專利名稱：一種納豆激酶腸溶膠囊及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及保健食品領域，具體地，本發(fā)明涉及一種納豆激酶腸溶膠囊及其制備方法。
背景技術：
納豆激酶是由枯草芽孢桿菌合成的一種溶栓酶，該酶可由微生物發(fā)酵大量制備，價格低廉；來源于納豆食品，可口服、安全副作用??；該酶具有高效的雙重溶栓活性，不僅可以直接降解纖維蛋白，而且可激活人體纖溶酶原，產(chǎn)生內(nèi)源性纖溶酶；體內(nèi)試驗顯示該酶作用持久，半衰期長。因其諸多優(yōu)勢，成為近年來溶栓類產(chǎn)品的開發(fā)熱點(詳見參考文獻 I:Peng Y, Yang X, Zhang Y.Microbial fibrinolytic enzymes:an overview ofsource，production，properties，and thrombolytic activity in viv0.Appl MicrobiolBiotechnol，2005，69:126-132)。
納豆激酶對pH環(huán)境比較敏感，在pH < 5的情況下，活性逐漸喪失，暴露在胃酸(PH1.2-3)的環(huán)境下lh，幾乎完全失活。通過聚谷氨酸微膠囊技術包裹納豆激酶，未解決胃酸失活的問題(詳見參考文獻 2:Hsieh，Cff, Lu WC, Hsieh, WC, Huang YP, Lai CH, KoWC.1mprovement of the stability of nattokinase using[gamma]-polyglutamic acidas a coating material for microencapsulation.LffT-Food Science and Technology,2009,42 =144-149)。目前市場上存在的納豆激酶產(chǎn)品以膠囊為主，通過對收集到的8種納豆激酶膠囊進行檢測，均不具備耐酸性，在模擬胃酸環(huán)境下保持2h，膠囊迅速崩解，酶活完全喪失。納豆激酶酸性失活現(xiàn)象是制約其口服效果的重要因素。有文獻報道，通過甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯聚合物包衣技術制備納豆激酶腸溶片劑，解決了納豆激酶片劑胃酸失活的問題(詳見參考文獻 3:Law D, Zhang Z.Stabilization and target delivery ofnattokinase using compression coating.Drug Dev Ind Pharm, 2007, 33:495-503)。甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物是一種新型的腸溶包衣材料，具有較好的抗酸活性，然而未見將該聚合物應用到納豆激酶產(chǎn)品包衣的報道。
因此，本發(fā)明期望運用甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物對納豆激酶膠囊進行包衣處理，制備納豆激酶腸溶膠囊，通過對納豆激酶進行抗酸保護，希望解決納豆激酶胃酸失活問題，并實現(xiàn)其在腸道環(huán)境中的控制釋放。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納豆激酶腸溶膠囊。
本發(fā)明的另一目的是提供上述納豆激酶腸溶膠囊的制備方法。
本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊，其中，所述膠囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，膠囊納豆激酶凍干粉含量為0.15-0.2g/粒，納豆激酶活性為600-800FU/粒；
