專利名稱：一株用于防治煙草黑脛病的枯草芽孢桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物病害生物防治技術領域，特別是涉及一株用于防治煙草黑脛病的枯草芽孢桿菌。
背景技術：
煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，煙草黑脛病是世界各煙草種植區(qū)的重要病害之一。我國大部分煙草種植區(qū)均有發(fā)生，且在多個省市發(fā)生危害嚴重。為了迎合工業(yè)上對特色品質的需求，生產(chǎn)上種植的煙草品種有許多抗病性程度不高。目前對黑脛病的控制仍然以化學藥劑為主，從而導致病原菌抗藥性增強、環(huán)境污染及煙葉重金屬含量超標等后果，影響防治效果、生態(tài)安全和人類健康。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一株用于防治煙草黑脛病的枯草芽孢桿菌TBSCQ057，一種從健康煙株分離獲得的內生細菌。從植物微生態(tài)系統(tǒng)角度，利用內生細菌對煙株根際生態(tài)、植株生理生化和病原菌等方面的綜合作用，并以此來控制煙草黑脛病害。菌株TBSCQ057能促進土壤礦化及植株對養(yǎng)分的吸收，可顯著降低土壤中真菌數(shù)量，提高細菌數(shù)量，尤其能提高固氮、解磷和解鉀3大功能細菌數(shù)量，且對煙苗具有很好的促生作用。經(jīng)平板對峙培養(yǎng)拮抗測試，該菌株對煙草黑脛病菌等多種病原菌有很強的抑制作用，經(jīng)溫室盆栽和田間小區(qū)試驗，表明菌株TBSCQ057對煙草黑脛病有很好的防治效果。
TBSCQ057菌株分離純化和篩選:采集健康煙株，對樣品進行表面消毒處理，然后剝去表皮，切取內部組織搗碎，取靜置液涂于牛肉汁蛋白胨平板，選取典型菌落，純化。再在燕麥培養(yǎng)基上與煙草黑脛病菌進行對峙培養(yǎng)，獲得對黑脛病菌有較強抑制作用的菌株。
TBSCQ057菌株的形態(tài)特征鑒定:菌株TBSCQ057在NA培養(yǎng)基上菌落邊緣不整齊，扁平，乳白色，干燥，無光澤；革蘭氏染色陽性，芽孢卵圓形，中生，周生鞭毛。顯微觀察菌體為單細胞，桿狀，單生或雙生，有時成鏈，大小為0.8 1.2 iimX1.9 4.9 ii m ;石蕊牛奶產(chǎn)堿、胨化，糖發(fā)酵產(chǎn)酸、檸檬酸鹽、接觸酶、V-P反應、淀粉水解、硝酸鹽還原反應、明膠液化等為陽性；卵黃反應、馬尿酸鹽、酪氨酸、丙酸鹽和苯丙氨酸脫氨酶反應均為陰性；可以在含5%、7% NaCl和pH 5.7的葡萄糖培養(yǎng)基上生長。根據(jù)這些特性，將TBSCQ057初步鑒定為枯草芽孢桿菌iBacillus subtilis、。
TBSCQ057菌株分子鑒定:提取菌株TBSCQ057的總DNA，將所提取的樣品基因組DNA溶液稀釋作為模板進行PCR擴增，PCR擴增采用細菌通用引物fDl和rPl。fDl: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，rPl:5’-ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。以菌株TBSCQ057的基因組DNA為 模板，PCR擴增后經(jīng)電泳檢測，得到I條約為1.5 kb的條帶，經(jīng)測序分析確定16S rDNA片斷長度為1397kb。結合形態(tài)特征，將TBSCQ057菌株確定為枯草芽抱桿菌subtilis0
TBSCQ057菌種的活體純培養(yǎng)已于2012年06月15日保藏于‘中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心’(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101，電話:010-64807355)，保藏號:CGMCC N0.6223。TBSCQ057菌株對煙草黑脛病菌的抑制作用:內生細菌TBSCQ057對黑脛病菌在平板對峙培養(yǎng)過程中有很強的抑制作用，菌落成橢圓形擴展。顯微觀察發(fā)現(xiàn)菌絲扭曲、分支增多。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲畸形，膨大且分支短粗，有的形成小瘤狀物，多數(shù)表現(xiàn)出短粗的結節(jié)。TBSCQ057菌株對煙草黑脛病的防治效果:煙草黑脛病是一種土傳根莖類病害，病原菌主要通過根和莖基部侵入寄主。