次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括采用固定于陰離子樹脂的腺苷酸脫氨酶催化腺苷酸生成次黃嘌呤核苷酸。該方法以腺苷酸為底物，原料供應(yīng)充足，而且對(duì)設(shè)備要求低，分離提取方便，能夠?qū)崿F(xiàn)次黃苷酸的半連續(xù)生產(chǎn)，底物方便易得且轉(zhuǎn)化徹底，成本較低。
【專利說(shuō)明】次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]次黃嘌呤核苷酸，又名次黃苷酸、肌苷酸或羥基嘌呤核苷酸，簡(jiǎn)稱5，-1MP,是嘌呤核苷酸體內(nèi)代謝的重要中間代謝產(chǎn)物，是腺苷酸與鳥苷酸代謝的紐帶，可實(shí)現(xiàn)腺苷酸與鳥苷酸的相互轉(zhuǎn)化，以保持體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝的平衡。次黃嘌呤核苷酸參與體內(nèi)能量代謝和核蛋白的合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，使處于低能、缺氧狀態(tài)下的組織細(xì)胞能夠繼續(xù)順利地進(jìn)行代謝，以及活化肝功能，使受損害肝細(xì)胞加快修復(fù)，并刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體，適用于白細(xì)胞和血小板減少癥、心肌損傷、肝炎及肝硬化。同時(shí)，次黃嘌呤核苷酸還是呈味核苷酸中的一種，與鳥甘酸合用可以顯著增強(qiáng)味精的鮮味效果。
[0003]目前，次黃嘌呤核苷酸主要有化學(xué)合成法、天然原料提取法、微生物發(fā)酵法、發(fā)酵-催化結(jié)合法以及酶轉(zhuǎn)化法等生產(chǎn)方法。而以上幾種生產(chǎn)方法都有一定的缺陷?；瘜W(xué)合成法由于產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多且分離困難、設(shè)備要求較高等因素而不利于工業(yè)生產(chǎn)；天然原料提取法由于受到原料來(lái)源限制而不能大規(guī)模生產(chǎn)，難以滿足社會(huì)需求；微生物發(fā)酵法及發(fā)酵-催化結(jié)合法以廉價(jià)原料實(shí)現(xiàn)次黃苷酸的生產(chǎn)，然而微生物積累的次黃苷酸的量是有限的，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中次黃苷酸的濃度偏低，給后期的分離提取造成困難；酶轉(zhuǎn)化法由于酶固有的缺陷而受到限制。這些缺陷導(dǎo)致次黃嘌呤核苷酸供應(yīng)緊缺。
[0004]專利申請(qǐng)(CN1406273A)公開了一種利用工業(yè)微生物菌株一產(chǎn)氨棒桿菌CJIP009(KCCM-10226)的突變體生產(chǎn)次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)工藝。其中燒瓶發(fā)酵與5L發(fā)酵罐中次黃苷酸的積累量可分別達(dá)到19.lg/L、70.3g/L，即便如此，從7.03%的溶液中分離提取次黃嘌呤核苷酸依然相當(dāng)困難。`
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對(duì)上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法，該方法以腺苷酸為底物，原料供應(yīng)充足，而且對(duì)設(shè)備要求低，分離提取方便，能夠?qū)崿F(xiàn)次黃苷酸的半連續(xù)生產(chǎn)，底物方便易得且轉(zhuǎn)化徹底，成本較低。
[0006]本發(fā)明提供一種黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括采用固定于陰離子樹脂的腺苷酸脫氨酶催化腺苷酸生成次黃嘌呤核苷酸。
[0007]進(jìn)一步地，所述陰離子樹脂為以苯乙烯聚合物或丙烯酸聚合物為骨架，以伯胺基、叔胺基或季胺基為功能基團(tuán)的樹脂；
[0008]優(yōu)選地，所述陰離子樹脂為以苯乙烯聚合物為骨架，以季氨基為功能基團(tuán)的樹脂；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述陰離子樹脂為以苯乙烯-二乙烯苯為骨架，以叔氨基為功能基團(tuán)的樹脂；或者以苯乙烯-二乙烯苯為骨架，以季銨基為功能基團(tuán)的樹脂。
[0009]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述陰離子樹脂為Amberlite IRA-900、Amberlite IRA-93或Amberlite IRA-400 樹脂。[0010]進(jìn)一步地，所述生產(chǎn)方法具體包括:
[0011]步驟1，對(duì)陰離子樹脂進(jìn)行預(yù)處理，并將腺苷酸脫氨酶固定于陰離子樹脂；
[0012]步驟2，將底物腺苷酸溶解至去離子水中，再加入步驟I中得到的固定化腺苷酸脫氨酶，使腺苷酸反應(yīng)生成次黃嘌呤核苷酸。
[0013]進(jìn)一步地，所述步驟I具體包括:
[0014]步驟la，將陰離子樹脂采用醇溶液浸泡、洗滌，抽濾，然后經(jīng)強(qiáng)酸溶液浸泡、洗滌、抽濾，再經(jīng)強(qiáng)堿溶液浸泡、洗滌、抽濾；然后再采用中性鹽酸鹽溶液浸泡、洗滌、抽濾，得到氯離子型陰離子樹脂；
[0015]優(yōu)選地，所述醇溶液為無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，優(yōu)選無(wú)水乙醇；
[0016]優(yōu)選地，所述強(qiáng)酸溶液為HCl或H2SO4溶液；所述強(qiáng)酸溶液的濃度優(yōu)選I-3M，更優(yōu)選IM ;所述強(qiáng)酸溶液優(yōu)選IM的HCl溶液；
