專(zhuān)利名稱(chēng)：基于液相芯片檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的引物對(duì)、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用，具體涉及基于液相芯片檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的方法。
背景技術(shù)：
流行性造血器官壞死病(Epizootic hematopoietic necrosis, EHN)是引起紅鰭鱸、歐鯰、虹鱒和鮰魚(yú)幼魚(yú)和成魚(yú)出現(xiàn)內(nèi)臟壞死，以至死亡的一種魚(yú)類(lèi)傳染病。流行性造血器官壞死病是由流行性造血器官壞死病毒(EHNV)引起的。EHN多在春季或早夏時(shí)發(fā)生，表征如下:魚(yú)游動(dòng)異常，有時(shí)沿螺旋游至水體表面；鰭條基部多出現(xiàn)出血點(diǎn)，頭部發(fā)紅，靠近骨骼的肌肉發(fā)白；肝臟處出現(xiàn)多個(gè)直徑1-3_的灰白色病灶；脾臟發(fā)紅、腫大、呈凝膠狀；鰓部充滿(mǎn)雜質(zhì)；有些患病成魚(yú)在縹和腎臟處的腹膜嚴(yán)重充血。鑒于EHN的嚴(yán)重危害性，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為必須申報(bào)疫病之一。因此，迫切需要建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。 目前，EHNV的檢測(cè)主要依靠免疫熒光、ELISA、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和核酸雜交這幾種技術(shù)。免疫熒光操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且靈敏度低。ELISA需要用進(jìn)口檢測(cè)試劑，進(jìn)口試劑和試劑盒特別昂貴，且使用時(shí)必須提前2個(gè)月左右定貨，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)進(jìn)程。核酸雜交具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，但相當(dāng)繁瑣，不適宜對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。PCR比較快速、靈敏，但是需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并通過(guò)溴化乙錠染色觀(guān)察結(jié)果，溴化乙錠是致癌物，對(duì)人體和環(huán)境有危害，交叉污染問(wèn)題比較嚴(yán)重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的引物對(duì)、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用，具體涉及基于液相芯片檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的方法。本發(fā)明提供了輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的特異引物對(duì)，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還提供了輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對(duì)和探針Tl組成；所述探針Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特異引物對(duì)或所述引物探針組合物可用于制備輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的試劑盒。所述特異引物對(duì)或所述引物探針組合物可用于輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的試劑盒，包括所述特異引物對(duì)或所述弓I物探針組合物。本發(fā)明還提供了一種輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的基因組DNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果所述PCR擴(kuò)增得到了擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病毒為候選的流行性造血器官壞死病毒；如果所述PCR擴(kuò)增沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病毒為候選的非流行性造血器官壞死病毒。所述擴(kuò)增產(chǎn)物的大小可為100-250bp之間，具體可為179bp。所述待測(cè)病毒為對(duì)蝦白斑病病毒或流行性造血器官壞死病毒。本發(fā)明還提供了另一種輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的基因組DNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后與所述探針Tl進(jìn)行雜交，如果雜交結(jié)果為陽(yáng)性待測(cè)病毒為候選的流行性造血器官壞死病毒，如果雜交結(jié)果為陰性待測(cè)病毒為候選的非流行性造血器官壞死病毒。所述待測(cè)病毒為對(duì)蝦白斑病病毒或流行性造血器官壞死病毒。所述輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的方法具體包括如下步驟(液相芯片法):(I)以待測(cè)病毒的基因組DNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)制備微球懸液①將表面羧基化的熒光編碼微球漩渦振蕩20s，取75 μ L (約含3 X IO6個(gè)微球)置于1.5mL離心管中，IOOOOg離心Imin,棄上清；②在步驟①的離心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，漩渦混合，超聲波處理30-60秒(400W的功率，每超聲9秒停6秒)；③在步驟②的離心管中加入1.0nmol所述探針Tl，漩渦混合；④在步驟③的離心管中加入2.5 μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法:將IOmg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配)充分混勻，室溫避光孵育30min ；⑤在步驟④的離心管中加入2.5μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法同上)充分混勻，室溫避光孵育30min ；⑥在步驟⑤的離心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混勻，IOOOOg離心Imin,棄上清；⑦在步驟⑥的離心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混勻，IOOOOg離心Imin,棄上清；⑧在步驟⑦的離心管中加入IOOyL 0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，重懸，得到微球懸液；(3)將步驟(I)的產(chǎn)物和步驟(2)得到的微球懸液進(jìn)行雜交即為實(shí)驗(yàn)組，用TE緩沖液代替步驟(I)的產(chǎn)物即為對(duì)照組；將雜交體系混合均勻后于98°C變性lOmin，然后在與雜交溫度相同的溫度下孵育15min，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ L用I X TMAC雜交液稀釋至500倍體積的SA-PE，48°C -54°C (優(yōu)選為54°C)雜交15min，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ L IX TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，置于BD FACSArray液相芯片儀中進(jìn)行分析；如果LQRR ^ 3，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；如果LQRR < 2，檢測(cè)結(jié)果為陰性；LQRR=MFIS/MFIB, MFIS為實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度中位值，MFIB為對(duì)照組的熒光強(qiáng)度中位值。