本發(fā)明針對病原菌的侵入途徑，利用TBSCQ057發(fā)酵液進行灌根處理，獲得了好的防治效果。TBSCQ057發(fā)酵液對煙草黑脛病的溫室防治效果為69.28% ;兩年的田間小區(qū)防治效果分別為61.25%和72.49%，與對照化學藥劑58%甲霜 錳鋅可濕性粉劑的防治效果無顯著差異0°>0.05)。TBSCQ057菌株的最佳發(fā)酵條件:菌株發(fā)酵條件單因素測定表明，菌株TBSCQ057生長和抑制黑脛病菌的拮抗物質產(chǎn)生的最適單因素條件分別是:發(fā)酵溫度為28 °C、培養(yǎng)液初始pH值為7.0、發(fā)酵時間為48 h、搖瓶轉速180 r/min和25 mL/500mL三角瓶裝液量。進行正交試驗優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件組合為發(fā)酵溫度為28 °C、培養(yǎng)液初始pH值為
7.0、發(fā)酵時間為72 h、搖瓶轉速180 r/min和25 mL/500 mL三角瓶裝液量。TBSCQ057·菌株的抗菌譜分析:該菌株能抑制多種植物病原真菌，如小麥赤霉病菌、煙草白絹病菌、番茄早疫病菌、煙草灰霉病菌、玉米紋枯病菌、棉黃萎病菌、花生黑斑病菌、煙草赤星病菌和煙草炭疽病菌，TBSCQ057菌株均表現(xiàn)出抑制作用，對煙草4種病原真菌(煙草赤星病菌、煙草炭疽病菌、煙草灰霉病菌和煙草白絹病菌)均有較強的抑制作用。菌株TBSCQ057的拮抗代謝產(chǎn)物分析:測試表明該菌株可以產(chǎn)生纖維素酶，蛋白酶，嗜鐵素，但是不產(chǎn)生幾丁質酶。本發(fā)明的優(yōu)點
從健康煙株中分離獲得的內生枯草芽孢桿菌TBSCQ057菌株，是首次發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個新菌株，其本身在平板上對煙草黑脛病菌等多種植物病原菌有很強的抑制作用，其發(fā)酵液對煙草黑脛病有很好的防控效果。因為該菌株是從煙株內部分離獲得，表明該菌株可以在煙株內部定殖，且該菌株對煙株有促生作用。同時，該菌株與煙株微生態(tài)有天然的和諧相融性，與化學農(nóng)藥相比對土壤生態(tài)無毒副作用、無殘留，因此，在病害的生物防治實踐中具有潛在的商業(yè)開發(fā)和應用價值。


圖1為菌株TBSCQ057菌落形態(tài)；
圖2為菌株TBSCQ057桿狀菌體及周生鞭毛；
圖3為菌株TBSCQ057 16S rDNA的PCR擴增結果；M:100bp DNA梯度Marker ;泳道1-6:Itb57 ;泳道7、8:陽性對照；泳道9:陰性對照；泳道10:空白對照圖4為菌株TBSCQ057的16S rDNA擴增序列；
圖5為菌株TBSCQ057對煙草黑脛病菌的抑制效果(左:受抑制菌落，右:正常菌落)；
圖6為菌株TBSCQ057對煙草黑脛病的溫室防治效果(A:病原菌處理，B:甲霜 錳鋅處理，C:菌株TBSCQ057處理，D:清水處理)；圖7為菌株TBSCQ057對煙草赤星病菌(AltGrrmria alternate')、煙草白絹病菌lSclerotium rolfsii)、煙草灰霉病菌{Botrytis cinerea)和煙草炭疽病菌{ColIeto trichum nigrum)的抑制效果； 圖8為菌株TBSCQ057的拮抗代謝產(chǎn)物檢測A.幾丁質酶，B.纖維素酶，C.蛋白酶，D.嗜鐵素。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述 實施例1菌株TBSCQ057的獲得及相關性狀分析 1.1菌株TBSCQ057的分離純化:采集健康煙株，對樣品進行常規(guī)表面消毒處理，然后剝去表皮，切取內部組織搗碎，取靜置液涂于牛肉汁蛋白胨平板，選取典型菌落，純化。再在燕麥培養(yǎng)基上與煙草黑脛病菌進行對峙培養(yǎng)，獲得對黑脛病菌有較強抑制作用的TBSCQ057菌株。
1.2菌株TBSCQ057對煙苗生長的影響:將保存在斜面培養(yǎng)基上的菌株TBSCQ057菌落接種到NB培養(yǎng)液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌懸液，再將菌懸液稀釋成3 X IO8 cfu/mL。取菌懸液進行以下4種處理:A (浸種處理)、B (浸種+灌根處理)、C (噴霧灌根處理)、D (空白對照-用無菌水浸種、催芽處理)。隨后每缽按相同粒距播種5粒，待萌發(fā)整齊后，保持每缽2株幼苗，每處理4次重復。間苗后第30天用菌懸液對處理B的煙苗進行灌根，每缽用量10 mL ;對處理C的煙苗先噴濕葉面再將剩余菌液灌根，每缽用量10 mL ;對處理A、D的煙苗用無菌水進行灌根處理，每缽用量10 mL。所有處理在相同光照及水肥條件下培養(yǎng)，隨機排列，每天轉動位置。培養(yǎng)至第45天測定每缽煙草幼苗的真葉數(shù)，最大葉的長、寬，地上部鮮重和干重。以此檢測菌株TBSCQ057對煙苗生長的影響。