[0017]優(yōu)選地，所述強(qiáng)堿溶液為NaOH或KOH溶液；所述強(qiáng)堿溶液的濃度優(yōu)選I-3M，更優(yōu)選IM ;所述強(qiáng)堿溶液優(yōu)選IM的NaOH溶液；
[0018]優(yōu)選地，所述中性鹽酸鹽溶液為NaCl或KCl溶液；所述中性鹽酸鹽溶液的濃度為
0.5-3M，優(yōu)選IM ;所述中性鹽酸鹽溶液優(yōu)選IM的NaCl溶液。
[0019]步驟lb，將得到的氯離子型陰離子樹脂及腺苷酸脫氨酶溶液置于搖床上進(jìn)行腺苷酸脫氨酶的固定化，設(shè)置溫度20-35°C，取出后洗滌，使腺苷酸脫氨酶固定于樹脂上；
`[0020]優(yōu)選地，在步驟Ib之前，將腺苷酸脫氨酶溶液置于緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH為5-8，優(yōu)選PH為5-6 ;優(yōu)選地，所述緩沖溶液為乙酸鹽緩沖溶液、碳酸氫鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液。
[0021]進(jìn)一步地，所述步驟2具體包括:
[0022]將底物腺苷酸溶解至去離子水中，調(diào)節(jié)pH為5-8，優(yōu)選pH為5-6，40-55°C預(yù)熱10-30min,優(yōu)選IOmin,再加入步驟I中得到的固定化腺苷酸脫氨酶,然后40-55°C保溫，50-120轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，使腺苷酸反?yīng)生成次黃嘌呤核苷酸；
[0023]優(yōu)選地，將底物腺苷酸溶解至去離子水中，采用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，優(yōu)選3M的HCl溶液調(diào)節(jié)pH。
[0024]進(jìn)一步地，所述底物腺苷酸的濃度為100-300g/L。
[0025]進(jìn)一步地，所述生產(chǎn)方法還包括陰離子樹脂的再生步驟。
[0026]進(jìn)一步地，所述再生包括以堿洗脫陰離子樹脂，然后再采用NaCl溶液，優(yōu)選IM的NaCl溶液進(jìn)行浸泡、洗滌、抽濾，將羥基型陰離子樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)槁入x子型陰離子樹脂。
[0027]以下為本發(fā)明技術(shù)方案的詳細(xì)描述:
[0028]本發(fā)明的基本原理如下:腺苷酸脫氨酶蛋白分子的等電點(diǎn)在5.6左右，表明在中性及微酸性環(huán)境中蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷的狀態(tài)為優(yōu)勢(shì)形式，可以與陽(yáng)離子形成離子鍵。利用此機(jī)理，本發(fā)明將選擇的陰離子樹脂來(lái)固定腺苷酸脫氨酶，以達(dá)到高效的固酶效果，從而利用固定化腺苷酸脫氨酶實(shí)現(xiàn)次黃嘌呤核苷酸的半連續(xù)生產(chǎn)。
[0029]其中，本發(fā)明采用的腺苷酸脫氨酶為已商品化的脫氨酶，該酶可由蜂蜜曲霉發(fā)酵純化制得，單位酶活為10U/ml酶液(IU=實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘內(nèi)生成Img次黃嘌呤核苷酸所需的酶量)。
[0030]本發(fā)明對(duì)選用的陰離子樹脂進(jìn)行醇-堿-酸-堿處理，即依次用醇、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿對(duì)陰離子樹脂進(jìn)行預(yù)處理，去除陰離子樹脂在制備過(guò)程中殘留的醇、強(qiáng)酸及強(qiáng)堿可溶性雜質(zhì)，最后用鹽酸鹽溶液對(duì)陰離子樹脂進(jìn)行轉(zhuǎn)型，然后將轉(zhuǎn)型后的樹脂置于PH5-6的乙酸鹽緩沖溶液、碳酸氫鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行腺苷酸脫氨酶的固定化，由于腺苷酸脫氨酶蛋白分子在中性及微酸性的溶液環(huán)境中帶負(fù)電，因此可以與陰離子樹脂表面的Cl—進(jìn)行交換，實(shí)現(xiàn)酶蛋白的固定化。
[0031]具體的固定化步驟如下:
[0032]步驟A，稱取一定質(zhì)量的陰離子樹脂于容器中，加入無(wú)水醇溶液，浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液中無(wú)醇?xì)埩?，然后抽濾，其中所述無(wú)水醇醇溶液為無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，優(yōu)選無(wú)水乙醇；
[0033]步驟B，將步驟A中得到的樹脂用I-3M優(yōu)選IM的強(qiáng)堿溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈PH中性，然后抽濾，其中所述強(qiáng)堿溶液為NaOH或KOH溶液，優(yōu)選IM的NaOH溶液；
[0034]步驟C，將步驟B中得到的樹脂用I-3M優(yōu)選IM的強(qiáng)酸溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈PH中性，然后抽濾，其中所述強(qiáng)酸溶液為HCl或H2SO4溶液，優(yōu)選IM的HCl溶液；
[0035]步驟D，將步驟C中得到的樹脂用I-3M優(yōu)選IM的強(qiáng)堿溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈PH中性，然后抽濾，其中所述強(qiáng)堿溶液為NaOH或KOH溶液，優(yōu)選IM的NaOH溶液；
