蚓體積3-5倍的濃度為0.lmol/L的乙醇檸檬酸鈉緩沖液，利用膠體磨或高速組織均質(zhì)機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，制成勻漿；
3)除渣:將經(jīng)步驟2)制得的勻漿經(jīng)離心機離心去除粗渣，收集上清液；
4)鹽析:向經(jīng)步驟3)處理收集的上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使制得的飽和溶液中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為30%-40%，然后靜止放置1-1.5h，制得飽和溶液；
5)離心:利用高速離心機離心分離經(jīng)步驟4)制得的飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；
6)超濾:取經(jīng)步驟5)處理得到的澄清液，采用50000dt的超濾膜超濾，得超濾液；
7)柱層析分離:用泵將超濾液輸送到下料桶，然后混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.0-8.0,呈堿性之后，再用 弱堿性液洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高于洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；8)濃縮和二次超濾:將經(jīng)步驟7)得到的收集液倒入貯存罐內(nèi)，開啟濃縮泵，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力小于等于0.1Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/14-1/15，收集濃縮液按步驟6)進行超濾，超濾至澄清后上洗脫柱用去離子水脫鹽，最后洗脫至濃縮液pH為7.0，體積為收集液體積的1/16-1/20時止，得濃縮液；
9)過濾和除菌:用澄清型和除菌型液凈濾板過濾步驟8)制得的濃縮液2-3遍，至濾液澄清，然后用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；
10)噴干:利用干燥塔，控制干燥塔出口溫度為80-86°C，干燥經(jīng)上述步驟處理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述步驟2)的乙醇檸檬酸鈉緩沖液的pH7.0-8.0。所述步驟7)的收集液電導率大于或等于9000 μ s/ Cm。

本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點在于本發(fā)明采用多次超濾和微孔過濾，能有效去除懸浮顆粒和小分子雜蛋白、核酸，雜菌等雜質(zhì)，提高蚓激酶的純度，進而獲得純度高、活性好的蚓激酶干粉；另外，整個制作過程各個環(huán)節(jié)相互緊湊，有效提高了中間介質(zhì)的純度和處理液的工作能力，且原料來源豐富、價格低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式為能進一步了解本發(fā)明內(nèi)容、特點及功效，茲例舉以下實施例詳細說明如下: 實施例1:取IOOKg鮮蚯蚓，在地面將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然后將蚯蚓鋪成薄
層，光照射10h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經(jīng)上述處理的蚯蚓，然后放入冷庫中貯存?zhèn)溆?；加入蚯蚓體積3倍的濃度為0.lmol/L, pH為
7.8的乙醇檸檬酸鈉緩沖液，利用膠體磨或高速組織均質(zhì)機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，制成勻漿；將制得的勻漿經(jīng)離心機離心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使制得的飽和溶液中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為30%，然后靜止放置
1.0h，制得飽和溶液；利用高速離心機離心分離飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；采用50000dt的超濾膜超濾澄清液，得超濾液；用泵將超濾液輸送到下料桶，然后混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.0，呈堿性之后，再用弱堿性液NH3H2O洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高于洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；將收集液倒入貯存罐內(nèi)，開啟濃縮泵，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力為0.1Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/14，收集濃縮液再進行超濾，超濾至澄清后上洗脫柱用去離子水脫鹽，最后洗脫至濃縮液PH為7.0，體積為收集液體積的1/16時止，得濃縮液；用澄清型和除菌型液凈濾板將濃縮液過濾2遍，至濾液澄清，然后用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；最后，利用干燥塔，控制干燥塔出口溫度為80°C，干燥經(jīng)上述步驟處理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述用的乙醇檸檬酸鈉緩沖液的ρΗ5.0,收集液電導率大于或等于9000 μ s/ Cm。實施例2 -M IOOKg鮮蚯蚓，在地面將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然后將蚯蚓鋪成薄層，光照射15h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經(jīng)上述處理的蚯蚓，然后放入冷庫中貯存?zhèn)溆?；加入蚯蚓體積4倍的濃度為0.1mol/L, pH為7.8的乙醇檸檬酸鈉緩沖液，利用膠體磨或高速組織均質(zhì)機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，制成勻漿；將制得的勻漿經(jīng)離心機離心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使制得的飽和溶液中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為35%，然后靜止放置1.3h，制得飽和溶液；利用高速離心機離心分離飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；采用50000dt的超濾膜超濾澄清液，得超濾液；用泵將超濾液輸送到下料桶，然后混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.5，呈堿性之后，再用弱堿性液三乙胺洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高于洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；將收集液倒入貯存罐內(nèi)，開啟濃縮泵，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為21 X 12rpm，調(diào)節(jié)壓力為