1.3菌株TBSCQ057對煙苗根際菌群的影響:將菌懸液處理后培養(yǎng)的根際土壤取樣，應用稀釋法，將土樣制成系列稀釋度至10_4，分別以每皿50、50、100 u I的量接入PDA、NA和高氏一號培養(yǎng)基中，用以測定真菌、細菌和放線菌總量，每個樣品每種培養(yǎng)基設3個重復。分別將真菌置25°C、細菌置28°C、放線菌置30°C溫箱培養(yǎng)2-4d，觀察并計菌落數(shù)。功能菌群分離計數(shù)采用各選擇性培養(yǎng)基及相應培養(yǎng)方法。以此分析菌株TBSCQ057對土壤中真菌、細菌和放線菌數(shù)量的影響，同時檢測對固氮、解磷和解鉀3大功能細菌數(shù)量影響。
1.4菌株TBSCQ057對煙草黑脛病的拮抗作用:在PSA平板中心接種煙草黑脛病菌菌絲塊，在距平板中心3.0 cm的兩邊對稱劃線接種菌株TBSCQ057菌懸液，設不接種拮抗細菌TBSCQ057為對照，置于28°C溫箱培養(yǎng)。4天后觀察拮抗效果。然后用刀片切取受抑制的煙草黒脛病菌菌落邊緣菌絲塊及對照菌絲塊。經(jīng)系列掃描電鏡樣品制備過程后，將制好的標本在掃描電鏡下 觀察。以此分析該菌株對黑脛病菌的抑制作用。
1.5菌株TBSCQ057的鑒定:(I)形態(tài)學觀察與鑒定:將菌株TBSCQ057在NA培養(yǎng)平板上于28°C下培養(yǎng)l-3d，觀察其菌落形態(tài)(形狀、顏色光澤、表面是否隆起或凹陷、邊緣形狀等)；(2)分子生物學鑒定:提取菌株TBSCQ057的基因組DNA，以細菌通用引物fDl:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，rPl:5’ -ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3’，以菌株 TBSCQ057的基因組DNA為模板，PCR擴增后經(jīng)電泳檢測，測序；利用NCBI網(wǎng)站上的Blast軟件和BioEdit軟件進行序列同源性分析，以同屬的cereus為外組群,采用Mega 4.0軟件的鄰近法(Neighbor -Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，由此確證菌株TBSCQ057的種級分類階元名稱。確定其分類地位。
實例2.菌株TBSCQ057對黑脛病的防治效果 2.1溫室控病測試；刮下在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的黑脛病菌菌絲，加入0.1% KNO3溶液浸潤，產(chǎn)孢后加無菌水搗碎，調整濃度為約I X IO4個孢子囊/mL，于8 °C下放置20 min后稀釋10倍，加入I %的葡萄糖后備用。TBSCQ057發(fā)酵液是用10-100 L全自動發(fā)酵罐中發(fā)酵2天獲得。將發(fā)酵液濃度調整為約IXlO8 cfu/mL。盆栽試驗使用滅菌菜地土，裝入10cmXIO cm盆栽缽中，移栽時和接種病原菌前10天灌施TBSCQ057發(fā)酵液，每次每株10 mL。對照藥劑(58%甲霜 錳鋅可濕性粉劑)以500倍液于接種病原菌前24 h灌根，每株10 mL,設清水處理為空白對照，每個處理15株，3次重復。當煙苗長至6-7片真葉時灌根接種煙草黑脛病菌，每株10 mL，接種前用少量清水濕潤土壤。處理后將植株置于20 °C黑暗下24h，再置于28 1:溫室培養(yǎng)，常規(guī)管理。7天后調查煙草植株發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)，以此分析TBSCQ057菌株發(fā)酵液對煙草黑脛病的溫室控制效果。
2.2田間防治測試:選擇煙草黑脛病常年發(fā)病的地塊，煙苗移栽時用20%稻靈 噁霉乳油1500倍液浸根處理。從移栽開始按下列方式處理:用IXlO8 cfu/mL的TBSCQ057菌株發(fā)酵液灌根，每株250 mL,以58%甲霜 錳鋅可濕性粉劑500倍液等量灌根為藥劑對照，設清水灌根為空白對照。每小區(qū)面積50 m2，植煙70株，小區(qū)隨機排列，3次重復，采用常規(guī)大田煙草栽培管理。于煙葉收獲中期調查發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)，以此計算TBSCQ057發(fā)酵液對煙草黑脛病的田間相對防治效果。
