專利名稱：一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的生物質(zhì)，同時也是最廉價的可再生資源。纖維素酶是一類能將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們相互協(xié)同作用，將纖維素分解為寡糖和纖維二塘，最終水解為葡萄糖。而半纖維素是陸生植物中除纖維素外含量最豐富的碳水化合物。它由阿拉伯糖、半乳糖、木糖、及甘露糖幾種單糖聚合而成，其中木聚糖是半纖維素中最具代表性的組分之一，其骨架為β -1, 4-糖苷鍵相連的吡喃木糖主鏈，根據(jù)來源的不同，側(cè)鏈的取代基也不同。目前主要有兩類木聚糖酶，分別為β-1，4-木聚糖酶和β_木聚糖酶，這兩種酶共同作用能將木聚糖降解為單糖。雙功能酶是指酶蛋白的一條多肽鏈同時具有兩種水解酶活性，進(jìn)而能催化完成兩個不同的生物反應(yīng)過程，在其催化過程中往往會涉及到數(shù)目很多的中間體酶蛋白結(jié)構(gòu)。在自然界中，纖維素通常與木聚糖等半纖維素結(jié)合存在，因此天然的菌株中有很多菌都能產(chǎn)生纖維素和木聚糖雙功能酶，但是主要來源的菌種有 Clostridium papyrosolvens, Paenibacillus curdlanolyticus,Clostridium thermpcellum， Clostridium cellulovorans, Caldicellulosiruptorsaccharolyticus.
不同種(屬)的微生物所產(chǎn)生的雙功能酶發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)域也不同，比如由Murashima等人報道的纖維素酶_木聚糖酶復(fù)合體，只有在兩個結(jié)構(gòu)域都存在時才能將植物細(xì)胞壁降解，而兩個單獨的結(jié)構(gòu)域則沒法分解。而一株來源新西蘭溫泉的能解糖解纖維素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)的雙功能酶的結(jié)構(gòu)域是一個多結(jié)構(gòu)域水解酶，它包括一個GH 10家族、一個GH 5家族催化結(jié)構(gòu)域以及三個與底物結(jié)合的區(qū)域。盡管有很多種微生物能產(chǎn)生纖維素和木聚糖雙功能酶，但是要從天然的菌株中分離并純化出這些酶是比較費時、費力、成本非常的昂貴，而且天然菌株所產(chǎn)的酶產(chǎn)量并不高，需要進(jìn)一步通過物理、化學(xué)的誘變或者分子生物學(xué)手段來提高菌株的產(chǎn)酶量。但是如果能利用基因工程手段，將纖維 素酶結(jié)構(gòu)域中起催化作用的催化結(jié)構(gòu)域與木聚糖酶結(jié)構(gòu)域中與木聚糖催化作用相關(guān)的結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，這樣就能夠達(dá)到一種酶能同時具有纖維素酶和木聚糖雙酶活的酶，最重要的是重組后的雙功能酶的純化步驟很簡單，只需一步親和層析就能夠達(dá)到電泳純。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，ThCel9A的C端有兩個似乎與功能無關(guān)的Fn III和一個CBM2，隨后我們又發(fā)現(xiàn)一個木聚糖酶ThXynllA的C端也有一個CBM2。本發(fā)明利用ThXynllA (除去信號肽)來替換ThCel9A的C端Fn III及其后面的CBM2。由于耐熱或耐高溫木聚糖酶、纖維素酶在造紙、飼料、食品、農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用等工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用，因而近年來關(guān)于這方面的專利報道也較多。但是關(guān)于纖維素和木聚糖雙功能酶的專利報道卻很少。網(wǎng)上公布的信息中僅僅只有專利號為201210084663公開了一種纖維素和木聚糖酶雙功能酶具有一定的耐熱性，能作為一種料添加劑應(yīng)用于飼料等行業(yè)中。
生物脫墨因其污染小、效率高，近年來在世界范圍內(nèi)被廣泛的關(guān)注。目前國內(nèi)外應(yīng)用于生物脫墨中大部分使用的都是纖維素酶和木聚糖酶，其他酶在這方面的研究較少。在造紙工業(yè)中，同時具有纖維素酶活性和木聚糖酶活性的雙功能酶在廢紙脫墨時能提高紙漿纖維裂段長、耐破指數(shù)以及撕裂指數(shù)。在改善纖維素的裂段長、打漿性能以及改善濾水性等方面效果較好，而且木聚糖酶又有利于降低紙漿的脆性，因此雙功能酶中兩種酶活性同時存在的時候效果最佳。但在紙漿的漂白過程中，雙功能酶的木聚糖酶活性在降解木聚糖是木質(zhì)素暴露于漂葉使紙漿得以漂白的同時也會是纖維素降解，從而使得紙漿的強度降低。