其中，所述納豆激酶凍干粉經(jīng)由鷹嘴豆納豆食品制備獲得，所述鷹嘴豆納豆食品經(jīng)由枯草芽孢桿菌LSSE-22發(fā)酵所得，其中，所述枯草芽孢桿菌LSSE-22 (Bacil Iussubtilis)，其保藏編號為:CGMCC N0.4970。上述枯草芽孢桿菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏號為:CGMCC N0.4970。本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊，在不同pH的酸性環(huán)境下保持2h，酶活均沒有損失；在模擬胃酸環(huán)境中不崩解，保持良好的外觀，酶活無損失，在模擬腸道環(huán)境中緩慢釋放，8h達到完全釋放。本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，包括以下步驟:1)納豆激酶凍干粉制備:向鷹嘴豆納豆食品中添加2倍體積(v/w)的30 % -50 %的乙醇溶液，200r/min,浸提lh。5000_10000g離心10_50min,收集上清液,繼續(xù)添加無水乙醇至75%，沉淀納豆激酶，5000-10000g離心10_50min，冷凍干燥，獲得納豆激酶凍干粉；2)腸溶膠囊制備:按照0.15-0.2g/粒的規(guī)格裝填納豆激酶明膠膠囊，通過5-15%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液浸泡3-5次，400C _50°C鼓風干燥lh，制得納豆激酶腸溶膠囊。根據(jù)本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其中，所述鷹嘴豆納豆食品的制備方法，包括以下步驟:1)將枯草芽孢桿菌LSSE-22菌株接在LB液體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12h后放置于無菌管中，-70°C冷凍保藏；2)制備種子液；

3)制備鷹嘴豆發(fā)酵底物；4)發(fā)酵培養(yǎng):按照2% -5% (v/w)的接種量，將種子液加入鷹嘴豆發(fā)酵底物中混勻，31-37°C靜止培養(yǎng)36-48h，獲得鷹嘴豆納豆食品。根據(jù)本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其中，所述種子液制備方法包括以下步驟:1)將冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12h，使其活化；2)將活化的菌種轉接到LB液體種子培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)8-14h，制得種子液。根據(jù)本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其中，所述鷹嘴豆發(fā)酵底物制備方法包括以下步驟:1)精選:去除變色、霉爛、蟲蛀的豆子，除去其中雜物，并用水清洗；2)浸泡:加入5倍體積(v/w)的水,室溫浸泡12h ；3)浙水，使豆子的初始含水量為50% -70% ；4)蒸煮:將完整豆子或者經(jīng)破碎處理的豆子在115°C高溫高壓蒸煮30min，制得豆類發(fā)酵底物。本發(fā)明所提供的納豆激酶腸溶膠囊及其制備方法，具有較強的創(chuàng)新性和實用性，其優(yōu)點如下:(1)首次通過甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物對鷹嘴豆納豆食品來源納豆激酶明膠膠囊進行包衣處理，制備納豆激酶腸溶膠囊，該膠囊在不同PH的酸性環(huán)境下保持2h，酶活均沒有損失。
(2)體外釋放試驗表明，本發(fā)明所制備納豆激酶腸溶膠囊在模擬胃酸環(huán)境中不崩解，保持良好的外觀，酶活無損失，在模擬腸道環(huán)境中緩慢釋放，8h達到完全釋放。解決了納豆激酶胃酸失活問題，并實現(xiàn)其在腸道環(huán)境中的控制釋放。


圖1為納豆激酶凍干粉及納豆激酶腸溶膠囊的抗酸性能，其中對照組為納豆激酶凍干粉。
圖2為納豆激酶腸溶膠囊在模擬胃腸道環(huán)境中的釋放曲線。
枯草芽孢桿菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏號為:CGMCC N0.4970。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但所有實施例并不對本發(fā)明構成任何限制。
實施例1納豆激酶凍干粉的制備
1、鷹嘴豆納豆食品制備:
I)用冷凍保藏的枯草芽孢桿菌LSSE-22為原始菌種；其中，所述枯草芽孢桿菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，其保藏編號為:CGMCC N0.4970 ；
2)斜面菌種活化:將冷凍保藏的菌種，轉接到LB固體平板，37°C培養(yǎng)12h ；
