專利名稱：嬰幼兒米粉中核苷酸含量檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種嬰幼兒米粉中核苷酸含量的檢測方法。
背景技術：
核苷酸包括胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸，分別簡稱為CMP、AMP、UMP、GMP和IMP，核苷酸可以維持免疫系統(tǒng)的正常功能，提高人體對各類病菌的抵抗力。核苷酸能促進小腸成熟，改善腸道吸收功能。還可以刺激雙歧桿菌生長，減少嬰兒便秘、腹瀉的發(fā)生。此外核苷酸還有極好的抗氧化作用，維持肝臟的正常功能。目前公司新推出的嬰幼兒米粉產(chǎn)品中便添加了核苷酸，對于食品中核苷酸的含量測定，國標中尚未有相應的檢測方法。因此，開發(fā)嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測方法對調配出最適于嬰幼兒成長所需的含核苷酸米粉有著重要意義。因谷基中含較多淀粉和植物蛋白，樣品溶解后呈糊狀，容易造成干擾和過濾困難，因此加入高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶進行酶解解決存在問題。為將谷基樣品中的核苷酸充分提取出來，本方法采用超聲提取，再進行離心凈化。最大限度減少損失和干擾，提高了實驗的可行性和檢測結果的準確性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供ー種嬰幼兒米粉中核苷酸含量的檢測方法。g在以方便、快捷、準確地檢測嬰幼兒米粉中核苷酸的含量。本發(fā)明，其原理是將嬰幼兒米粉中的淀粉和植物蛋白先用高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶酶解后，利用超聲波提取，高速離心凈化，經(jīng)紫外檢測器測定，外標法定量。本發(fā)明，包括如下工作步驟
(I)試劑準備，所用試劑包括
Ca)甲醇色譜純；
(b)四丁基硫酸氫銨色譜純；
(c)磷酸氫ニ鉀分析純；
(d)磷酸ニ氫鉀色譜純；
Ce)こ酸優(yōu)級純；
Cf)木瓜蛋白酶酶活カ彡600U/g，0. 2-0. 4g ；
(g)高峰氏淀粉酶酶活カ彡4000U/g,O. 2-0. 4g ；
(h)核苷酸標準品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:純度彡98% ；
(i)0.lmol/L磷酸ニ氫鉀溶液稱取13. 60g磷酸ニ氫鉀用超純水溶解并定容至IOOOmL ；
(j)0. lmol/L磷酸氫ニ鉀溶液稱取2. 28g磷酸氫ニ鉀用超純水溶解并定容至IOOmL ；
(k) 100mL/Lこ酸溶液吸取IOmLこ酸，加超純水定容至IOOmL ；(1)含I.40mmol/L四丁基硫酸氫銨的O. Olmol/L磷酸二氫鉀緩沖液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氫鉀溶液，加O. 4753g四丁基硫酸氫銨，用O. lmol/L磷酸氫二鉀溶液調pH至3. 3，用超純水定容到IOOOmL ；
Cm)核苷酸標準混合液分別準確稱取核苷酸標準品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg,混合后用超純水溶解并定容至100ml，此標準混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各為 100-20(^g/mL ；
(η)核苷酸標準工作液分別吸取標準混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5個IOOml容量瓶中，加超純水定容至IOOmL,配成核苷酸系列標準工作液；
(2)儀器設備，儀器設備包括
Ca)高效液相色譜儀島津LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測器；(b)電子天平精確至O.OOOlg ；
(c)超聲波提取器；
(d)高速離心機；
(3)樣品處理:
(a)酶解稱取樣品5g-10g，精確至Img,置于100mL_200mL三角瓶中，加入O.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h ；
(b)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲提取10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容；
(c)高速離心凈化過濾定容后樣液轉入50mL離心管于10000r/min的離心機離心5min,上清液經(jīng)中速濾紙過濾，用一次性注射器吸取濾液l_2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過濾，濾液即為最終樣液，供HPLC測定。保留時間定性，外標法定量；
(4)色譜條件，色譜條件包括
Ca)色譜柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相當者；
(b)進樣量10μ ；
(c)流速1.OmL/min ；
(d)紫外檢測器波長254nm;
(e)柱溫25°C；
(f)流動相4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，低壓濃度洗脫；
(5)定量分析
(a)標準曲線繪制將標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀，測定相應的峰面積，以峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標繪制標準曲線；
(b)試液測定將制備好的樣液注入高效液相色譜儀，測得相應的峰面積，以標準曲線對樣品進行定量，測得試液濃度；
(C)計算，計算公式為X=CXV1X 100/(mX 1000)，式中
X :試樣中核苷酸各組分的含量，單位為mg/100g ；
C :由標準曲線得到的試液濃度，單位為Pg/mL ；
V1 :試樣定容體積，單位為mL ； m:試樣質量，單位為g ；試樣中核苷酸含量ΖζΧ^Χλμρ+Χ^ρ+Χ^Χ^ρ。本方法流動相為4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，pH為3. 3。流動相比例和pH值對實驗結果影響非常大，所以必須嚴格控制，且標準曲線和流動相必須同一天配制和使用。本發(fā)明，在嬰幼兒米粉中檢測核苷酸的含量，具有方便、快捷、準確等優(yōu)點。對調配出最適于嬰幼兒成長所需的含核苷酸米粉有著重要意義。