實例3菌株TBSCQ057發(fā)酵條件 3.1培養(yǎng)基pH值:用無菌lmol/L NaOH或HCl將滅菌后的30g/L花生粉培養(yǎng)液一升的 pH 值分別調節(jié)為 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 和 11.0 等 10 種處理，每處理3次重復。按5%接種量接入TBSCQ057菌懸液，在28 °C, 18 0 r/min下，黑暗振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋后，用血球計數(shù)板計數(shù)濃度以確定最佳pH值。
3.2培養(yǎng)溫度:利用30g/L花生粉培養(yǎng)液分別在22、25、28、31、34和37 °C培養(yǎng)，按5%接種量接入TBSCQ057菌懸液，在28 °C, 180 r/min下，黑暗振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋后。用血球計數(shù)板計數(shù)濃度，每處理3次重復，以確定最佳培養(yǎng)溫度。
3.3通氣量:利用30g/L花生粉培養(yǎng)液分別在裝液量為25、50、75、100和150mL/500 mL三角瓶培養(yǎng)，按5%接種量接入TBSCQ057菌懸液，在28 V，180 r/min下，黑暗振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋后。用血球計數(shù)板計數(shù)濃度，每處理3次重復。以確定最佳通氣量。
3.4培養(yǎng)時間:利用30g/L花生粉培養(yǎng)液搖瓶發(fā)酵，分別培養(yǎng)24、36、48、60、72、96和120 h，按5%接種量接入TBSCQ057菌懸液，在28 °C, 180 r/min下，黑暗振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋后。用血球計數(shù)板計數(shù)濃度，每處理3次重復，以確定最佳培養(yǎng)時間。
3.5搖床轉速:利用30g/L花生粉培養(yǎng)液搖瓶發(fā)酵，轉速分別設為90、120、150、180和210 r/min，按5%接種量接入TBSCQ057菌懸液，在28 °C, 180 r/min下，黑暗振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋后。用血球計數(shù)板計數(shù)濃度，每處理3次重復，以確定最佳培養(yǎng)時間。
3.6發(fā)酵條件優(yōu)化:以前述方法測得的各單因素最佳條件為基礎，如下表設計5因素，4水平進行正交試驗并測定生長量。以此分析TBSCQ057菌株的最優(yōu)化發(fā)酵條件。
表I因素與水平
權利要求
1 一株用于防治煙草黑脛病的枯草芽孢桿菌Uaci77心TBSCQ057，其保藏號為 CGMCC NO. 6223。
全文摘要
一株對煙草黑脛病具有生防活性的枯草芽孢桿菌菌株TBSCQ057，屬農(nóng)業(yè)病害生物防治領域。此菌從自然環(huán)境寄主植物中分離獲得，根據(jù)形態(tài)特征和分子生物學鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。該菌對煙草黑脛病菌有很強的抑制作用，對煙草黑脛病有很好的控制效果。同時，該菌株還具有廣譜拮抗活性，對煙草灰霉病菌、煙草赤星病菌、煙草白絹病菌和煙草炭疽病菌等多種病原真菌抑菌效果較好。該菌株次生代謝產(chǎn)物中有纖維素酶，蛋白酶和嗜鐵素等。TBSCQ057菌體制劑對煙草黑脛病有很好的控制作用，經(jīng)發(fā)酵菌體或次生代謝產(chǎn)物提取技術可生產(chǎn)環(huán)境友好型生物農(nóng)藥，具有重要的商業(yè)開發(fā)應用價值。
文檔編號C12R1/125GK103224897SQ20131012432
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權日2013年4月11日
發(fā)明者王勇, 邢小軍, 盧軍, 馬冠華, 肖崇剛, 董國菊 申請人:四川省煙草公司涼山州公司, 西南大學