3)種子液培養(yǎng):將LB固體平板活化的種子轉接到LB液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm培養(yǎng)8-14h ；
4)鷹嘴豆底物制備:
a、鷹嘴豆精選:去除變色、霉爛、蟲蛀的鷹嘴豆，除去其中混有的砂石、土塊等雜物，并用水清洗兩邊；
b、浸泡:加入5倍體積(v/w)水,室溫浸泡12h ；
C、浙水:浙去浸泡后的鷹嘴豆中多余的水分，初始含水量為50% -70% ；
d、蒸煮:將完整豆子或者經(jīng)破碎處理的豆子115°C高溫高壓蒸煮30min，冷卻至室溫;
5)發(fā)酵培養(yǎng):按照2% -5 % (v/w)的接種量，加入鷹嘴豆中混勻，31_37°C靜止培養(yǎng)36-48h，獲得鷹嘴豆納豆食品。
2、凍干粉制備:以鷹嘴豆納豆食品為原料，向其中添加2倍體積(v/w)的30% -50%的乙醇溶液，200r/min，浸提lh。5000_10000g離心10_50min，收集上清液，繼續(xù)添加無水乙醇至75%，沉淀納豆激酶，5000-10000g離心10_50min，冷凍干燥48h。
3、活性檢測:納豆激酶活性檢測通過纖維蛋白溶解法進行，向試管中依次加入0.4mL 纖維蛋白原溶液(0.72%, w/v), 1.4mL Tris-HCl (50mM, pH 7.8)，37°C溫浴 5min，然后加入0.1mL凝血酶溶液(20U/mL)，37°C溫浴lOmin，再加入0.1mL的稀釋酶樣品，37°C溫浴60min,加入2mL三氯乙酸(0.2M)靜止20min終止反應,4000g離心15min,取上清于275nm比色測定吸光度，I個單位的纖維蛋白降解酶活(FU)相當于每分鐘275nm處吸光度增加0.0l所需要的酶量。經(jīng)檢測，納豆激酶凍干粉中納豆激酶活性為3250.82-4000.58FU/g°實施例2納豆激酶腸溶膠囊的制備納豆激酶腸溶膠囊制備:將納豆激酶凍干粉，按照0.15g/粒的規(guī)格裝填納豆激酶明膠膠囊，通過5 %的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液進行浸泡包衣3次，40°C鼓風干燥lh。所制膠囊納豆激酶活性為600FU/粒。實施例3納豆激酶腸溶膠囊的制備納豆激酶腸溶膠囊制備:將納豆激酶凍干粉，按照0.2g/粒的規(guī)格裝填納豆激酶明膠膠囊，通過10%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液進行浸泡包衣3次，40°C鼓風干燥lh。所制膠囊納豆激酶活性為800FU/粒。實施例4納豆激酶腸溶膠囊的制備納豆激酶腸溶膠囊制備:將納豆激酶凍干粉，按照0.2g/粒的規(guī)格裝填納豆激酶明膠膠囊，通過15%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液進行浸泡包衣5次，50°C鼓風干燥lh。所制膠囊納豆激酶活性為800FU/粒。實施例5納豆激酶腸溶膠囊特性試驗1、抗酸試驗:以0.2g納豆激酶凍干粉為對照，將對照及納豆激酶腸溶膠囊分別暴露在不同的 pH 環(huán)境條件下: pH 1.2(0.lmol/L HCl，pH 2.5 (0.0lmol/L HCl)，pH
5.0 (50mmol/L乙酸緩沖液體系),pH 7.4 (50mmol/L磷酸緩沖液體系)，37°C，100r/min處理2h，然后將各緩沖液pH調(diào)至7.4，通過200r/min進行5h均質處理，檢測酶活。結果如圖1所示，納豆激酶凍干粉在PH 1.2和pH 2.5的條件下，酶活完全喪失；納豆激酶膠囊在所測的各種酸性PH條件下，酶活沒有顯著性變化，說明所制備的納豆激酶腸溶膠囊具有良好的抗酸效果，對納豆激酶起到了較好的保護作用。2、體外釋放試驗:將納豆激酶腸溶膠囊暴露在模擬胃酸條件下(pH 1.2,0.1mol/LHC1)，37°C，100r/min處理2h，然后將其轉移到模擬腸道環(huán)境中(pH 7.4，50mmol/L磷酸緩沖液體系)，37°C，100r/min處理繼續(xù)處理8h，每隔lh，取樣檢測納豆激酶酶活，結果如圖2所示，在模擬胃酸條件下，納豆激酶腸溶膠囊保持完整的外形，未釋放納豆激酶；當轉移到模擬腸道環(huán)境后，納豆激酶腸溶膠囊緩慢崩解，納豆激酶逐漸釋放，在8h，納豆激酶完全釋放。說明所制備的腸溶膠囊可保護納豆激酶免受胃酸失活，實現(xiàn)了納豆激酶在腸道環(huán)境中的控制釋放。
權利要求