[0036]步驟E，將步驟D中得到的樹脂用0.5-3M優(yōu)選IM的中性鹽酸鹽溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈PH中性，然后抽濾，得到氯離子型陰離子樹脂，其中所述鹽酸鹽溶液為NaCl或KCl溶液，優(yōu)選IM的NaCl溶液；
[0037]步驟F，將步驟E中得到的氯離子型陰離子樹脂與一定體積的腺苷酸脫氨酶溶液，置于20-35°C, 150-250rpm的搖床上固定化2h,取出后用去離子水洗漆至洗脫液中無(wú)酶活與蛋白殘留；
[0038]優(yōu)選地，在步驟F之前，將腺苷酸脫氨酶溶液置于緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH為5-8，優(yōu)選pH為5-6 ;優(yōu)選地，所述緩沖溶液為乙酸鹽緩沖溶液、碳酸氫鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液；
[0039]步驟G，將步驟F得到的固定化酶在4°C下保存，得到固定化腺苷酸脫氨酶。
[0040]根據(jù)本發(fā)明提供的固定化酶方法，所得到的固定化酶的酶活可達(dá)到10-23U/g濕樹脂。
[0041]本發(fā)明中的酶活測(cè)定的方法如下:
[0042]將步驟Ig得到的固定化酶在室溫干燥后稱取0.3g，加入到4ml經(jīng)預(yù)熱的底物緩沖液(75g/L)中，55°C保溫15min，然后加入4ml7%的高氯酸溶液終止酶反應(yīng)，液相檢測(cè)反應(yīng)液中次黃嘌呤核苷酸的含量。
[0043]其中，上述測(cè)定方法中采用的緩沖液為0.2M的乙酸緩沖溶液體系，pH為5.6。
[0044]液相檢測(cè)條件如下:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm。
[0045]進(jìn)一步地，本發(fā)明的次黃嘌呤核苷酸的具體制備過(guò)程如下:
[0046]將腺苷酸溶解至去離子水中，用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，優(yōu)選3M的HCl溶液調(diào)節(jié)pH為pH5-8優(yōu)選pH5-6，40-55°C下水浴預(yù)熱10-30min，優(yōu)選IOmin,然后加入上述得到的固定化腺苷酸脫氨酶,40-55°C水浴保溫,50-120rpm機(jī)械攪拌，定時(shí)取樣檢測(cè)反應(yīng)液中腺苷酸及次黃嘌呤核苷酸的含量，以確定轉(zhuǎn)化程度，至OD265nm不再下降或液相檢測(cè)不到次黃嘌呤核苷酸出峰信號(hào)，此時(shí)認(rèn)為腺苷酸已全部轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸，結(jié)束一個(gè)生產(chǎn)周期。
[0047]其中，上述反應(yīng)過(guò)程中需要嚴(yán)格控制pH，使pH穩(wěn)定在pH5-8優(yōu)選pH5-6范圍內(nèi)。
[0048]其中，一個(gè)生產(chǎn)周期結(jié)束后，可將本發(fā)明的固定化腺苷酸脫氨酶用去離子水淋洗，然后投入到下一個(gè)生產(chǎn)周期或者于4°C保存以備后續(xù)使用。
[0049]另外，當(dāng)本發(fā)明的固定化腺苷酸脫氨酶經(jīng)多次反應(yīng)催化性能降低時(shí)，可以堿洗脫的方式對(duì)陰離子樹脂進(jìn)行再生，然后將再生后的陰離子樹脂采用鹽酸鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)型，以重復(fù)使用。
[0050]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法至少具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0051]一、本發(fā)明以固定化酶技術(shù)為基礎(chǔ)，以陰離子交換樹脂為固定化載體對(duì)腺苷酸脫氨酶(EC3.5.4.6)進(jìn)行固定化，生產(chǎn)次黃嘌呤核苷酸，可實(shí)現(xiàn)腺苷酸到次黃嘌呤核苷酸的半連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，與化學(xué)合成方法相比，降低了對(duì)設(shè)備的要求，減少了固定資產(chǎn)的投入；
[0052]二、本發(fā)明采用核苷酸工業(yè)中的過(guò)生產(chǎn)物腺苷酸為底物，底物方便易得(約占核苷酸總量的25%)，供應(yīng)充足，可實(shí)現(xiàn)高濃度下的催化轉(zhuǎn)化，并可使底物達(dá)到99.99%以上的轉(zhuǎn)化率，便于后續(xù)的分離提純；次黃嘌呤核苷酸需求緊缺，因此以腺苷酸為底物，經(jīng)腺苷酸脫氨酶催化生成次黃嘌呤核苷酸具有重要意義；
[0053]三、本發(fā)明通過(guò)吸附作用將腺苷酸脫氨酶固定到樹脂表面，固定化方法簡(jiǎn)便易行，提高了腺苷酸脫氨酶的催化穩(wěn)定性，且固定化成本低，與游離酶催化相比，該固定化酶技術(shù)使得腺苷酸脫氨酶的最適PH變寬，更加適用于腺苷酸脫氨的催化過(guò)程；
