轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是關(guān)于一種轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,該方法是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:供卵鼠與雄鼠正常交配產(chǎn)生受精卵,取出受精卵在倉(cāng)鼠專(zhuān)用培養(yǎng)液中培育,并顯微注射綠色熒光蛋白基因,再回輸至代孕鼠體內(nèi)進(jìn)行繁育。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法培育轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的技術(shù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于基因工程領(lǐng)域的一個(gè)發(fā)明,特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法。 【背景技術(shù)】
[0002]近數(shù)十年來(lái),由于人類(lèi)生活方式的改變,代謝性心血管病(糖脂代謝紊亂的動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病)已經(jīng)超過(guò)腫瘤成為人類(lèi)死亡率最高的疾病。因此對(duì)代謝性心血管病的廣泛深入研究已經(jīng)到了刻不容緩的時(shí)期。而這樣的研究雖然可以通過(guò)對(duì)臨床病人的直接調(diào)研進(jìn)行,但由于心血管系統(tǒng)的樣本難以從病人身上獲取,且各種有損傷的實(shí)驗(yàn)條件也不可能施加到病人身上,因此應(yīng)用代謝性心血管病的動(dòng)物模型來(lái)開(kāi)展相應(yīng)研究是必不可少的。
[0003]隨著研究技術(shù)的發(fā)展,國(guó)內(nèi)外眾多科研機(jī)構(gòu)研發(fā)出了多種基因修飾的基因工程小鼠用于代謝性心血管病的研究。這些小鼠模型在很大程度上可以模擬人類(lèi)的疾病狀況,大大深化了人們對(duì)代謝性心血管疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)。
[0004]由于小鼠在心血管系統(tǒng)以及代謝上與人類(lèi)的巨大差別,雖然應(yīng)用這些基因修飾的基因工程小鼠推進(jìn)了人們對(duì)人類(lèi)代謝性心血管病的認(rèn)識(shí),但在這些模型上得到的很多信息,如果要直接應(yīng)用于人類(lèi)代謝性心血管病的臨床防治上,還是有很大的限制。因此擺在我們面前的一個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題,是要繼續(xù)研發(fā)出更接近人類(lèi)代謝性心血管病,且具有與小鼠相似的易繁殖、易飼養(yǎng)、研究周期短等特點(diǎn)的模式動(dòng)物。
[0005]在世界最大的默克制藥公司科研部2012年發(fā)表的報(bào)告中,比較了 20多種動(dòng)物模型(包括多種靈長(zhǎng)類(lèi)和最常用的ApoE和LDL受體基因敲除小鼠)的脂代謝特點(diǎn)和對(duì)降脂藥物的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)小動(dòng)物中的倉(cāng)鼠與人類(lèi)的相關(guān)代謝參數(shù)最相近。
[0006]倉(cāng)鼠是一種小型嚙齒類(lèi)動(dòng)物。與小鼠和大鼠不同,倉(cāng)鼠的脂蛋白代謝特點(diǎn)在以下幾個(gè)方面有人類(lèi)相似:(I)血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)水平高;(2)具有腸道載脂蛋白B編輯功能;(3)肝脂酶錨定在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮水解甘油三酯作用;(4)肝LDL受體活性較低。因此,和其它品種的鼠類(lèi)相比,倉(cāng)鼠對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的易感性明顯要高。
[0007]通過(guò)大量文獻(xiàn)檢索,國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)制備轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠方法的報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn),美國(guó)馬里蘭大學(xué)分子神經(jīng)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任Robert G Rohwer教授曾于2002年在其“瘋牛病蛋白的研究”項(xiàng)目中,委托加州著名生物技術(shù)公司TOSK Inc.以基因轉(zhuǎn)座子技術(shù)制備用于瘋牛病研究的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠。然而3年后的后續(xù)報(bào)告則提及,該公司未能制備成功轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠。雖然他們并沒(méi)有報(bào)道失敗的原因,但通過(guò)和國(guó)內(nèi)外同行交流了解到,吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院、云南動(dòng)物研究所以及匈牙利和法國(guó)曾經(jīng)有研究組嘗試倉(cāng)鼠的胚胎操作,但由于倉(cāng)鼠受精卵在體外發(fā)育過(guò)程中有一種特殊的“雙細(xì)胞發(fā)育阻滯”(block of2cell development)現(xiàn)象,所以回輸?shù)襟w內(nèi)的受精卵都不能發(fā)育為成熟倉(cāng)鼠胚胎。而體外培養(yǎng)的受精卵大多停滯在雙細(xì)胞期,因此雙細(xì)胞阻滯是阻礙成功制備轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的主要原因。