1.一種納豆激酶腸溶膠囊，其特征在于，所述膠囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，膠囊納豆激酶凍干粉含量為0.15-0.2g/粒，納豆激酶活性為600-800FU/粒； 其中，所述納豆激酶凍干粉經(jīng)由鷹嘴豆納豆食品制備獲得，所述鷹嘴豆納豆食品經(jīng)由枯草芽孢桿菌LSSE-22發(fā)酵所得，其中，所述枯草芽孢桿菌LSSE-22 (Bacillus subtil is)，其保藏編號為:CGMCC N0.4970。
2.—種納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)納豆激酶凍干粉制備:向鷹嘴豆納豆食品中添加2倍體積(v/w)的30%-50%的乙醇溶液，200r/min，浸提Ih ;5000-10000g離心10_50min，收集上清液，繼續(xù)添加無水乙醇至75%，沉淀納豆激酶，5000-10000g離心10_50min，冷凍干燥，獲得納豆激酶凍干粉； 2)腸溶膠囊制備:按照0.15-0.2g/粒的規(guī)格裝填納豆激酶明膠膠囊，通過5-15%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液進行浸泡包衣3-5次，400C _50°C鼓風干燥lh，制得納豆激酶腸溶膠囊。
3.根據(jù)權利要求2所述納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其特征在于，所述鷹嘴豆納豆食品的制備方法，包括以下步驟: 1)將枯草芽孢桿菌LSSE-22菌株接在LB液體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12h后放置于無菌管中，-70°C冷凍保藏； 2)制備種子液； 3)制備鷹嘴豆發(fā)酵底物； 4)發(fā)酵培養(yǎng):按照2%-5%(v/w)的接種量，將種子液加入鷹嘴豆發(fā)酵底物中混勻，31-37°C靜止培養(yǎng)36 -48h，獲得鷹嘴豆納豆食品。
4.根據(jù)權利要求3所述的納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其特征在于，所述種子液制備方法包括以下步驟: 1)將冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12h，使其活化； 2)將活化的菌種轉接到LB液體種子培養(yǎng)基中，370C，180rpm培養(yǎng)8_14h，制得種子液。
5.根據(jù)權利要求3所述的納豆激酶腸溶膠囊的制備方法，其特征在于，所述鷹嘴豆發(fā)酵底物制備方法包括以下步驟: 1)精選:去除變色、霉爛、蟲蛀的豆子，除去其中雜物，并用水清洗； 2)浸泡:加入5倍體積(v/w)的水,室溫浸泡12h； 3)浙水，使豆子的初始含水量為50%-70% ； 4)蒸煮:將完整豆子或者經(jīng)破碎處理的豆子在115°C高溫高壓蒸煮30min，制得豆類發(fā)酵底物。
全文摘要
本發(fā)明涉及保健食品領域，具體地，本發(fā)明涉及一種納豆激酶腸溶膠囊及其制備方法。本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊，其中，所述膠囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，膠囊納豆激酶凍干粉含量為0.15-0.2g/粒，納豆激酶活性為600-800FU/粒；其中，所述納豆激酶凍干粉經(jīng)由鷹嘴豆納豆食品制備獲得，所述鷹嘴豆納豆食品經(jīng)由枯草芽孢桿菌LSSE-22發(fā)酵所得，其中，所述枯草芽孢桿菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏編號為CGMCC No.4970。本發(fā)明的納豆激酶腸溶膠囊在模擬胃酸環(huán)境中不崩解，保持良好的外觀，酶活無損失，在模擬腸道環(huán)境中緩慢釋放，8h達到完全釋放。解決了納豆激酶胃酸失活問題，并實現(xiàn)其在腸道環(huán)境中的控制釋放。
文檔編號A23L1/29GK103238829SQ20121003151
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權日2012年2月13日
發(fā)明者劉會洲, 魏雪團, 羅明芳, 謝渝春, 李昊劍, 楊良嶸 申請人:中國科學院過程工程研究所