專利名稱：制備二肽基肽酶iv抑制劑的方法及用于該制備方法的中間體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求2004年4月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)N0.60/561，986的優(yōu)先權(quán)，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。本發(fā)明涉及一種制備(CiS)-C1-〔〔1，1-二甲基乙氧基)羰基〕-氨基〕-3-羥基三環(huán)〔3.3.1.13’7〕癸烷-1-乙酸的方法，該酸可用作中間體以制備二肽基肽酶(dip印tidylpeptidase) IV的基于環(huán)丙基稠合的吡咯烷的抑制劑，該抑制劑可用來治療糖尿病和其并發(fā)癥、高糖血癥、癥候群X、高胰島素血癥、肥胖癥及動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)疾病，以及免疫調(diào)制性疾病與慢性炎性腸病。
背景技術(shù)：
二肽基肽酶IV為經(jīng)膜結(jié)合的非經(jīng)典絲氨酸氨基肽酶，其存在于多種組織之中，包括，但不限于，腸、肝、肺和腎之中。此酶也位于循環(huán)T-淋巴細(xì)胞之上，在其中稱為CD-26。二肽基肽酶IV負(fù)責(zé)內(nèi)源性肽酶GLP-1 (7-36)和胰高血糖激素的活體內(nèi)(in vivo)代謝性切斷且對(duì)其它肽類例如GHRH、NPY、GLP-2和VIP展現(xiàn)出體外蛋白水解活性。GLP-1 (7-36)為一種衍生自胰高血糖激素在小腸內(nèi)的后轉(zhuǎn)譯處理的29個(gè)氨基酸肽酶。此肽酶在活體內(nèi)具有多種作用。例如，GLP-1 (7-36)可刺激胰島素分泌及抑制胰高血糖激素分泌。此肽酶可促進(jìn)飽食及減緩胃排空。通過連續(xù)注輸從外面投予GLP-1 (7-36)業(yè)經(jīng)證明對(duì)糖尿病患者有 效用。不過，外源肽對(duì)于連續(xù)治療用途而言降解太快速。二肽基肽酶IV抑制劑業(yè)經(jīng)開發(fā)出以加強(qiáng)GLP-1 (7，36)的內(nèi)源含量。給Hamann etal.的美國專利第6，395，767號(hào)公開了二肽基肽酶IV的基于環(huán)丙基稠合的吡咯烷的抑制齊U?；瘜W(xué)合成這些抑制劑所用方法公開于美國專利第6，395，767號(hào)及文獻(xiàn)中。例如，可參閱Sagnard et al.Tet-Lett.1995 36:3148-3152 ；Tverezovsky et al.Tetrahedron 199753:14773-14792 ;及 Hanessian et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.1998 8:2123-2128。在美國專利第6，395，767號(hào)中公開的一優(yōu)選抑制劑為(1S，3S, 5S)_2_〔(2S)_2_氨基-2-(3-羥基三環(huán)〔3.3.1.13’7〕癸-1-基)-1_酮基乙基〕-2-氮雜雙環(huán)〔3.1.0〕己烷-3-甲腈((IS,3S, 5S) -2- [ (2S) -2-amino-2- (3-hydroxytricyclo [3.3.1.13,7] dec-l-yl) -1-oxoethyI] -2-azabicyclo [3.1.0]hexane-3-carbonitrile)，如式 M，所不,
權(quán)利要求
1.一種制備式2結(jié)構(gòu)的胺的方法，
2.權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)行調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH的步驟以將反應(yīng)混合物的pH維持在約7.0至約8.6。
3.權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)行調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH的步驟以將反應(yīng)混合物的pH維持在 8.0±0.2。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中以這樣的量添加甲酸銨，以提供約1.9:1至約2.5:1的范圍內(nèi)的甲酸銨:式I酸的摩爾比例。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中以這樣的量添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，以提供約500:1至約1500:1的范圍內(nèi)的NAD:式I酸的摩爾比例。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c的反應(yīng)混合物維持在約25°C至45°C的范圍內(nèi)的溫度。
7.權(quán)利要求1的方法，其中將該3-羥基-α-酮基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷_1_乙酸、甲酸銨、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫蘇糖醇及部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶的水溶液加熱到約35至約40°C的溫度且將其pH維持在約7.8至約8.2的范圍內(nèi)達(dá)約24至約48小時(shí)，以制備該胺。
8.一種制備式3結(jié)構(gòu)的經(jīng)BOC-保護(hù)的胺的方法
9.權(quán)利要求8的方法，其中該(aS) - α -氨基-3-羥基-三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷_1_乙酸的水溶液和二碳酸二叔丁酯的混合物的PH維持在約8.5至約12.5的范圍內(nèi)。