0.0SMpa,濃縮至收集液體積為原來的1/14，收集濃縮液再進行超濾，超濾至澄清后上洗脫柱用去離子水脫鹽，最后洗脫至濃縮液PH為7.0，體積為收集液體積的1/18時止，得濃縮液；用澄清型和除菌型液凈濾板將濃縮液過濾3遍，至濾液澄清，然后用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；最后，利用干燥塔，控制干燥塔出口溫度為83°C，干燥經(jīng)上述步驟處理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述用的乙醇檸檬酸鈉緩沖液的PH5.2，收集液電導率大于或等于9000 μ s/ Cm。實施例3:取IOOKg鮮蚯蚓，在地面將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然后將蚯蚓鋪成薄層，光照射18h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經(jīng)上述處理的蚯蚓，然后放入冷庫中貯存?zhèn)溆茫患尤腧球倔w積5倍的濃度為0.lmol/L,pH為7.8的乙醇檸檬酸鈉緩沖液，利用膠體磨或高速組織均質(zhì)機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，制成勻漿；將制得的勻漿經(jīng)離心機離心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使制得的飽和溶液中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為40%，然后靜止放置1.5h，制得飽和溶液；利用高速離心機離心分離飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；采用50000dt的超濾膜超濾澄清液，得 超濾液；用泵將超濾液輸送到下料桶，然后混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，pH為8.0，呈堿性之后，再用弱堿性液洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高于洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；將收集液倒入貯存罐內(nèi)，開啟濃縮泵，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力為0.09Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/15，收集濃縮液再進行超濾，超濾至澄清后上洗脫柱用去離子水脫鹽，最后洗脫至濃縮液PH為7.0，體積為收集液體積的1/20時止，得濃縮液；用澄清型和除菌型液凈濾板將濃縮液過濾3遍，至濾液澄清，然后用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；最后，利用干燥塔，控制干燥塔出口溫度為86°C，干燥經(jīng)上述步驟處理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述用的乙醇檸檬酸鈉緩沖液的ρΗ5.3，收集液電導率大于或等于9000 μ s/ Cm。以上對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施方式，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種蚓激酶干粉制作工藝，其特征在于包括以下步驟: 1)鮮蚓處理:在地面或筐中將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然后將蚯蚓鋪成薄層，光照射10-18h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經(jīng)上述處理的蚯蚓，然后放入冷庫中貯存?zhèn)溆茫? 2)制漿:加入蚯蚓體積3-5倍的濃度為0.lmol/L的乙醇檸檬酸鈉緩沖液，利用膠體磨或高速組織均質(zhì)機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，制成勻漿； 3)除渣:將經(jīng)步驟2)制得的勻漿經(jīng)離心機離心去除粗渣，收集上清液； 4)鹽析:向經(jīng)步驟3)處理收集的上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使制得的飽和溶液中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為30%-40%，然后靜止放置1-1.5h，制得飽和溶液； 5)離心:利用高速離心機離心分離經(jīng)步驟4)制得的飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液； 6)超濾:取經(jīng)步驟5)處理得到的澄清液，采用50000dt的超濾膜超濾，得超濾液； 7)柱層析分離:用泵將超濾液輸送到下料桶，然后混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.0-8.0，呈堿性之后，再用弱堿性液洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高于洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液； 8)濃縮和二次超濾:將經(jīng)步驟7)得到的收集液倒入貯存罐內(nèi)，開啟濃縮泵，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力小于等于0.1Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/14-1/15，收集濃縮液按步驟6)進行超濾，超濾至澄清后上洗脫柱用去離子水脫鹽，最后洗脫至濃縮液pH為7.0，體積為收集液 體積的1/16-1/20時止，得濃縮液； 9)過濾和除菌:用澄清型和除菌型液凈濾板過濾步驟8)制得的濃縮液2-3遍，至濾液澄清，然后用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品； 10)噴干:利用干燥塔，控制干燥塔出口溫度為80-86°C，干燥經(jīng)上述步驟處理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶干粉制作工藝，其特征在于所述步驟2)的乙醇檸檬酸鈉緩沖液的PH7.0-8.0。
3.如權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶干粉制作工藝，其特征在于所述步驟7)的收集液電導率大于或等于9000 μ s/ Cm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蚓激酶干粉制作工藝，其特征在于包括以下步驟鮮蚓處理、制漿、除渣、鹽析、離心、超濾、柱層析分離、濃縮和二次超濾、過濾和除菌，最后噴干制得的蚓激酶干粉。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點在于本發(fā)明采用多次超濾和微孔過濾，能有效去除懸浮顆粒和小分子雜蛋白、核酸，雜菌等雜質(zhì)，提高蚓激酶的純度，進而獲得純度高、活性好的蚓激酶干粉；另外，整個制作過程各個環(huán)節(jié)相互緊湊，有效提高了中間介質(zhì)的純度和處理液的工作能力，且原料來源豐富、價格低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/48GK103146668SQ201310063359
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者蔡霞 申請人:天津市嘉沃科技有限公司