而本研究中得到的纖維素和木聚糖雙功能酶中的纖維素酶活性在高溫條件下酶活損失較大，因此在漂白的過程中纖維素酶活就會變得很弱，因而這種隨著條件改變而相對應(yīng)的改變酶活性的性質(zhì)對于其他的工業(yè)也有很多使用的價值。在飼料、食品以及果蔬加工中，雙功能酶可部分的替代粥化酶(纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶及淀粉酶的混合酶)，在條件相對而言較為溫和的條件下破壞原料的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。而且相對于多種單一功能酶的混合物而言，雙功能酶在降低生產(chǎn)成本、提高企業(yè)的效益方面都有著無法比擬的優(yōu)勢。因而，開發(fā)并利用雙功能酶就顯得十分必要了
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的是提供一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):本發(fā)明采用的耐鹽高溫雙歧菌(Thermobifida halotolerans) YIM 90462τ菌株，于2013年3月4日保存于韓國菌種保藏中心(KCTC)，保藏單位地址:韓國大田宇松路125號，305-806 信箱，保藏號:KCTC 12378BP。本發(fā)明的一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶經(jīng)如下具體步驟得到:1、ThXynllA 片段的擴增:I)根據(jù) ThXynllA 基因序列(GenBank 登錄號 JN016522),用 primier 5.0 設(shè)ii對含酶切位點的PCR引物如下:TXllF:CAGAAGCTTGCCGTGACCTCCAACCAGTXllR:CAACTCGAGGTTCGCGCTGCAGGAG(注:下劃線序列分別為HindII1、Xho I兩個限制性內(nèi)切酶識別位點。)2)以 Thermobifida halotolerans YIM 90462τ 的基因組 DNA 為模板,進(jìn)行 PCR 擴 增。
3)擴增得到的片段，經(jīng)電泳驗證后，做膠純化2.GH9-CBM3 片段的擴增:I)根據(jù)ThCel9A基因序列,用primier 5.0設(shè)計一對含酶切位點的PCR引物如下:G9C3F:GACGCATATGATGCCAGCCTCTGATCCCG9C3R: TTCAAGCTTCGGCGGGGTCCGGTCCT(注:下劃線序列分別為Nde1、Hind III兩個限制性內(nèi)切酶識別位點。)2)以 Thermobifida halotolerans YIM 90462τ 的基因組 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴增。
3)擴增得到的片段，經(jīng)電泳驗證后，做膠純化。
3.pET28a/ThXynllA 的構(gòu)建:I)將純化的ThXynllA基因片段和提取的pET28a質(zhì)粒，用Hind II1、Xho I酶切，混勻，37 °C孵育過夜。2)酶切后的質(zhì)粒和基因，經(jīng)電泳后做膠純化。3)將純化的酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶在16°C連接過夜。4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞。5)挑取5株克隆，液體培養(yǎng)過夜。6)菌液PCR驗證生長的克隆。7)取驗證成功的菌液提取質(zhì)粒,用Hind II1、Xho I酶切驗證。8)取酶切驗證成功的菌液，送上海生工測序。4.pET28a/ThCel9A_ThXynllA 的構(gòu)建:將純化的GH9-CBM3基因片段和提取的pET28a/ThXynllA質(zhì)粒，用Nde I ,Hind III酶切。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后，挑取克隆做菌液PCR驗證和酶切驗證。酶切驗證成功的菌液送上海生工測序。具體步驟同3。5.目的蛋白的表達(dá):5.1.目的蛋白表達(dá)菌的建立；取測序驗證正確的PET28a/ThCel9A-ThXynllA重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主BL21中。5.2.蛋白質(zhì)電泳驗證工程菌:5.2.1.目的蛋白的誘導(dǎo):取含有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)。2 h后，取1/2菌液于另外一個無菌的試管中，加IPTG濃度至I mM，繼續(xù)培養(yǎng)兩支試管4 h。5.2.2.SDS-PAGE 電泳:將培養(yǎng)好的兩試管菌液在1200 rpm下離心2 min收集菌體,蛋白制樣，電泳,染色，脫色。5.3.剛果紅驗證酶活:在培養(yǎng)基中添加0.5%CMC作為底物，待菌長好后，用0.1%剛果紅染色I(xiàn) h，到掉剛果紅染液，再用I M的NaCl溶液洗 脫，觀察透明圈。