圖I為核苷酸含量標準色譜圖；圖2為樣品核苷酸色譜圖；圖3為CMP峰面積與濃度的標準曲線圖；圖4為AMP峰面積與濃度的標準曲線圖；圖5為UMP峰面積與濃度的標準曲線圖；圖6為GMP峰面積與濃度的標準曲線圖；圖7為IMP峰面積與濃度的標準曲線圖；圖中，橫坐標為標準工作液濃度，縱坐標為標準工作液對應的峰面積。在圖I和圖2中，出峰順序以核苷酸標準物質單標進樣確定為CMP、AMP、UMP、GMP、IMP，保留時間定性，外標法定量。
具體實施例方式一種嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測方法，包括如下工作步驟
(I)試劑準備，所用試劑包括
(a)甲醇色譜純；
(b)四丁基硫酸氫銨色譜純；
(C)磷酸氫二鉀分析純；
(d)磷酸二氫鉀色譜純；
Ce)乙酸優(yōu)級純；
Cf)木瓜蛋白酶酶活力彡600U/g，0. 2g ；
(g)高峰氏淀粉酶酶活力彡4000U/g,O. 2g ；
(h)核苷酸標準品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:純度彡98% ；
(i)0.lmol/L磷酸二氫鉀溶液稱取13. 60g磷酸二氫鉀用超純水溶解并定容至IOOOmL ；
(j)0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液稱取2. 28g磷酸氫二鉀用超純水溶解并定容至IOOmL ；
(k) 100mL/L乙酸溶液吸取IOmL乙酸，加超純水定容至IOOmL ；
(I)含I. 40mmol/L四丁基硫酸氫銨的O. 01mol/L磷酸二氫鉀緩沖液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氫鉀溶液，加0. 4753g四丁基硫酸氫銨，用0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液調pH至3. 3，用超純水定容到IOOOmL ；
Cm)核苷酸標準混合液分別準確稱取核苷酸標準品CMPlOmg、AMP20mg、UMPIOmg,GMPlOmg和MPlOmg，混合后用超純水溶解并定容至100ml，此標準混合液中，CMP含量為lOOPg/mL，AMP 含量為 20(^g/mL，UMP 含量為 lOOPg/mL，GMP 含量為 lOOPg/mL，IMP 含量為lOOM-g/mL ；
(η)核苷酸標準工作液分別吸取標準混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5個IOOml容量瓶中，加超純水定容至IOOmL,配成核苷酸系列標準工作液；(2)儀器設備，儀器設備包括
Ca)高效液相色譜儀島津LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測器；
(b)電子天平精確至O.OOOlg ；
(c)超聲波提取器；
(d)高速離心機；
(3)樣品處理:
(d)酶解稱取樣品5g，精確至lmg，置于IOOmL三角瓶中，加入O.2g高峰氏淀粉酶，O. 2g木瓜蛋白酶，加入30mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_4h ；
(e)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲提取10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容；
Cf)高速離心凈化過濾定容后樣液轉入50mL離心管于10000r/min的離心機離心5min,上清液經(jīng)中速濾紙過濾，用一次性注射器吸取濾液l_2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過濾，濾液即為最終樣液，供HPLC測定。保留時間定性，外標法定量；
(4)色譜條件，色譜條件包括
Ca)色譜柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相當者；
(b)進樣量10μ ；
(c)流速1.OmL/min ；
(d)紫外檢測器波長254nm;
(e)柱溫25°C；
(f)流動相4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，低壓濃度洗脫；
(5)定量分析
(a)標準曲線繪制將標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀，測定相應的峰面積，以峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標繪制標準曲線，如圖3-圖7所示。利用高效液相色譜儀進行測定分析時，可直接讀出峰面積的數(shù)值；
(b)試液測定將制備好的樣液注入高效液相色譜儀，測得相應的峰面積，以圖3-圖7標準曲線對樣品進行定量，測得樣液中UMP的濃度為I. 907Pg/mL、AMP的濃度為0. 724ug/ml、GMP的濃度為4. 904ug/ml、IMP的濃度為I. 056ug/ml、CMP含量未檢出；
(c)根據(jù)公式X=CXV1X100/(mX 1000)可計算得出樣品中UMP的含量為3. 80mg/100g、AMP 含量為 I. 44mg/100g、GMP 含量為 9. 76mg/100g、MP 含量為 2. 10mg/100g、CMP含量未檢出；
權利要求
1.一種嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測方法，包括樣品酶解、超聲波提取、高速離心凈化過濾、色譜條件和定量分析，其特征在于包括如下工作步驟 (1)酶解稱取樣品5g-10g，精確至Img,置于100mL-200mL三角瓶中，加入0.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h ； (2)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容； (3)高速離心凈化過濾定容后樣液轉入50mL離心管于10000r/min的離心機離心5min，上清液經(jīng)中速濾紙過濾，用一次性注射器吸取濾液l-2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過濾；供HPLC測定，外標法定量。