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序:94°C 2min ；94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 30sec, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。液相芯片是一種新型快速檢測(cè)技術(shù)，集流式細(xì)胞術(shù)、納米熒光微球、熒光信號(hào)數(shù)字處理和傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)為一體，具有所需檢測(cè)樣本量少、檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)。
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采用本發(fā)明提供的特異引物對(duì)鑒定流行性造血器官壞死病毒具有良好的特異性。采用本發(fā)明提供的引物探針組合物結(jié)合液相芯片鑒定流行性造血器官壞死病毒，除了良好的特異性外，還具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短、不污染環(huán)境、不存在對(duì)人的健康威脅，可以進(jìn)行高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明非常適合對(duì)進(jìn)出境水生動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。


圖1為實(shí)施例2中的電泳圖。圖2為雜交溫度為54°C時(shí)，BD FACSArray液相芯片儀的輸出圖譜。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。DNA 提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.4.0):大連寶生物公司，D824A。PCR試劑盒(PCR Amplification Kit):大連寶生物公司，貨號(hào)為 R011。RNA 提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer4.0):大連寶生物公司，貨號(hào)為 DV819A。RT-PCR 試劑盒(PrimeScript RT-PCR Kit):大連寶生物公司，貨號(hào)為DRR014S。流行性造血器官壞死病毒(EHNV)，DNA病毒，參考文獻(xiàn):黃輝三；李明玉；母尹楠等流行性造血器官壞死病毒(EHNV)PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制.[J]臺(tái)灣海峽2011 (01)。對(duì)蝦白斑病病毒(WSSV)，DNA病毒，參考文獻(xiàn):江育林；陳在賢；鄭堅(jiān)川.用PCR快速檢測(cè)對(duì)蝦白斑病病毒DNA.[J]中國(guó)動(dòng)物檢疫.1998 (03)。鯉春病毒血癥病毒(SVCV)，RNA病毒，參考文獻(xiàn):付峰；劉葒；黃佳；蔡生力鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的研究進(jìn)展[J]中國(guó)水產(chǎn)科學(xué).2006 (02)。傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)，RNA病毒，參考文獻(xiàn):岳志芹；劉葒；梁成珠等實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)魚(yú)類(lèi)傳染性造血器官壞死病毒方法的建立與應(yīng)用[J].水生生物學(xué)報(bào).2008 (01)。病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)，RNA病毒，參考文獻(xiàn):悅穗；余曉?。煌踅ㄆ降?；應(yīng)用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)魚(yú)類(lèi)病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV) [J]海洋與湖沼2009(07)。實(shí)施例1、特異引物對(duì)和特異探針的設(shè)計(jì)通過(guò)大量序列比對(duì)和擴(kuò)增效果比較，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增流行性造血器官壞死病毒的特異引物對(duì)和特異探針。特異引物對(duì)如下(靶序列為179bp):Fl (序列表的序列 I):5’ -AACACGGCATACCTGGAC-3’ ；Rl (序列表的序列 2):5’ -GAGAAGAAGAATGGGAGGG-3’。

特異探針的核苷酸序列(序列表的序列3)如下:5， -AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGCG-3，。實(shí)施例2、應(yīng)用特異引物對(duì)輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒分別將流行性造血器官壞死病毒、對(duì)蝦白斑病病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性出血性敗血癥病毒作為待測(cè)病毒進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1、采用DNA提取試劑盒提取待測(cè)病毒(流行性造血器官壞死病毒或?qū)ξr白斑病病毒)的基因組DNA。2、以步驟I得到的基因組DNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)，采用PCR試劑盒，在梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系:在0.2mL PCR反應(yīng)管中，依次加入10XPCR buffer 2.5 μ L、dNTP (各 2.5mmo l/L) 2.0 μ UlOpmol/μ L Fl I μ L、IOpmol/μ L Rl I μ L, Taq (5U/μ L)0.25μ L、基因組DNA2.0μ L (約300ng)，加入雙蒸水使反應(yīng)體積達(dá)到25 μ L。以上反應(yīng)體系中，除了引物、基因組DNA和雙蒸水，其它組分均為PCR試劑盒的組分。