[0008]因此,從現(xiàn)有技術(shù)來(lái)看,倉(cāng)鼠在代謝性心血管病研究中具有重要的價(jià)值,且倉(cāng)鼠的飼養(yǎng)和繁育成本相對(duì)低廉;但是,轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的研究在國(guó)內(nèi)外仍然是空白。有鑒于此,本發(fā)明人基于從事此類(lèi)技術(shù)研究多年豐富的實(shí)務(wù)經(jīng)驗(yàn)及專(zhuān)業(yè)知識(shí),并配合學(xué)理的運(yùn)用,積極加以研究創(chuàng)新,以期創(chuàng)設(shè)一種新的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,使其更具有實(shí)用性。經(jīng)過(guò)發(fā)明人不斷的研究、設(shè)計(jì),在長(zhǎng)期對(duì)倉(cāng)鼠轉(zhuǎn)基因技術(shù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上,突破了倉(cāng)鼠胚胎雙細(xì)胞發(fā)育阻滯的技術(shù)瓶頸,成功制備了國(guó)際上第一個(gè)綠色熒光蛋白基因修飾倉(cāng)鼠模型。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的主要目的在于,克服現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠制備方法存在的缺陷,而提供一種新的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠制備方法,所要解決的技術(shù)問(wèn)題是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的“雙細(xì)胞發(fā)育阻滯”障礙,從而能夠順利制備轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠,使其具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于,提供一種突破“雙細(xì)胞發(fā)育阻滯”技術(shù)障礙而制備的倉(cāng)鼠,從而為研究代謝性心血管病提供更多的動(dòng)物模型。
[0011]本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其主要包括如下步驟:收集單個(gè)受精卵;將受精卵于體外進(jìn)行培育;以及在受精卵分裂成2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞后,送入倉(cāng)鼠體內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行培育。
[0012]本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。
[0013]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的受精卵是倉(cāng)鼠動(dòng)情周期第三天交配后獲得的。
[0014]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的將受精卵于體外進(jìn)行培育的培養(yǎng)液中鈣離子濃度為1.5mM,培養(yǎng) 溫度為39°C。
[0015]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的培養(yǎng)液為HECM-10培養(yǎng)基。
[0016]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的培養(yǎng)液于4攝氏度下保存。
[0017]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的培養(yǎng)液中的氨基酸配制成濃縮100倍的儲(chǔ)備液,培養(yǎng)液中的其它成分直接配制。
[0018]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的儲(chǔ)備液于_4°C下保存。
[0019]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的將受精卵于體外進(jìn)行培育的條件為溫度37.5°C下于10%的CO2條件下培養(yǎng)60小時(shí)。
[0020]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中所述的受精卵分裂成四個(gè)或八個(gè)細(xì)胞。
[0021]前述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法,其中進(jìn)一步包括使用熒光蛋白基因的慢病毒載體對(duì)受精卵進(jìn)行顯微注射的步驟。
[0022]借由上述技術(shù)方案,本發(fā)明種轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法的主要內(nèi)容如下:
[0023]本發(fā)明的方法包括以下步驟:
[0024](I)供卵鼠的制備;
[0025](2)假孕鼠的制備;
[0026](3)供卵鼠取卵;
[0027](4)受精卵體外培育;
[0028](5)受精卵回輸;
[0029](6)代孕鼠飼養(yǎng)。