[0054]四、本發(fā)明的腺苷酸脫氨酶通過(guò)本發(fā)明中的固定化方法可以進(jìn)行多次循環(huán)使用，有利于降低成本，且固定化過(guò)程中不使用交聯(lián)試劑，生產(chǎn)過(guò)程中雜質(zhì)少，使生產(chǎn)更加綠色，且有利于減少后期分離提取成本。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0055]以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0056]圖1顯示了采用Amberlite IRA-900樹脂固定的腺苷酸脫氨酶的催化反應(yīng)活性隨反應(yīng)批次的變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0057]以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0058]下述實(shí)施例中的試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。
[0059]實(shí)施例1
[0060]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)下述方法步驟對(duì)Amberlite IRA-900樹脂進(jìn)行預(yù)處理:
[0061]步驟la，稱取200g Amberlite IRA-900樹脂于IL三角燒瓶中，加入600ml無(wú)水乙醇，浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液中無(wú)乙醇?xì)埩簦缓蟪闉V；
[0062]步驟lb，將步驟Ia中得到的樹脂用600ml IM NaOH溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈pH中性，然后抽濾；
[0063]步驟lc，將步驟Ib中得到的樹脂用600ml IM HCl溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈PH中性，然后抽濾；
[0064]步驟ld，將步驟Ic中得到的樹脂用600ml IM NaOH溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈pH中性，然后抽濾；
[0065]步驟le，將步驟Id中得到的樹脂用600ml 0.5M NaCl溶液浸泡過(guò)夜，采用去離子水洗滌至洗脫液呈pH中性，然后抽濾，得到預(yù)處理的AmberliteIRA-900樹脂。
[0066]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-900樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入乙酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于20°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(21.98U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約1.25h后，0D265nm不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次，如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至1.40h。
[0067]圖1顯示了采用Amberlite IRA-900樹脂固定的腺苷酸脫氨酶的催化反應(yīng)活性隨反應(yīng)批次的變化曲線，從圖1看出，隨著反應(yīng)批次的增加，腺苷酸脫氨酶的催化反應(yīng)活性逐漸降低，經(jīng)30次反應(yīng)后，腺苷酸脫氨酶的`催化反應(yīng)活性降低至約89.29%。
[0068]實(shí)施例2
[0069]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相同的方法對(duì)Amberlite IRA-93樹脂進(jìn)行預(yù)處理。
[0070]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-93樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入乙酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于20°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(13.17U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L，pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約2.5h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后，批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至3.21h。
[0071]實(shí)施例3
[0072]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相同的方法對(duì)Amberlite IRA-400樹脂進(jìn)行預(yù)處理。
[0073]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-400樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入乙酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于20°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(14.37U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，60rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約3.25h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至4.51h。