以未誘導(dǎo)的菌株作為對照。6.基因工程菌的發(fā)酵:挑取驗證成功的含有PET28a/ThCel9A-ThXynllA的工程菌接種4 mL LB培養(yǎng)基(含30 Pg/mL卡那霉素)，37°C培養(yǎng)過夜。將飽和的菌液按1:50接種于100 mL的TB液體培養(yǎng)基(含30 Pg/mL卡那霉素)中，220 rpm，37°C培養(yǎng)至0D_在0.6-0.8之間，加IPTG至終濃度1.0 mM，37°C繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。7.鎳柱親和層析I)將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液12000 rpmin離心后，取上清于250 mL三角瓶中，同時加入10 mL的Ni2+-NTA,放置在4°C，180 rpm搖床上孵育4-8 h。2)將孵育好的混合液裝進(jìn)空柱中，待發(fā)酵液流盡后，加入5體積的結(jié)合緩沖液，待結(jié)合緩沖液剩下一體積時關(guān)閉層析柱。3)用超純水洗清蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)。
4)將層析柱接到蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上，用結(jié)合緩沖液以I mL/min的流速平衡層析柱。5)設(shè)置洗脫緩沖液的濃度梯度以I mL/min的流速開始洗脫，待紫外吸收急劇上升時，保持該洗脫緩沖液的濃度連續(xù)洗脫并收集洗脫組分，收集的活性部分即為純酶。8.雙功能酶的酶學(xué)性質(zhì)檢測:見具體實施方式
部分的檢測實例。本發(fā)明的優(yōu)點在于:雙功能酶同時具有纖維素和木聚糖催化活性，在生物脫模、造紙、飼料、食品以及果蔬加工中具有較為廣泛的應(yīng)用；


:圖1為雙功能酶的纖維素酶活反應(yīng)溫度和相對活性的關(guān)系曲線。圖2為雙功能酶的纖維素酶活反應(yīng)pH和相對活性的關(guān)系曲線。圖3為雙功能酶的木聚糖酶活反應(yīng)溫度和相對活性的關(guān)系曲線。圖4為雙功能酶的木聚糖酶活反應(yīng)pH和相對活性的關(guān)系曲線。
具體實施方式
:本發(fā)明的一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶經(jīng)同發(fā)明內(nèi)容部分所述的具體步驟得到。 本發(fā)明的雙功能酶的酶學(xué)性質(zhì)檢測如下:實施例1:雙功能酶纖維素酶活的最適反應(yīng)溫度1.準(zhǔn)確稱取0.50 g的羧甲基纖維素(低粘度，sigma)溶解于100 mL的50 mM pH
8.0 Tris-HCl緩沖液中。2.取上述底物溶液分裝于32個Eppendorf管中，每管90 yL。其中24管為測定管，另外8管為對照管，分別置于20°c、30°c、4(rc、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc和90°C 8個不同的溫度下孵育30 min，每管做3個重復(fù)。3.加入10 μ L合適的稀釋酶液，以滅活的酶液為對照。4.反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速加入DNS終止反應(yīng)。5.沸水浴反應(yīng)5 min。6.在波長為540 nm處測其吸光度。以活力最高溫度下所測得的酶活為參照，其余溫度下所測得的酶活與其相對比，以相對酶活繪制酶催化溫度曲線。實施例2:雙功能酶纖維素酶活的最適反應(yīng)pH1.準(zhǔn)確稱取0.50g的羧甲基纖維素溶解(低粘度，sigma)于100 mL不同pH值的7種緩沖液中，所用到的緩沖液有:0.1 M的pH 2.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液，pH 4-6的檸檬酸鈉緩沖液，pH 7-8磷酸鈉緩沖液、pH 9-10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。2.取上述底物溶液分裝于28個Eppendorf管中(每種pH值4管)，每管90 μ L。其中21管為測定管，另外7管為對照管，置于50°C水浴平衡20 min。3-6步驟實施例1。以活力最高的pH下所測得的酶活為參照，其余pH下所測得的酶活與其相對比，以相對酶活繪制酶催化PH曲線。