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序:94°C 2min ；94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 30sec, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min ;4°C 保溫。3、采用RNA提取試劑盒提取待測(cè)病毒(鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒或病毒性出血性敗血癥病毒)的總RNA。4、以步驟I得到的總RNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)，采用RT-PCR試劑盒，在梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。 RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系:在0.2mL PCR反應(yīng)管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP (各 2.Smmol /I,) 2.0 μ L、IOpmoI / μ L Fl I μ L、IOpmoI / μ L Rl I μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5 μ L、AMV Taq (5U/μ L) 0.25 μ L、25mmol/L MgCl2 5.0yL、總RNA5.0 μ L，加入雙蒸水使反應(yīng)體積達(dá)到25 μ L。以上反應(yīng)體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。RT-PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、56 °C 30sec、72°C 30sec,30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。5、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟4得到的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖見(jiàn)圖1，泳道I至泳道5依次為流行性造血器官壞死病毒、對(duì)蝦白斑病病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性出血性敗血癥病毒，泳道M為DL2000markero以流行性造血器官壞死病毒的核酸為模板，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR，得到了大小在100-250bp之間擴(kuò)增產(chǎn)物，其它四種病毒均未得到任何擴(kuò)增產(chǎn)物。將流行性造血器官壞死病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為179bp。實(shí)施例3、應(yīng)用引物探針組合物輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒一、引物和探針的制備制備如下引物和探針:F2:5’ -biotin-AACACGGCATACCTGGAC-3’ ；R2:5’ -biotin-GAGAAGAAGAATGGGA GGG-3’。探針T1: 5，-NH2-AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGCG-3，。 F2是在Fl的5’末端進(jìn)行生物素標(biāo)記得到的，R2是在Rl的5’末端進(jìn)行生物素標(biāo)記得到的。探針Tl是在序列表的序列3所示單鏈DNA片段的5’末端進(jìn)行氨基化修飾得到的。二、液相芯片檢測(cè)體系的建立
1、采用DNA提取試劑盒提取流行性造血器官壞死病毒的基因組DNA。2、以步驟I得到的基因組DNA為模板，采用F2和R2組成的引物對(duì)，采用PCR試劑盒，在梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系:在0.2mL PCR反應(yīng)管中，依次加入10XPCR buffer2.5 μ L、dNTP (各 2.5mmol/L) 2.0 μ UlOpmol/μ L F2 I μ L、IOpmol/μ L R2 I μ L, Taq (5U/μ L)0.25μ L、基因組DNA2.0μ L (約300ng)，加入雙蒸水使反應(yīng)體積達(dá)到25 μ L。以上反應(yīng)體系中，除了引物、基因組DNA和雙蒸水，其它組分均為PCR試劑盒的組分。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序:94°C 2min ；94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 30sec, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。3、寡核苷酸探針與微球共價(jià)偶聯(lián)①將表面羧基化的熒光編碼微球漩渦振蕩20s以使其充分分散，取75 μ L (約含3 X IO6個(gè)微球)置于1.5mL離心管中，IOOOOg離心lmin，棄上清。②在步驟①的離心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，漩渦混合，超聲波處理30-60秒(400W的功率，每超聲9秒停6秒)。③在步驟②的離心管中加入1.0nmol探針Tl，漩渦混合。④在步驟③的離心管中加入2.5 μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法:將IOmg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配)充分混勻，室溫避光孵育30min。⑤在步驟④的離心管中加入2.5μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法同上)充分混勻，室溫避光孵育30min。

⑥在步驟⑤的離心管中加入1.0mL 0.02g/100mL Tween-20水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清。⑦在步驟⑥的離心管中加入1.0mL 0.lg/100mL SDS水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清。⑧在步驟⑦的離心管中加入100 μ L 0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重懸微球(探針已偶聯(lián)至微球表面)，得到微球懸液，2-8°C避光保存，待用。4、雜交實(shí)驗(yàn)組的雜交體系:由1.5 μ L步驟3得到的微球懸液、33 μ L 1.5 X TMAC雜交液、14.5 μ L TE緩沖液和2.5 μ L步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(即25微升PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的十分之一)組成?？瞻讓?duì)照組的雜交體系:用等體積的TE緩沖液代替RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其它同實(shí)驗(yàn)組的雜交體系。將雜交體系混合均勻后于98°C變性lOmin，然后在與雜交溫度相同的溫度下孵育15min，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ L用I XTMAC雜交液稀釋至500倍體積的SA-PE，選定溫度下雜交15min (分別采用481:、501:、521:、541:或561:的雜交溫度)，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ L IX TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，置于BDFACSArray液相芯片儀中進(jìn)行分析。每個(gè)雜交溫度的實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三個(gè)重復(fù)處理，每個(gè)雜交溫度的空白對(duì)照組設(shè)置三個(gè)