[0074]實(shí)施例4
[0075]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相似的方法對(duì)Amberlite IRA-900樹脂進(jìn)行預(yù)處理，不同的是步驟Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的濃度為2M，步驟Ie中的NaCl溶液的濃度為IM0
[0076]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-900樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入碳酸氫鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于20°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(20.98U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L，pH5-6)，使腺苷酸在40°C，80rpm機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫 氨反應(yīng)，通過(guò)滴加3M鹽酸溶液控制pH為約5.6。約1.28h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至1.45h。
[0077]實(shí)施例5
[0078]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相似的方法對(duì)Amberlite IRA-93樹脂進(jìn)行預(yù)處理。不同的是步驟Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的濃度為2.5M，步驟Ie中的NaCl溶液的濃度為1.5M。
[0079]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-93樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入碳酸氫鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于20°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(13.27U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L，pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約2.5h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后，批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至3.21h。
[0080]實(shí)施例6
[0081]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相似的方法對(duì)Amberlite IRA-400樹脂進(jìn)行預(yù)處理，不同的是步驟Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的濃度為1.5M，步驟Ie中的NaCl溶液的濃度為1M。
[0082]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-400樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入硼酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于20°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(14.37U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，60rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約3.25h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至4.52h。
[0083]實(shí)施例7
[0084]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相似的方法對(duì)Amberlite IRA-900樹脂進(jìn)行預(yù)處理，不同的是步驟Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的濃度為3M，步驟Ie中的NaCl溶液的濃度為2M。
[0085]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-900樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入Tris-HCl緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6)，將三角瓶置于25°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(22.98U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，IOOrpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加5M乙酸溶液控制pH為5-6。約1.15h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化`酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至1.29h。
