專利名稱：一種耐高溫殼聚糖酶酵母工程菌及其耐高溫殼聚糖酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐高溫殼聚糖酶酵母基因工程菌的構(gòu)建及其生產(chǎn)耐高溫殼聚糖 酶的方法。屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖酶(Chit0SanaSe，EC. 3. 2. 1. 132)是降解殼聚糖的專一性酶，廣泛存在于多 種微生物中，目前在細菌(Bacillus、Enterobacter、Myxobacter)、放線菌(Str印tomyces、 Nocardioides)、真 菌(Penicillium、Aspergillus、Rhizopus、Basidiomyce)、病 毒 (Chlorella virus PBCV_1、CVK_2)及植物的組織中均發(fā)現(xiàn)殼聚糖酶，但主要存在于細菌和真菌中。近年來國內(nèi)關(guān)于殼聚糖酶的研究主要集中在菌株的篩選、菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化以 及酶學性質(zhì)和分離純化等方面。在現(xiàn)有的商品化殼聚糖酶中，由于原始的菌株產(chǎn)酶能力低， 純化率和得率都不高，所以導致成品酶的產(chǎn)量有限且售價高。要實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)高 酶活的殼聚糖酶，除了篩選高酶活的菌株外，還可通過分子生物學手段對現(xiàn)有的殼聚糖酶 基因進行誘變改造，實現(xiàn)其高水平的表達?，F(xiàn)在商品化的殼聚糖酶在熱穩(wěn)定性等方面仍不足以適應(yīng)工業(yè)化的要求，例如在許 多工業(yè)應(yīng)用中，常是在高溫條件下使用殼聚糖酶，這就對殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性提出較高的 要求，但很多殼聚糖酶在溫度超過40°C時，酶活降低很快。因此，迫切需要研制出一種廉價、 高效、耐高溫的殼聚糖酶來解決工業(yè)的發(fā)展需求和現(xiàn)有的殼聚糖酶熱穩(wěn)定性之間的矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種運用基因工程手段尋找偏愛密碼改變的耐高溫殼聚糖 酶基因，使其適合在畢赤酵母中高效穩(wěn)定的表達，及制備該耐高溫殼聚糖酶的方法。一、耐高溫殼聚糖酶基因的合成GenBank accession number AY1903M所示的殼聚糖酶的氨基酸序列中，存在一 個N糖基化位點，和多個氧糖基化位點。畢赤酵母作為真核表達系統(tǒng)，具有糖基化翻譯后修 飾功能，可使蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性得到提高。在氨基酸序列的不改變的前據(jù)下，對原始殼聚 糖酶的核苷酸序利用DNAW0RKS工具進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的基因全部由畢赤酵母偏愛密碼 組成。優(yōu)化后的核酸序列hbcsn與原始csn序列(GenBank accession number AY190324) 相比，有147個核苷酸發(fā)生了變化，核苷酸的同源性為77%，同時為了使殼聚糖酶在畢赤酵 母中能夠高效穩(wěn)定的分泌表達，優(yōu)化后的殼聚糖酶基因少了編碼5’端信號肽序列的17個 氨基酸。然后根據(jù)優(yōu)化后的序列設(shè)計引物，利用套疊PCR的方法合成該基因。設(shè)計的引物 長度為48-5^p，相鄰兩引物之間有20bp左右的重疊序列，Tm值為58-62°C，所有的引物均 在invitrogen公司合成。將所有的引物加入反應(yīng)體系中，進行PCR擴增。PCR擴增的條件 為98°C 30s, 58°C 30s 72°C lmin，共 25 個循環(huán)，最后 72°C 7min。050U二 一 二 二 二 二…二 二二二二 三二 - 二 Ξ二 二 二 二 。寸9 LLLoxluBvgwIaaLvaLVCJvoaLVoowislvomDVowoovwoaLLUol03寸csoqqI—(SJj33y33DK}LLOUXV30m}wc:§33vnLLLo§§3w8v3vomnL 0 Cwo一二 Ξ二 三Il 二 一一 一一 二 二二一一二 ΞΙΙ 二 二 二三三S?！臁靤§13w3:mLwmo§lox3001vmLovmvyvDolv390 § Cwo三二二一二一 I Ξ 二 二 二 二 三三三三 二二二 Ξ二 一一 § LLW§vllv3vllw31093WSJlxovsmxLVXXomc)xlv33w30iv§sgusoqll τ—I寸 iv3vaL0v3XO0wau0w:mLaL3v3DVSV8vws￡0§101vx333:}v3 scoCwo三 二 二 二Ξ 三二 三二 =--三二 三===二 二 二 09COSBW3v330WEovw:nDlxvaLVOW8wmLLLmLLc5m§ivo οΓΟ§φ Ι2ε aLVCJwyovoosvimDJLVCmLUowowoliOVooaLCJwaLmxIOSoCN62 §二二 二 …一 Ξ 二 二 三三二 Ξ 二 一-三Zr二 二三 二οοε LLVlw!301VOQ!lDvaDluv§luowoWLLaLvamowuxDDIDW￥o55csl§3qq 62 3999vomOmOVo。wo3iD91owamxxnL3w3w:O9§3voDOX3vo0 us。=二 二 二 二 三二 ΞΞ二 = 二 二…三 二 二 二 二 二 。寸 2 109w3§IaLvoaLVo3wloimLowl8IDOV3x3w〕wl30voaLVoloLLVoIsusoqq1-4 Llv。mLVJLW8vm達woammL3slLLlvyJL§:mlvc_)vo§ 0 i三三二 二 二三二 二 二 二 =三二三三二 二 = 二 = 081—ιS一§2swv。5moowmu3mLuvaLLUV130mmuvs§ 3UJJG UI SSLL9vaLU319w§wyvmLV3mLW33vaLL§ww§x:m3 3 §|三|| 三三二 二三ΞΞΞIz三二 二 二 二 二 二 02 1013vmmlDlc)wlo9waDLmLVo§3wlDV3LLV§wx:nLD3s 19 usoqq Ι—ι03。J2alwwswovovwuvimDSV:}￥mLDWovmmu_viCV3S §三三二三三二 = 二三=二 二三二三三--二 = 090vmLLOLWVi8wiv39_v8vlllvw39w9mw0w:mvsw0vi Ssoqq〔6000U月聆懶潞幽) go Sw goi ^^Ml^is^i 〔800s 陔 卜/2iFs^< 69ε 9022 Zo