2.—種嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測方法，包括如下工作步驟 (I)試劑準備，所用試劑包括 (a)甲醇色譜純； (b)四丁基硫酸氫銨色譜純； (c)磷酸氫二鉀分析純； (d)磷酸二氫鉀色譜純； Ce)乙酸優(yōu)級純； Cf)木瓜蛋白酶酶活力彡600U/g，0. 2-0. 4g ； (g)高峰氏淀粉酶酶活力彡4000U/g,0. 2-0. 4g ； (h)核苷酸標準品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:純度彡98% ； (i)0.lmol/L磷酸二氫鉀溶液稱取13. 60g磷酸二氫鉀用超純水溶解并定容至10OOmT,； (j)0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液稱取2. 28g磷酸氫二鉀用超純水溶解并定容至IOOmL ； (k) 100mL/L乙酸溶液吸取IOmL乙酸，加超純水定容至IOOmL ； (1)含I.40mmol/L四丁基硫酸氫銨的0. 01mol/L磷酸二氫鉀緩沖液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氫鉀溶液，加0. 4753g四丁基硫酸氫銨，用0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液調pH至3. 3，用超純水定容到IOOOmL ； Cm)核苷酸標準混合液分別準確稱取核苷酸標準品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg,混合后用超純水溶解并定容至100ml，此標準混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各為 100-200l^g/mL ； (n)核苷酸標準工作液分別吸取標準混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5個IOOml容量瓶中，加超純水定容至IOOmL,配成核苷酸系列標準工作液； (2)儀器設備，儀器設備包括 Ca)高效液相色譜儀島津LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測器； (b)電子天平精確至0.OOOlg ； (c)超聲波提取器； (d)高速離心機； (3)樣品處理:(a)酶解稱取樣品5g-10g，精確至lmg,置于100mL-200mL三角瓶中，加入0.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h ； (b)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲提取10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容； (c)高速離心凈化過濾定容后樣液轉入50mL離心管于10000r/min的離心機離心5min,上清液經(jīng)中速濾紙過濾，用一次性注射器吸取濾液l_2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過濾，濾液即為最終樣液，供HPLC測定，保留時間定性，外標法定量； (4)色譜條件，色譜條件包括 Ca)色譜柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相當者； (b)進樣量:10ML；(c)流速1.OmL/min ； (d)紫外檢測器波長254nm; (e)柱溫25°C； (f)流動相4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，低壓濃度洗脫； (5)定量分析 (a)標準曲線繪制將標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀，測定相應的峰面積，以峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標繪制標準曲線； (b)試液測定將制備好的樣液注入高效液相色譜儀，測得相應的峰面積，以標準曲線對樣品進行定量，測得試液濃度； (c)計算，計算公式為X=CXV1X100/(mX 1000)，式中 X :試樣中核苷酸各組分的含量,單位為mg/100g ； C :由標準曲線得到的試液濃度，單位為Pg/mL ； V1 :試樣定容體積，單位為mL ； m:試樣質量，單位為g ； 試樣中核苷酸含量ZzXeMp+X.+X^p+X^X^p。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嬰幼兒米粉中核苷酸含量的檢測方法。包括如下工作步驟包括樣品酶解、超聲波提取、高速離心凈化過濾、色譜條件和定量分析，其中酶解稱取樣品5g-10g，置于100mL-200mL三角瓶中,加入0.2-0.4g高峰氏淀粉酶，0.2-0.4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50℃水，攪拌均勻，置50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h；超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲，用乙酸溶液調pH值，用超純水定容；高速離心凈化過濾樣液經(jīng)離心機離心后，上清液經(jīng)中速濾紙過濾，再經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾，供HPLC測定，外標法定量。在嬰幼兒米粉中檢測核苷酸的含量，具有方便、快捷、準確等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/88GK102621261SQ20121002922
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權日2012年2月9日
發(fā)明者林旭彬, 陳潤漢, 黃樹杰 申請人:廣東東泰乳業(yè)有限公司