重復(fù)處理。每個(gè)重復(fù)處理中:參與計(jì)數(shù)的熒光編碼微球均在100個(gè)以上，表明用于計(jì)算的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度中位值(MFI)可信；3個(gè)空白對(duì)照組的熒光編碼微球的MFI值均小于500，試驗(yàn)可進(jìn)行結(jié)果判斷。采用48 °C的雜交溫度，對(duì)照組處理的MFI為210，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI為4136±23.5。采用50 °C的雜交溫度，對(duì)照組處理的MFI為206，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI為4194±12.6。采用52 °C的雜交溫度，對(duì)照組處理的MFI為209，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI為4478 ±24.7。采用54 °C的雜交溫度，對(duì)照組處理的MFI為213，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI為4912±19.2。采用56 °C的雜交溫度，對(duì)照組處理的MFI為203，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI為2165±20.2。結(jié)果表明:采用48°C _54°C的雜交溫度，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI變動(dòng)幅度不大，采用高于54°C的雜交溫度時(shí)，實(shí)驗(yàn)組處理的MFI下降劇烈，最佳雜交溫度為54°C。雜交溫度為54°C時(shí)，BD FACSArray液相芯片儀的輸出圖譜見(jiàn)圖2。圖2中:A:熒光編碼微球的數(shù)量及范圍:采用54°C的雜交溫度，實(shí)驗(yàn)處理組在Red-A、YelloW-A通道下的相對(duì)熒光強(qiáng)度；C:采用54°C的雜交溫度，實(shí)驗(yàn)處理組在Red-A通道下相對(duì)熒光強(qiáng)度；D:采用54°C的雜交溫度， 實(shí)驗(yàn)處理組在Yellow-A通道下相對(duì)熒光強(qiáng)度。從圖2可以觀(guān)察到，偶聯(lián)在微球上的探針Tl與流行性造血器官壞死病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在Red-A、Yel1w-A檢測(cè)通道下均有熒光信號(hào)，表明液相芯片構(gòu)建成功。三、液相芯片檢測(cè)體系重復(fù)性驗(yàn)證重復(fù)進(jìn)行三次步驟二，雜交溫度均采用54°C，計(jì)算各批次間檢測(cè)得到的MFI的變異系數(shù)。結(jié)果顯示，變異系數(shù)在4.7%以?xún)?nèi)，表明步驟二的方法具有良好的可重復(fù)性。四、液相芯片檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證分別將流行性造血器官壞死病毒、對(duì)蝦白斑病病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性出血性敗血癥病毒作為待測(cè)病毒進(jìn)行步驟二，雜交溫度均采用54°C，結(jié)果見(jiàn)表1。表1特異性檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的特異引物對(duì)，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成。
2.輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)和探針Tl組成；所述探針Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)或權(quán)利要求2所述引物探針組合物在制備輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)或權(quán)利要求2所述引物探針組合物在輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒中的應(yīng)用。
5.輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)或權(quán)利要求2所述引物探針組合物。
6.一種輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果所述PCR擴(kuò)增得到了擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病毒為候選的流行性造血器官壞死病毒；如果所述PCR擴(kuò)增沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病毒為候選的非流行性造血器官壞死病毒。
7.一種輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后與權(quán)利要求2所述引物探針組合物中的探針Tl進(jìn)行雜交，如果雜交結(jié)果為陽(yáng)性待測(cè)病毒為候選的流行性造血器官壞死病毒，如果雜交結(jié)果為陰性待測(cè)病毒為候選的非流行性造血器官壞死病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于液相芯片檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的方法。本發(fā)明提供了輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的特異引物對(duì)，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還保護(hù)輔助鑒定流行性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對(duì)和探針T1組成；所述探針T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。采用本發(fā)明提供的特異引物對(duì)鑒定流行性造血器官壞死病毒具有良好的特異性。采用本發(fā)明提供的引物探針組合物結(jié)合液相芯片鑒定流行性造血器官壞死病毒，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短、不污染環(huán)境、不存在對(duì)人的健康威脅，可以進(jìn)行高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173572SQ20131011688
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者方紹慶, 尹偉力, 王穎, 趙玉然, 劉寧, 許紅巖, 段效輝, 耿金培, 李金慶 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局