[0030]選擇動(dòng)情周期第二天的雌性倉(cāng)鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)40IU,注射PMSG72h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG) 40IU,并與正常雄鼠合籠一天。
[0031]將動(dòng)情周期第一天即發(fā)情期的正常雌鼠與結(jié)扎雄鼠合籠。
[0032]取出的受精卵在倉(cāng)鼠專(zhuān)用培養(yǎng)基中培育。
[0033]經(jīng)由上述可知,本發(fā)明轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠及其制備方法至少具有下列優(yōu)點(diǎn):
[0034](I)優(yōu)化了倉(cāng)鼠受精卵體外培養(yǎng)條件,解決了倉(cāng)鼠受精卵的“雙細(xì)胞阻滯”問(wèn)題;
[0035](2)建立了倉(cāng)鼠受精卵回輸方法,成功獲得了由代孕母?jìng)}鼠出生的體外培養(yǎng)受精卵生成的倉(cāng)鼠后代;
[0036](3)應(yīng)用表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體進(jìn)行倉(cāng)鼠受精卵的透明帶注射,制備成功了國(guó)內(nèi)外第一批轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠。
[0037]轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的成功制備意味著人類(lèi)從此可以制備基因修飾的倉(cāng)鼠模型,從而開(kāi)辟一個(gè)以轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠作為更精確模擬人類(lèi)疾病模型的新領(lǐng)域。
[0038]綜上所述,本發(fā)明特殊的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,解決了倉(cāng)鼠受精卵的“雙細(xì)胞阻滯”問(wèn)題,其具有上述諸多的優(yōu)點(diǎn)及實(shí)用價(jià)值,并在同類(lèi)方法中未見(jiàn)有類(lèi)似的設(shè)計(jì)公開(kāi)發(fā)表或使用而確屬創(chuàng)新,其不論在工藝上或功能上皆有較大的改進(jìn),在技術(shù)上有較大的進(jìn)步,并產(chǎn)生了好用及實(shí)用的效果,從而更加適于實(shí)用,而具有產(chǎn)業(yè)的廣泛利用價(jià)值,誠(chéng)為一新穎、進(jìn)步、實(shí)用的新設(shè)計(jì)。
[0039]上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段,并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施,以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1顯示的是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠培育過(guò)程突破受精卵二細(xì)胞阻滯,正常受精卵在體外培養(yǎng)條件下發(fā)育成了四細(xì)胞(I)和八細(xì)胞(II)胚胎,這些受精卵回輸給代孕乳母后順利產(chǎn)出了幼崽(III)。
[0041]圖2顯示的是應(yīng)用本發(fā)明技術(shù),制備成功了表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠。圖
2(a)是本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的鑒定結(jié)果;圖2 (b)是本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠中熒光蛋白的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042]請(qǐng)參考圖1,本發(fā)明提出一種轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠制備方法,在嘗試了 HCM (倉(cāng)鼠卵細(xì)胞培養(yǎng)基)1-10號(hào)培養(yǎng)基均不能解決雙細(xì)胞阻滯問(wèn)題后,我們開(kāi)始了系統(tǒng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化方法的篩選。在改變HECM-10培養(yǎng)基的鈣離子濃度、改變培養(yǎng)溫度、選擇動(dòng)情期受精卵等多種條件后,最后確定了以下條件:
[0043](I)鈣離子濃度為1.5mM的HECM培養(yǎng)液;(2)39°C的受精卵培養(yǎng)溫度;(3)在動(dòng)情周期第三天交配后收集的受精卵,以這種條件培養(yǎng)的受精卵有35%在72小時(shí)后發(fā)育成四細(xì)胞團(tuán),并有20%在96小時(shí)發(fā)育成8細(xì)胞團(tuán)。
[0044]將四細(xì)胞和八細(xì)胞團(tuán)分別回輸給假孕代乳母?jìng)}鼠,8只倉(cāng)鼠中有3只順利懷孕足月,于18天后分別產(chǎn)下了 4、4、8只倉(cāng)鼠后代,并順利發(fā)育成熟。
[0045]我們隨后以表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒基因載體,進(jìn)行了倉(cāng)鼠受精卵透明帶下注射,以滴度IXlO9慢病毒載體注射的受精卵,可以在體外培養(yǎng)到八細(xì)胞以上。注射慢病毒的受精卵回輸后,共得到3窩17只新生小鼠,其中4只在哺乳期死亡。發(fā)育成熟的13只倉(cāng)鼠經(jīng)基因型鑒定,共得到11只陽(yáng)性小鼠。