權(quán)利要求
1. 一種耐高溫殼聚糖酶的基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如下tacaacctacccaacaatttgaagcaaatttacgataagcataagggtaaatgttctaag60gtccttgctaagggattcactaacggtgatgcttctcaaggtaagtctttttcttactgt120ggagatattcctggtgctattttcatttcttcttcaaaaggttacacaaacatggatatt180gattgtgatggagctaacaactcagctggtaagtgcgctaacgatccatctggtcaaggt240gaaactgcttttaagtctgatgttaagaagtttggtatttctgacttggatgctaatatt300catccatacgttgtttttggtaacgaagatcattctccaaagtttaagccacaatctcat360ggtatgcaaccattgtctgttatggctgtagtttgtaacggtcaattacattacggaatt420tggggtgatactaatggtggtgtttctactggtgaggcatcaatttccttggctgatttg480tgttttccaaacgaacacttagatggtaaccatggacatgatcctaacgaCgttttgttt540attggtttcacttcaaaggatgctgttccaggtgctactgccaagtggaaggctaagaac600gctaaggaattcgaagattctataaagtctattggtgacaagttggttgctggtttgaag660gcttaa666 ο
2.一種耐高溫殼聚糖酶酵母工程菌(is 115/HBCSN，簡稱為HBCSN，其保藏號為CCTCC No :M 2010206。
3.一種耐高溫殼聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征在于搖瓶生產(chǎn)步驟為將基因工程菌HBCSN接單菌落到BMGY培養(yǎng)基中，在-30°C培養(yǎng)46-48小時，離心， 再把菌體轉(zhuǎn)入到BMMY中，進行誘導表達，每M小時向培養(yǎng)基中加入100%甲醇至甲醇的終 濃度為1 %，誘導六天，離心發(fā)酵液，上清液即為含有耐高溫殼聚糖酶的粗酶液。
4.一種耐高溫殼聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵罐生產(chǎn)步驟為1)、種子培養(yǎng)基的制備為將基因工程菌HBCSN接單菌落到BMGY培養(yǎng)基中，在 28 0C -30°C 培養(yǎng) 46-48 小時；2)、接種按5%(種子培養(yǎng)基的體積/發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基的體積)的比例把種子培 養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的初始培養(yǎng)基為BMGY ；3)、第一階段為菌體生長階段，發(fā)酵參數(shù)為溫度^°C，pH5.8，通風量為0. 5vvm,攪拌 速度250-700轉(zhuǎn)/分，溶氧量30%，自接種開始10-14小時后，發(fā)酵罐中的甘油被消耗盡，此 時流加50%甘油(W/V)混合物，當菌體密度OD6tltl = 300-320時停加甘油混合物，準備轉(zhuǎn)入 第二階段，50%甘油(W/V)混合物成分為每升50%甘油混合物中含有12mLPTMl微量元素 混合物；PTMl微量元素混合物組分為五水硫酸銅6. 0，碘化鈉0. 08, 一水硫酸錳3. 0, 二水 鉬酸鈉0. 2，硼酸0. 02，氯化鈷0. 5，氯化鋅20，七水硫酸亞鐵65，生物素0. 2，濃硫酸9. 2，以 上單位均為g/L ；4)第二階段為誘導階段，發(fā)酵參數(shù)為溫度25°C，pH5.5，通風量為0.5vvm，攪拌速度 680-700轉(zhuǎn)/分，溶氧量30%，當停加甘油混合物后，流加甲醇混合物(即每升甲醇中含有 12mL PTM1)進行誘導，誘導144-146小時左右；5)離心去除菌體，上清液即為含有耐高溫殼聚糖酶的粗酶液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種編碼重組的耐高溫殼聚糖酶的畢赤酵母基因工程菌株Gs115/HBCSN及其生產(chǎn)耐高溫殼聚糖酶的方法。本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，對原始的Aspergillus fumigatus的殼聚糖酶基因(GenBankTM accession number AY190324)進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的核酸序列與原始核酸序列的同源性為77％。本發(fā)明中重組的畢赤酵母生產(chǎn)的殼聚糖酶以可溶的形式分泌到胞外，表達量高達3mg/mL，酶活可達25000U/mL。該殼聚糖酶在畢赤酵母中糖基化修飾后具有極好的耐熱性，具體表現(xiàn)為在80℃處理120min，90℃處理40min，100℃處理20min后各自的殘余活性分別為56％，87％，87％。本發(fā)明提供的耐高溫殼聚糖酶特別適合大規(guī)模工業(yè)化降解殼聚糖，減少環(huán)境污染。
文檔編號C12N15/56GK102051369SQ20101050742
公開日2011年5月11日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者余曉嵐, 陳小梅, 馬立新 申請人:湖北大學