[0086]實(shí)施例8
[0087]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相似的方法對(duì)Amberlite IRA-93樹脂進(jìn)行預(yù)處理。不同的是步驟Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的濃度為3M，步驟Ie中的NaCl溶液的濃度為3M。
[0088]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-93樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入Tris-HCl緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6),將三角瓶置于30°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(13.56U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約2.48h后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至3.26h。
[0089]實(shí)施例9
[0090]樹脂的預(yù)處理:根據(jù)與實(shí)施例1相似的方法對(duì)Amberlite IRA-400樹脂進(jìn)行預(yù)處理，不同的是步驟Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的濃度為2M，步驟Ie中的NaCl溶液的濃度為3M。
[0091]催化反應(yīng):稱取上述預(yù)處理過(guò)的Amberlite IRA-400樹脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脫氨酶溶液(10U/ml，其中加入Tris-HCl緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6),將三角瓶置于35°C, 150rpm的搖床上固定化2h后回收固定化酶,采用去離子水對(duì)固定化酶進(jìn)行洗滌，直至洗脫液中無(wú)蛋白及酶活殘留。將得到的固定化酶(15.37U/g)加入到IOOml經(jīng)40°C預(yù)熱的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，60rpm的機(jī)械攪拌條件下進(jìn)行脫氨反應(yīng)，通過(guò)滴加IM鹽酸溶液控制pH為5-6。約3.1Oh后，0D265不再下降，液相檢測(cè)(液相條件:流動(dòng)相為0.02M磷酸二氫銨溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速為lml/min，色譜柱為C18親水柱，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm)不到次黃嘌呤核苷酸信號(hào)，腺苷酸的轉(zhuǎn)化率為99.99以上％。固定化酶濾出后采用去離子水洗滌三次，投入到下一批次。如此重復(fù)使用固定化脫氨酶，第30次使用后,批次反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至4.48h。
[0092]實(shí)施例10
[0093]與實(shí)施例4相似，所不同的是催化反應(yīng)過(guò)程中固定化時(shí)所用腺苷酸脫氨酶溶液為30ml,固定化酶單位酶活為17.86U/g。第I批次反應(yīng)時(shí)間約為1.51h，第30批次反應(yīng)時(shí)間約為1.71h。
[0094]實(shí)施例U
[0095]與實(shí)施例5相似，所不同`的是催化反應(yīng)過(guò)程中用3M乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為5-6。
[0096]實(shí)施例12
[0097]與實(shí)施例6相似，所不同的是催化反應(yīng)過(guò)程中使腺苷酸在55°C下進(jìn)行脫氨反應(yīng)。第I批次反應(yīng)時(shí)間約為2.51h，第30批次反應(yīng)時(shí)間約為3.49h。
[0098]實(shí)施例13
[0099]與實(shí)施例1相似，所不同的是催化反應(yīng)過(guò)程中在30°C下回收固定化酶，固定化酶單位酶活為23.56U/g。第I批次反應(yīng)時(shí)間約為1.17h，第30批次反應(yīng)時(shí)間約為1.31h。
[0100]實(shí)施例14
[0101]與實(shí)施例8相似，所不同的是催化過(guò)程中用6M乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為5-6。
[0102]實(shí)施例15
[0103]與實(shí)施例1相似，所不同的是步驟Ib-1d中對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理的酸堿分別為2M的H2SO4溶液與2M的NaOH溶液，步驟Ie中樹脂轉(zhuǎn)型所用的鹽酸鹽溶液為IM的KCl溶液。
[0104]實(shí)施例16
[0105]與實(shí)施例2相似，所不同的是步驟Ib-1d中對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理的酸堿分別為3M的H2SO4溶液與3M的NaOH溶液，步驟Ie中樹脂轉(zhuǎn)型所用的鹽酸鹽溶液為3M的KCl溶液。
[0106]實(shí)施例17