10.權(quán)利要求8的方法，其進(jìn)一步包括從該反應(yīng)混合物中離析該經(jīng)BOC-保護(hù)的胺且對(duì)該經(jīng)BOC-保護(hù)的胺進(jìn)行結(jié)晶的步驟。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶(PDH/FDH)是通過包括下述的方法制備的: a.制備能夠產(chǎn)生苯丙氨酸脫氫酶和/或甲酸脫氫酶的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)液； b.對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行微流體化以從所得的細(xì)胞中釋放出活性且形成含有TOH及/或FDH酶的微流體化的培養(yǎng)液； c.經(jīng)由使用絮凝劑處理該培養(yǎng)液以凝結(jié)細(xì)胞碎屑而澄清該培養(yǎng)液，并除去DNA和不需要的蛋白質(zhì)； d.過濾該澄清的培養(yǎng)液'及 e.濃縮該培養(yǎng)液以得到具有對(duì)于PDH為至少約400IU/毫升和對(duì)于FDH為至少約20IU/毫升的roH/FDH活性的經(jīng)純化的酶濃縮物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中在保持該培養(yǎng)液的溫度低于約40°C的同時(shí)對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行微流體化。
13.權(quán)利要求12的方法，其中保持該培養(yǎng)液的溫度在約4°C至約30°C的范圍內(nèi)。
14.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶(TOH/FDH)是通過包括下述的方法制備的: a.制備能夠產(chǎn)生苯丙氨酸脫氫酶及/或甲酸脫氫酶的大腸桿菌(Escherichiacoli)的發(fā)酵培養(yǎng)液； b.在8000至30，OOOpsi范圍內(nèi)的壓力下對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行微流體化，同時(shí)保持該培養(yǎng)液的溫度在4至30°C的范圍內(nèi)，以從所得的細(xì)胞中釋放出活性且形成含有苯丙氨酸脫氫酶及/或甲酸脫氫酶的微流體化培養(yǎng)液； c.經(jīng)由使用絮凝劑處理該培養(yǎng)液以凝結(jié)細(xì)胞碎屑并除去DNA和不需要的蛋白質(zhì)而澄清該培養(yǎng)液； d.過濾該澄清的培養(yǎng)液；及 e.濃縮該培養(yǎng)液以得到具有對(duì)于苯丙氨酸脫氫酶為至少約400IU/毫升和對(duì)于甲酸脫氫酶為至少約20IU/毫升的苯丙氨酸脫氫酶及甲酸脫氫酶活性的部分純化的酶濃縮物。
15.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng) 的方法，其中在約12,000至約20，OOOpsi范圍內(nèi)的壓力下對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行微流體化。
16.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶得自芽孢八迭球菌屬(Sporosarcina)或熱放線菌屬(Thermoactinomyces)。
17.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶得自中間型嗜熱放線菌(Thermoactinomyces intermedius)。
18.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶得自中間型嗜熱放線菌ATCC33205，其在大腸桿菌或巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)。
19.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶是在大腸桿菌中表達(dá)的中間型嗜熱放線菌ATCC33205的苯丙氨酸脫氫酶，且該甲酸脫氫酶是在大腸桿菌中表達(dá)的巴斯德畢氏酵母ATCC20864的甲酸脫氫酶。
20.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是包含質(zhì)粒pBMS2000-PPDFDH-PDH-mod 的大腸桿菌 JMl 10。
21.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的方法，其中該澄清的培養(yǎng)液是經(jīng)超濾的。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備二肽基肽酶IV抑制劑的方法及用于該制備方法的中間體，具體涉及提供一種制備二肽基肽酶IV的基于環(huán)丙基稠合的吡咯烷的抑制劑的方法，其采用具有結(jié)構(gòu)3的經(jīng)BOC-保護(hù)的胺，該經(jīng)BOC-保護(hù)的胺如下制備使用甲酸銨、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫蘇糖醇及部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶的酶濃縮物(PDH/FDH)處理結(jié)構(gòu)1的酸，使該酸進(jìn)行還原胺化反應(yīng)，且在不離析的情況下使用二碳酸二叔丁酯處理所生成的結(jié)構(gòu)2的胺，以形成經(jīng)BOC-保護(hù)的胺。
文檔編號(hào)C12P15/00GK103215320SQ20131008930
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2005年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者邁克爾.波利蒂諾, 馬修.M.卡丁, 保羅.M.斯科尼茲尼, 賈森.G.陳 申請(qǐng)人:布里斯托爾-邁爾斯.斯奎布公司