實施例3:雙功能酶的木聚糖酶活最適反應(yīng)溫度1.準(zhǔn)確稱取0.5g的樺木木聚糖，溶解于50mL的50mM pH8.0磷酸鹽緩沖液中。2.取上述底物溶液分裝于32個Eppendorf管中，每管90 μ L。其中24管為測定管，另外8管為對照管，分別置于20°c、30°c、4(rc、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc和90°C等8個不同的溫度下孵育30 min，每管做3個重復(fù)。3.加入10 μ L合適的稀釋酶液，以滅活的酶液為對照。4.反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速加入DNS終止反應(yīng)。5.沸水浴反應(yīng)5 min。6.在波長為540 nm處測其吸光度。以活力最高溫度下所測得的酶活為參照，其余溫度下所測得的酶活與其相對比，以相對酶活繪制酶催化溫度曲線。實施例4、雙功能酶的木聚糖酶活最適反應(yīng)pHI準(zhǔn)確稱取0.50g的樺木木聚糖。溶解于50ml不同pH值的12種緩沖液中，所用到的緩沖液有:所用到的緩沖液有:0.1 M的pH 2.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液，pH 4-6的檸檬酸鈉緩沖液，pH 7-8磷酸鈉緩沖液、pH 9-10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。2.取上述底物溶液分裝于28個Eppendorf管中(每種pH值4管)，每管90 μ L。其中21管為測定管，另外7管 為對照管，置于70°C水浴平衡20 min。3-6步驟同實施例3。以活力最高的pH下所測得的酶活為參照，其余pH下所測得的酶活與其相對比，以相對酶活繪制酶催化PH曲線。
權(quán)利要求
1.一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶，其特征在于該雙功能酶經(jīng)如下構(gòu)建方法得到: a.以保藏號:KCTC12378BP的耐鹽高溫雙歧菌 Μ 90462τ為出發(fā)菌株，根據(jù)ThXynIlA以及ThCel9A的基因序列，利用primer 5.0分別設(shè)計一對含有酶切位點的PCR引物，分別擴增出ThXyn IlA片段及GH9-CBM3片段；其中: ThXynllA片段擴增的PCR引物為:TXllF:CAGAAGCTTGCCGTGACCTCCAACCAGTXllR:CAACTCGAGGTTCGCGCTGCAGGAG ； GH9-CBM3片段擴增的PCR引物為:G9C3F:GACGCATATGATGCCAGCCTCTGATCCCG9C3R:TTCAAGCTTCGGCGGGGTCCGGTCCT ； b.分別構(gòu)建pET28a/ThXyn IlA 及 pET28a/ThCel9A_ThXyn 11A，最后將重組質(zhì)粒pET28a/ThCel9A-ThXyn IlA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)宿主BL21中； c.通過剛果紅染色驗證雙功能酶已經(jīng)分泌并表達(dá)； d.經(jīng)過小量發(fā)酵從構(gòu)建的工程菌發(fā)酵液中分離并純化出的雙功能酶對纖維素的最適反應(yīng)溫度為50 °C，最適反應(yīng)pH值為8.0，而對木聚糖的最適的反應(yīng)溫度為70 °C，最適反應(yīng)pH值為8.0?！?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有纖維素和木聚糖催化活性的雙功能酶，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明經(jīng)過如下方法得到以保藏號KCTC 12378BP的耐鹽高溫雙歧菌(Thermobifida halotolerans)YIM 90462T為出發(fā)菌株，根據(jù)ThXyn 11A 以及ThCel9A的基因序列，利用primer 5.0 分別設(shè)計一對含有酶切位點的PCR引物，分別擴增出ThXyn 11A片段及GH9-CBM3片段；然后再分別構(gòu)建pET28a/ThXyn 11A及pET28a/ThCel9A-ThXyn 11A，最后將重組質(zhì)粒pET28a/ThCel9A-ThXyn 11A轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)宿主BL21中；通過剛果紅染色驗證雙功能酶已經(jīng)分泌并表達(dá)。從構(gòu)建的工程菌發(fā)酵液中分離并純化出的雙功能酶對纖維素的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH值為8.0，而對木聚糖的最適的反應(yīng)溫度為70 ℃，最適反應(yīng)pH值為8.0。在堿性條件下能保持較高的活力，在制漿和造紙、食品、醫(yī)藥、能源、飼料工業(yè)中將具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/70GK103243082SQ20131011770
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者李文均, 張峰, 楊心意, 楊玲玲, 明紅, 周恩民, 唐蜀昆 申請人:云南大學(xué)