[0107]與實(shí)施例1相似，所不同的是催化反應(yīng)時(shí)所用腺苷酸溶液的濃度為150g/L。
[0108]實(shí)施例18
[0109]與實(shí)施例8相似，所不同的是催化反應(yīng)時(shí)所用腺苷酸溶液的濃度為250g/L。[0110]實(shí)施例19
[0111]與實(shí)施例11相似，所不同的是催化反應(yīng)時(shí)所用腺苷酸溶液的濃度為300g/L。
[0112]以上對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【權(quán)利要求】
1.一種次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括采用固定于陰離子樹脂的腺苷酸脫氨酶催化腺苷酸生成次黃嘌呤核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述陰離子樹脂為以苯乙烯聚合物或丙烯酸聚合物為骨架，以伯胺基、叔胺基或季胺基為功能基團(tuán)的樹脂； 優(yōu)選地，所述陰離子樹脂為以苯乙烯聚合物為骨架，以季氨基為功能基團(tuán)的樹脂；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述陰離子樹脂為以苯乙烯-二乙烯苯為骨架，以叔氨基為功能基團(tuán)的樹脂；或者以苯乙烯-二乙烯苯為骨架，以季銨基為功能基團(tuán)的樹脂； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述陰離子樹脂為Amberlite IRA-900、Amberlite IRA-93或Amberlite IRA-400 樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述生產(chǎn)方法具體包括: 步驟1，對(duì)陰離子樹脂進(jìn)行預(yù)處理，并將腺苷酸脫氨酶固定于陰離子樹脂； 步驟2，將底物腺苷酸溶解至去離子水中，再加入步驟I中得到的固定化腺苷酸脫氨酶，使腺苷酸反應(yīng)生成次黃嘌呤核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟I具體包括: 步驟la，將陰離子樹脂采用醇溶液浸泡、洗滌，抽濾，然后經(jīng)強(qiáng)酸溶液浸泡、洗滌、抽濾，再經(jīng)強(qiáng)堿溶液浸泡、洗滌、抽濾；然后再采用中性鹽酸鹽溶液浸泡、洗滌、抽濾，得到氯離子型陰離子樹脂； 優(yōu)選地，所述醇溶液為無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，優(yōu)選無(wú)水乙醇； 優(yōu)選地，所述強(qiáng)酸溶液為HCl或H2SO4溶液；所述強(qiáng)酸溶液的濃度優(yōu)選I-3M，更優(yōu)選IM ;所述強(qiáng)酸溶液優(yōu)選IM的 HCl溶液； 優(yōu)選地，所述強(qiáng)堿溶液為NaOH或KOH溶液；所述強(qiáng)堿溶液的濃度優(yōu)選I-3M，更優(yōu)選IM ;所述強(qiáng)堿溶液優(yōu)選IM的NaOH溶液； 優(yōu)選地，所述中性鹽酸鹽溶液為NaCl或KCl溶液；所述中性鹽酸鹽溶液的濃度為0.5-3M，優(yōu)選IM ;所述中性鹽酸鹽溶液優(yōu)選IM的NaCl溶液； 步驟lb，將得到的氯離子型陰離子樹脂及腺苷酸脫氨酶溶液置于搖床上進(jìn)行腺苷酸脫氨酶的固定化，設(shè)置溫度20-35°C，取出后洗滌，使腺苷酸脫氨酶固定于樹脂上； 優(yōu)選地，在步驟Ib之前，將腺苷酸脫氨酶溶液置于緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH為5-8，優(yōu)選PH為5-6 ;優(yōu)選地，所述緩沖溶液為乙酸鹽緩沖溶液、碳酸氫鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟2具體包括: 將底物腺苷酸溶解至去離子水中，調(diào)節(jié)PH為5-8，優(yōu)選pH為5-6，40-55°C預(yù)熱10-30min,優(yōu)選IOmin,再加入步驟I中得到的固定化腺苷酸脫氨酶，然后40-55?保溫，50-120轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，使腺苷酸反?yīng)生成次黃嘌呤核苷酸； 優(yōu)選地，將底物腺苷酸溶解至去離子水中，采用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，優(yōu)選3M的HCl溶液調(diào)節(jié)pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,所述底物腺苷酸的濃度為 100 -300g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述生產(chǎn)方法還包括陰離子樹脂的再生步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述再生包括以堿洗脫陰離子樹脂，然后再采用NaCl溶液，優(yōu)選IM的NaCl溶液進(jìn)行浸泡、洗滌、抽濾，將羥基型陰離子樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)槁入x子型陰 離子樹脂。
【文檔編號(hào)】C12P19/32GK103451255SQ201310106699
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月28日
【發(fā)明者】應(yīng)漢杰, 曹治, 陳勇, 陳曉春, 吳菁嵐, 謝婧婧 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)