[0046]如圖2所示,在動(dòng)物熒光觀察盒中對(duì)部分倉(cāng)鼠進(jìn)行觀察,可見(jiàn)H9、H15、H17、H19均有綠色熒光蛋白表達(dá),其中H9號(hào)倉(cāng)鼠有較強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)水平。圖2 (a)顯示的是綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠基因型鑒定的結(jié)果,圖中,H1-H3顯示的是I月13日出生的,H7-H10顯示的是I月20日出生的,H11-H19是2月3日出生的,M+是GFP陽(yáng)性小鼠,M-是GFP陰性小鼠,H-是普通倉(cāng)鼠。
[0047]實(shí)施例
[0048]1.動(dòng)物模型倉(cāng)鼠在濕度50-60%、溫度22_24°C的SPF (無(wú)特定病原體)級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng),光照周期為7:00-19:00光照、19:00-7:00黑暗。
[0049]2.確定雌鼠動(dòng)情周期:雌性倉(cāng)鼠8周齡型成熟并出現(xiàn)穩(wěn)定的動(dòng)情周期,動(dòng)情周期為4天,動(dòng)情周期的第一天為發(fā)情期,第二天陰道口會(huì)出現(xiàn)明顯的白色粘稠的分泌物,是動(dòng)情周期的標(biāo)志。
[0050]3.超數(shù)排卵的供卵鼠選擇:在超排時(shí)間和動(dòng)情周期吻合時(shí),選擇體重在130-150克間,年齡在91-150日齡的雌性倉(cāng)鼠。
[0051]4.供卵鼠超數(shù)排卵:轉(zhuǎn)基因制備過(guò)程第一天,選擇動(dòng)情周期中第二天的雌性倉(cāng)鼠在11:00-12:00時(shí)腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG) 40IU,在注射孕馬血清促性腺激素72小時(shí)后,腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)40IU,與正常雄鼠合籠一天后并對(duì)雌鼠進(jìn)行陰道涂片,出現(xiàn)精子表明交配成功,作為供卵鼠。
[0052]5.假孕代乳母鼠的準(zhǔn)備:制備轉(zhuǎn)基因過(guò)程的第三天的19:00-21:00,將動(dòng)情周期第一天的正常雌鼠與已正常飼養(yǎng)4周的6周齡結(jié)扎雄鼠合籠,交配過(guò)程中有10次以上交配動(dòng)作,雌鼠假孕誘導(dǎo)成功,可以作為代孕鼠。
[0053]6.受精卵體外培養(yǎng)基的制備:上午8:00,取優(yōu)化的倉(cāng)鼠胚胎培養(yǎng)基(hamsterembryo culture medium-Liu, HECM-1O-Liu) 100 μ I/ 滴,覆蓋石臘油,置于培養(yǎng)箱中,用于受精卵培養(yǎng)。加熱塊上39°C預(yù)熱M2培養(yǎng)基及HECM-1O-Liu培養(yǎng)基,用于取卵操作。其中的M2培養(yǎng)基采用的是Sigma公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基,具體成份(克/升)如表I所示。
[0054]表I
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其主要包括如下步驟: 收集單個(gè)受精卵; 將受精卵于體外進(jìn)行培育; 在受精卵分裂成2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞后,送入倉(cāng)鼠體內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行培育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的受精卵是倉(cāng)鼠動(dòng)情周期第三天交配后獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的將受精卵于體外進(jìn)行培育的培養(yǎng)液中鈣離子濃度為1.5mM,培養(yǎng)溫度為39°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的培養(yǎng)液為HECM-1O培養(yǎng)基,其各組分的濃度配方如下: 倉(cāng)鼠專(zhuān)用培養(yǎng)基HECM-10培養(yǎng)基配方如下,
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的培養(yǎng)液于4攝氏度下保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的培養(yǎng)液中的氨基酸配制成濃縮100倍的儲(chǔ)備液,培養(yǎng)液中的其它成分直接配制。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的儲(chǔ)備液于-4°C下保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中將受精卵于體外進(jìn)行培育的條件為溫度37.5°C下于10%的CO2條件下培養(yǎng)60小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中所述的受精卵分裂成四個(gè)或八個(gè)細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因倉(cāng)鼠的制備方法,其中進(jìn)一步包括使用熒光蛋白基因 的慢病毒載體對(duì)受精卵進(jìn)行顯微注射的步驟。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103451149SQ201310169704
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月9日
【發(fā)明者】劉國(guó)慶 申請(qǐng)人:劉國(guó)慶